Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Com este método, podemos estimar a degeneração dos axônios, bem como a desmielinização nos nervos periféricos de modelos de neurodegeneração em camundongos. A principal vantagem dessa técnica é que esse método minimamente invasivo é viável para medições repetidas, apenas uma não acompanhou os múltiplos nervos nos mesmos animais. A sensibilidade deste método permite a detecção precoce da perda de axônios na modulação, mesmo antes que mais defeitos notáveis possam ser registrados, permitindo assim a detecção precoce desses defeitos.

Para iniciar este procedimento, anestesie o camundongo com inalação de oxigênio de isoflurano. Confirme a anestesia adequada aplicando uma leve pressão na almofada de caminhada do membro posterior para verificar a ausência de reflexo de retirada da dor. Em seguida, coloque um cone de nariz no rosto do animal para manter a anestesia.

Certifique-se de que o cone do nariz não bloqueie as vias aéreas e que o animal esteja respirando de forma constante. Em seguida, mantenha a temperatura corporal do animal em 37 graus Celsius usando uma placa de aquecimento termostático. Para medir o CMAP no membro posterior, posicione o mouse na posição prona.

Estenda o membro posterior e prenda a pata na superfície de trabalho usando fita adesiva. Em seguida, coloque cinco milímetros dos eletrodos estimuladores de calibre 27 por via subcutânea em ambos os lados do nariz ciático sem perfurar os músculos subjacentes com dois centímetros entre os eletrodos. Da mesma forma, coloque o eletrodo de registro subcutaneamente acima e paralelo ao músculo gastrocnêmio.

Em seguida, coloque o eletrodo de referência por via subcutânea próximo ao tendão de Aquiles em um ângulo de 30 graus e deixe de dois a cinco milímetros da agulha sob a pele. Coloque o eletrodo de aterramento por via subcutânea na lateral do mouse de maneira semelhante aos eletrodos de estimulação. Para medir o CMAP nos membros anteriores, posicione o mouse na almofada do cabeçalho na posição supina e use fita adesiva para estender os dois membros anteriores nas laterais do corpo.

Em seguida, coloque cinco milímetros do eletrodo estimulante por via subcutânea, sem perfurar os músculos subjacentes em ambos os lados do membro anterior para alinhar com o nervo do plexo braquial. Em seguida, coloque o eletrodo de registro por via subcutânea acima do músculo bíceps braquial. Em seguida, coloque três milímetros do eletrodo de referência em um ângulo de 30 graus nas almofadas de caminhada e insira o eletrodo de aterramento por via subcutânea na lateral do mouse.

Os eletrodos estão próximos uns dos outros nesta configuração. Evite que os eletrodos se toquem, pois isso distorce a gravação. Estimule todos os axônios usando um pulso por segundo com duração de estímulo de 0,1 milissegundos.

Para adquirir dados, inicie a estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente na unidade controladora e gire o botão do controlador de intensidade para aumentar o estímulo. Para atingir estímulos supermáximos, aplique estímulos crescentes girando o botão do controlador de intensidade até que a amplitude da resposta CMAP pare de aumentar. A partir daí, aumente ainda mais o estímulo em 20%para garantir que a amplitude CMAP tenha atingido sua resposta máxima.

Termine a estimulação pressionando o botão de estímulo recorrente novamente. Use a ferramenta de marcador para indicar os seguintes pontos na gravação. Início da resposta, pico positivo máximo e pico negativo máximo.

O início do estímulo é determinado automaticamente pelo software. Determine a latência como um atraso entre o início do estímulo e o início da resposta. Use a latência para avaliar a desmielinização nos axônios.

Meça a amplitude do pico máximo negativo ao máximo positivo e use a magnitude da amplitude para correlacionar o número de axônios funcionais. Como o posicionamento exato dos eletrodos pode afetar o valor do resultado da gravação, substitua os eletrodos e meça o mesmo nervo por três vezes usando estímulo supermáximo para garantir que a maior resposta seja obtida. Use a média das gravações.

Após as medições, remova todos os eletrodos e deixe o mouse se recuperar na placa de aquecimento ou sob uma lâmpada infravermelha por aproximadamente dois a cinco minutos até recuperar a consciência suficiente. Não deixe o rato sozinho e na companhia de outros ratinhos até que tenha recuperado totalmente da anestesia. Os camundongos C61 PMP22 que expressam três a quatro cópias do PMP22 humano e camundongos heterozigotos recapitulam um fenótipo de doença CMT1A muito leve com desmielinização leve e CMAPs reduzidos, mas sem fenótipo visível.

Em camundongos transgênicos C61 PMP22 de um ano e meio a dois anos de idade, as amplitudes do CMAP são reduzidas e as latências são prolongadas tanto nos membros posteriores quanto nos membros anteriores. A amplitude foi diminuída tanto nos membros posteriores quanto nos anteriores em camundongos transgênicos, e a latência foi prolongada em todos os membros em camundongos transgênicos CMT, e até mesmo mudanças sutis nos membros anteriores foram detectadas com essa medição. A necessidade de intensidade do estímulo foi aumentada em camundongos C61 PMP22, o que se assemelha ao fenótipo detectado em pacientes com CMT1A.

Uma vez dominado, a gravação CMAP pode ser feita para membros posteriores e anteriores em 15 minutos, quando executada corretamente. A técnica apresentada oferece novas possibilidades de caracterização de modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica e doença de Charcot-Marie-Tooth. A avaliação da funcionalidade do axônio nervoso fornece informações detalhadas sobre a progressão dos distúrbios neuromusculares.

Gravações semelhantes são usadas em ambientes clínicos, enfatizando o potencial translacional desse método.