Investigar as representações do objeto no fluxo Dorsal de Visual de Macaque usando gravações unitárias

Summary

É apresentado um protocolo detalhado para analisar a seletividade de objeto de parieto-frontal neurônios envolvidos nas transformações visuomotoras.

Abstract

Estudos anteriores mostraram que os neurônios em áreas parieto-frontal do cérebro do macaco podem ser altamente seletivos para objetos do mundo real, superfícies curvas definidas pelo disparidade e imagens de objetos do mundo real (com e sem disparidade) em uma maneira similar como descrito no fluxo ventral visual. Além disso, áreas parieto-frontal são acreditadas para converter informações de objeto visual em saídas de motor adequadas, tais como o pré-moldar da mão durante a preensão. Para melhor caracterizar a seletividade de objeto na rede cortical envolvida nas transformações visuomotoras, nós fornecemos uma bateria de testes destinados a analisar a seletividade de objeto visual de neurônios em regiões parieto-frontal.

Introduction

Primatas humanos e não humanos compartilham a capacidade de realizar ações complexas motor, incluindo o objeto agarrando. Para com êxito executar essas tarefas, nosso cérebro precisa para completar a transformação das propriedades do objeto intrínseco em comandos de motor. Essa transformação depende de uma sofisticada rede de áreas corticais dorsais localizado no parietal e ventral cortéx pré-motor^1,2,3 (Figura 1).

De estudos de lesão em macacos e humanos^4,5, sabemos que o fluxo visual dorsal - originárias do córtex visual primário e direcionada para o córtex parietal posterior - está envolvido na visão espacial e o planejamento do motor ações. No entanto, a maioria das áreas de fluxo dorsal não é dedicada a um único tipo de processamento. Por exemplo, a área intraparietal anterior (AIP), dentre as áreas de estágio final no fluxo dorsal visual, contém uma variedade de neurônios que disparam não só durante a preensão de^7,6,8, mas também durante o visual inspeção do objeto^7,8,9,10.

Semelhante ao AIP, neurônios na área F5, localizado no córtex cortéx ventral (PMv), também respondem durante a fixação visual e o objeto agarrando, que é provável que seja importante para a transformação da informação visual em ações motor¹¹. A porção anterior da região (subsector F5a) contém neurônios responder seletivamente a tridimensional (3D, disparidade definida) imagens de^12,13, enquanto o subsector localizado da convexidade (F5c) contém neurônios caracteriza-se pelo espelho propriedades^1,3, disparando tanto quando um animal realiza ou observa uma ação. Finalmente, a região posterior do F5 (F5p) é um campo relacionado a mão, com uma alta proporção de visuomotoras neurônios responsivos à observação tanto e preensão de objetos 3D^14,15. Ao lado de F5, área 45B, localizado no ramo inferior do sulco arqueado, também podem estar envolvidos em forma processamento^16,17 e¹⁸de preensão.

Testes de seletividade de objeto no córtex frontal e parietal é um desafio, porque é difícil determinar o que caracteriza estes neurônios respondem e quais são os campos receptivos destes neurônios. Por exemplo, se um neurônio responde a uma placa, mas não para um cone, cuja característica desses objetos está dirigindo esta seletividade: o contorno 2D, a estrutura 3D, a orientação em profundidade ou uma combinação de muitas características diferentes? Para determinar as características do objeto de crítica para os neurônios que respondem durante a fixação do objeto e de agarramento, é necessário empregar vários testes visuais usando versões reduzidas das mesmas imagens e imagens de objetos.

Uma fração considerável dos neurônios no AIP e F5 não só responde à apresentação visual de um objeto, mas também quando o animal apreende este objeto no escuro (ou seja, na ausência de informação visual). Tais neurônios podem não responder a uma imagem de um objeto que não pode ser aproveitada. Daí, visuais e motor componentes da resposta estão intimamente ligados, que torna difícil investigar a representação do objeto neuronal nestas regiões. Desde que os neurônios visuomotoras somente podem ser testados com objetos do mundo real, precisamos de um sistema flexível para apresentar diferentes objetos em diferentes posições no campo visual e às diferentes orientações se queremos determinar quais recursos são importantes para estes neurônios. Este último só pode ser alcançado por meio de um robô capaz de apresentar objetos diferentes em locais diferentes no espaço visual.

Este artigo pretende fornecer um guia experimental para pesquisadores interessados no estudo dos neurônios parieto-frontal. Nas seções seguintes, nós forneceremos o protocolo geral utilizado em nosso laboratório para a análise das respostas de preensão e visual objeto em macacos acordado (Macaca mulatta).

Protocol

Todos os procedimentos técnicos foram realizados de acordo com guia do Instituto Nacional de saúde para o cuidado e a utilização de animais de laboratório e a UE Directiva 2010/63/UE e foram aprovados pelo Comitê ético de KU Leuven.

1. general métodos para gravações extracelulares em macacos se comportando acordado

1. Treine os animais para executar as tarefas visuais e motoras necessárias para resolver sua questão de investigação específicos. Certifique-se de que o animal é capaz de forma flexível, alternar entre tarefas durante a mesma sessão de gravação, a fim de testar o neurônio extensivamente e obter uma melhor compreensão das características de condução a resposta neural (Figura 2-3).
   1. Treinar o animal em Visually-Guided agarramento (VGG; agarrando 'na luz') para avaliar os componentes visuomotoras da resposta. Nota: independentemente da tarefa escolhida, gradualmente restringir a ingestão de líquidos pelo menos três dias antes do início da fase de treinamento.
      1. Conter a cabeça do macaco para toda a duração da sessão experimental.
      2. Nas primeiras sessões, segurar a mão contralateral à câmara de gravação na posição de repouso e ajudar o animal a alcançar e agarrar o objeto, dando recompensa manual após cada tentativa.
      3. Lugar para voltar a mão do macaco na posição de descanso no final de cada julgamento.
      4. Todos os vários julgamentos, soltar a mão do macaco e aguarde alguns segundos para observar se o animal inicia o movimento espontaneamente.
      5. Aplica o manual recompensa sempre que o macaco chega para o objeto.
      6. Quando a fase atingindo é adquirida corretamente, ajude o animal a levantar (ou puxar) o objeto e recompensa manualmente.
      7. Como em 1.1.1.4 e 1.1.1.5, lançar mão do macaco e aguarde alguns segundos para observar se o animal inicia o movimento espontaneamente. Recompensar-se sempre que o movimento é realizado corretamente.
      8. Corrigir o atingindo, mão posição e orientação de pulso quantas vezes for necessário durante o procedimento.
      9. Repita os passos acima até que o animal executa a sequência automaticamente.
      10. Carrega a tarefa automática. O animal obtém automaticamente recompensado, quando ele executa os movimentos de alcance e compreensão para um tempo predeterminado.
      11. Gradualmente aumente o tempo de exploração do objeto.
      12. Introduza o laser que projeta o ponto de fixação na base do objeto. Adicione então o tracker do olho para monitorar a posição de olho em torno do objeto-para-ser-compreendeu.
   2. Treine o animal em Memory-Guided agarramento (MGG) para investigar o componente motor da resposta, não afetado pelo componente visual do estímulo.
      1. Segurar a cabeça do macaco.
      2. Siga os mesmos passos descritos para o VGG, certificando-se de que o animal mantém a fixação do laser durante a tarefa dentro de uma janela definida por via electrónica. Para esta versão da tarefa, a luz se apaga no final do período de fixação.
   3. Treine o macaco na fixação passiva para abordar a resposta visual e seletividade de forma.
      1. Segurar a cabeça do macaco.
      2. Apresente os estímulos visuais para o macaco usando um CRT (fixação passiva de estímulos 3D) ou um monitor de LCD (fixação passiva de estímulos 2D).
      3. Apresente um ponto de fixação no centro da tela, sobreposto os estímulos visuais.
      4. Recompensar o animal após cada apresentação do estímulo e aumentar gradualmente o período de fixação até atingir os padrões da tarefa.
2. Realizar a cirurgia, usando vestidos, cortinas e ferramentas estéril.
   1. Anestesiar o animal com cetamina (15 mg/kg, por via intramuscular) e cloridrato de medetomidina (0,01-0,04 mL/kg por via intramuscular) e confirmar a anestesia regularmente, verificando a resposta do animal a estímulos, frequência cardíaca, o ritmo respiratório e o sangue pressão.
   2. Manter a anestesia geral (propofol 10 mg/kg/h por via intravenosa) e administrar oxigênio com um tubo endotraqueal. Use uma pomada lanolim-baseado para evitar ressecamento do olho enquanto sob anestesia.
   3. Proporcionar analgesia usando 0,5 cc de buprenorfina (0,3 mg/ml por via intravenosa). Em caso de aumento da frequência cardíaca durante a cirurgia, pode ser administrada uma dose extra.
   4. Implante um post cabeça de MRI compatível com parafusos de cerâmicos e acrílica dental. Realize todas as cirurgias de sobrevivência em condições assépticas rigorosas. Para uma manutenção adequada do campo estéril, use luvas estéreis descartáveis, máscaras e instrumentos esterilizados.
   5. Guiado por ressonância magnética anatômica (RM; Coordenadas de Horsley-Clark), fazer uma craniotomia acima da área de interesse e a câmara de gravação no crânio do macaco do implante. Use uma câmara de gravação padrão para gravações extracelular única unidade ou um microdrive multielectrode, para a gravação simultânea de vários neurônios.
   6. Após a cirurgia, descontinuar a administração intravenosa de propofol até espontânea respirando currículos. Não abandone o animal até que ele recuperou a consciência e apresentar o animal no grupo social somente após a completa recuperação.
   7. Proporcionar analgesia pós-operatória, tal como recomendado pelo veterinário institucional; por exemplo usar Meloxicam (5mg/ml por via intramuscular).
   8. Espere 6 semanas após a cirurgia antes de iniciar o experimento. Isto permite uma melhor fixação do post principal para o crânio e garantias de que o animal se recuperou totalmente da intervenção.
3. Localizar a área de gravação usando ressonância magnética (para gravações extracelular de unidade única) e a tomografia computadorizada (CT; para gravações multielectrode).
   1. Encha de capilares de vidro com uma solução de sulfato de cobre 2% e inseri-los em uma grade de gravação.
   2. Realizar a ressonância magnética (corte espessura: 0,6 mm).
4. Monitoramento da atividade neural.
   1. Uso de microeletrodos de tungstênio com uma impedância de 0,8 – 1 MΩ.
   2. Inserir o eletrodo através da dura-máter usando um tubo de guia de aço inoxidável de 23G e um microdrive hidráulico.
   3. Para a discriminação de spike, amplificar e filtrar a atividade neural entre 300 e 5.000 Hz.
   4. Para gravações de (LFP) potenciais de campo local, amplificar e filtrar o sinal entre 1 e 170 Hz.
5. Monitorar o sinal de olho
   1. Ajuste uma câmera infravermelha diante dos olhos do animal para obter uma imagem adequada da pupila e do reflexo corneal.
   2. Use uma câmera baseada em infravermelho para experimentar a posição de aluno a 500 Hz.

2. investigar o objeto seletividade áreas dorsais

1. Realize a preensão visualmente guiadas (VGG).
   1. Escolha o direito de agarrar a instalação dependendo do objetivo da pesquisa: carrossel instalação ou configuração de robô (Figura 3).
   2. Para a instalação do carrossel, execute a tarefa VGG:
      1. Deixe o macaco Coloque a mão contralateral no hemisfério gravado na posição de descanso na escuridão completa para iniciar a sequência.
      2. Depois de um tempo variável (intertrial intervalo: 2.000-3.000 ms), aplicar um laser vermelho (ponto de fixação) na base do objeto (distância: 28 cm dos olhos dos macacos). Se o animal mantém seu olhar dentro de uma janela de fixação eletronicamente definida (+ /-2,5 °) para 500 ms, ilumine o objeto de cima com uma fonte de luz.
      3. Após um atraso variável (300-1500 ms), programar um escurecimento do laser (indicação visual de GO) instruindo o macaco para levantar a mão da posição de repouso e alcançar, agarrar e segurar o objeto para um intervalo variável (tempo de armazenagem: 300-900 ms).
      4. Sempre que o animal realiza toda a sequência corretamente, recompensá-lo com uma gota de suco.
   3. Use uma sequência semelhante de tarefa para a instalação do robô.
      1. Quanto à configuração do carrossel, deixe o macaco Coloque a mão contralateral no hemisfério gravado na posição de descanso na escuridão completa para iniciar a sequência.
      2. Depois de um tempo variável (intertrial intervalo: 2.000-3.000 ms), acender o LED (ponto de fixação) do objeto (de dentro; distância: 28 cm dos olhos dos macacos). Novamente, se o animal mantém seu olhar dentro de uma janela de fixação eletronicamente definida (+ /-2,5 °) para 500 ms, ilumine o objeto de dentro com uma fonte de luz branca.
      3. Após um atraso variável (300-1500 ms), desligar o LED (indicação visual de GO), instruindo o macaco para levantar a mão da posição de repouso e alcançar, agarrar e segurar o objeto para um intervalo variável (tempo de armazenagem: 300-900 ms).
      4. Sempre que o animal realiza toda a sequência corretamente, recompensá-lo com uma gota de suco.
   4. Durante a tarefa, quantificar o desempenho do macaco, com especial atenção para o calendário. Medida tanto que o tempo decorrido entre o sinal de ir e o início do movimento da mão (tempo de reação) e entre o início do movimento e o elevador do objeto (tempo de agarrar).
2. Realizar a preensão guiada por memória (MGG; 'Agarrando no escuro'). Use a tarefa MGG para determinar se os neurônios estão visuomotoras ou motor-dominante.
   Nota: A sequência é semelhante ao descrito para o VGG, mas o objeto é aproveitado na escuridão total.
   1. Idêntica à tarefa de VGG, deixe o macaco Coloque a mão contralateral no hemisfério gravado na posição de descanso na escuridão completa para iniciar a sequência.
   2. Depois de um tempo variável (intertrial intervalo: 2.000-3.000 ms), aplicar um laser/LED vermelho (ponto de fixação) para indicar o ponto de fixação (na base do objeto para configuração do carrossel, no centro do objeto para configuração do robô; distância: 28 cm dos olhos dos macacos) . Se o animal mantém seu olhar dentro de uma janela de fixação eletronicamente definida (+ /-2,5 °) para 500 ms, ilumine o objecto.
   3. Depois de um tempo fixo (400 ms), desligue a luz.
   4. Após um atraso variável período (1500-300 ms), seguindo a luz deslocamento, dim/interruptor no ponto de fixação (ir CUE) para instruir o macaco para levantar a mão e alcance, alcance e mantenha o objeto (tempo de armazenagem: 300-900 ms).
   5. Sempre que o animal realiza toda a sequência corretamente, dá uma gota de suco como recompensa.
3. Execute a fixação passiva. Quanto a tarefa VGG, escolha a configuração mais adequada (instalação carrossel ou robô) dependendo do objetivo da pesquisa.
   Nota: Duas tarefas diferentes fixação passiva podem ser realizadas: fixação passiva de objetos do mundo real (usando os objetos-para-ser-compreendeu as configurações de carrossel e robô) e fixação passiva de imagens 3D/2D de objetos.
   1. Execute a fixação passiva de objetos do mundo real.
      1. Apresente o ponto de fixação (laser vermelho para o carrossel de configuração projetada na base do objeto e LED vermelho na configuração do robô).
      2. Se o animal mantém seu olhar dentro de uma janela de fixação eletronicamente definida (+ /-2,5 °) para 500 ms, ilumine o objeto para 2.000 ms.
      3. Se o animal mantém seu olhar dentro da janela para 1.000 ms, recompensá-lo com uma gota de suco.
   2. Execute a fixação passiva de imagens 3D/2D de objetos.
      1. Apresentar todos os estímulos visuais em um fundo preto (luminância de 8 cd/m²) usar um monitor (resolução de 1.280 x 1.024 pixels) equipado com um rápido decaimento P46-fósforo e operado a 120 Hz (distância de visualização: 86 cm).
      2. Nos testes de 3D, apresente os estímulos estereoscopicamente, alternando as imagens do olho direito e esquerdo em um display (monitor CRT), em combinação com dois obturadores ferroelétrica cristal líquido. Localizar estes obturadores diante dos olhos do macaco, operar a 60 Hz e sincronizar com o retrace vertical do monitor.
      3. Inicie o julgamento, apresentando uma pequena praça no centro da tela (ponto de fixação; 0,2 ° × 0,2 °). Se a posição do olho permanece dentro de uma definido eletronicamente 1° quadrado janela (muito menor do que para objetos do mundo real) pelo menos 500 ms, apresente o estímulo visual na tela, para um tempo total de 500 ms.
      4. Quando o macaco mantém uma fixação estável até o deslocamento de estímulo, recompensá-lo com uma gota de suco.
      5. Para um estudo adequado de seletividade de forma, execute uma completa bateria de testes com imagens em 2D durante a tarefa de fixação passiva, na sequência a seguir.
      6. Execute um teste de pesquisa. Testar a seletividade visual da célula usando um amplo conjunto de imagens (imagens de superfície; Figura 4A), incluindo as fotos do objeto que é entendido no VGG. Por esta e todas as tarefas visuais subsequentes, compare a imagem evocando a resposta mais forte (denominada 'imagem preferida') para uma segunda imagem para que o neurônio está respondendo fracamente (denominada ' imagem for'). Se o neurônio sob estudo também responde às imagens de objetos, procure componentes de estímulo, dirigindo a capacidade de resposta da célula (ensaios de contorno, teste de campo receptivo e redução).
      7. Execute um teste de contorno. As imagens de superfície original de objetos reais (imagens 2D ou 3D que contém a textura, sombreamento e perspectiva), obter versões progressivamente simplificadas, da mesma forma estímulo (silhuetas e contornos; Figura 4B). Colete pelo menos 10 ensaios por condição a fim de determinar se o neurônio prefere a superfície original, a silhueta ou o contorno da forma original.
      8. Execute um teste de campo receptivo (RF). Para mapear o RF de um neurônio, apresentar as imagens de objetos em diferentes posições em um display (neste experimento, 35 posições; tamanho do estímulo de 3°), abrangendo o campo visual central^19,20. Para coletar bastante repetições de estímulo em todas as posições possíveis em um tempo razoável, reduzir a duração do estímulo (estímulos piscados; duração do estímulo: 300 ms, intertrial intervalo: 300 ms).
      9. Execute um teste de redução. Execute um teste de redução com contorno dos fragmentos apresentados no centro de RF para identificar o recurso mínimo de forma eficaz (MESF). Gera o conjunto de estímulos no Photoshop, recorte o contorno de cada uma das formas de contorno originais ao longo dos eixos principais (Figura 3B). Projetar a MESF como o fragmento de forma menor, evocando uma resposta que seja pelo menos 70% da resposta contorno intacta e não significativamente menor do que aquela resposta⁸.
      10. Para uma melhor estimativa da posição de dependência (o efeito da posição do estímulo na seletividade do fragmento), fazer dois testes diferentes. Execute um teste de redução com os fragmentos localizados na posição ocupada com a forma de contorno original. Execute um teste de redução com os fragmentos para o centro de massa da forma.
      11. Nesta fase, execute um novo mapeamento de RF usando o MESF.

Results

Figura 5 parcelas as respostas de um neurônio exemplo gravado de área F5p testado com quatro objetos: duas diferentes formas - uma esfera e uma placa-mostrada em dois tamanhos diferentes (6 e 3 cm). Este neurônio particular respondeu não só à esfera grande (estímulo ideal; painel esquerdo superior), mas também para o prato grande (painel inferior esquerdo). Em comparação, a resposta para os objetos menores era mais fraca (superior e inferior direito painéis)....

Discussion

Uma abordagem abrangente para o estudo do fluxo dorsal requer uma cuidadosa seleção de tarefas comportamentais e testes visuais: visuais e preensão paradigmas podem ser empregadas ou combinados ou separadamente, dependendo das propriedades específicas da região.

Neste artigo, nós fornecemos os exemplos da atividade neural gravado em AIP e F5p em resposta a um subconjunto de tarefas visuais e motoras, mas respostas muito semelhantes podem ser observadas em outras áreas frontais como área 45B e ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Robô de preensão	GIBAS Universal Robots	UR-6-85-5-A	Braço robótico equipado com uma pinça
Motor carrossel	Siboni	RD066/&punhal; 20 MV6, 35x23 F02	Motor a ser implementado em um carrossel vertical feito sob medida. Permite a rotação do carrossel.
Rastreador ocular	SR Research	EyeLink II	Sistema de câmera infravermelha amostragem a 500 Hz
Filtro	Wavetek Rockland	852	Os filtros eletrônicos executam uma variedade de funções de processamento de sinal com o objetivo de remover os componentes de frequência indesejados de um sinal.
Pré-amplificador	BAK ELECTRONICS, INC.	A-1	O Modelo A-1 permite reduzir a capacidade de entrada e captação de ruído e permite testar a impedância de micro-eléctrodos metálicos
Electrodos	FHC	UEWLEESE*N4G	Microeléctrodos metálicos (* = Impedância, a escolher pelo investigador)
Monitor CRT	Vision Research Graphics	M21L-67S01	O monitor CRT está equipado com um fósforo P46 de decaimento rápido a funcionar a 120 Hz
Obturadores de cristal líquido ferroeléctricos	Painel de Obturador FLC da Display Tech	; LV2500P-OEM	Os obturadores operam a 60 Hz na frente dos macacos e são sincronizados com o retrocesso vertical do monitor