Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Markus Nachbar; Jorrit Maul; Matthias Stein; Hermann Wätzig

doi:10.3791/57749

Artigo de método

Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

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DOI:

10.3791/57749

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22 de agosto de 2018

Markus Nachbar¹ , Jorrit Maul¹ , Matthias Stein¹ , Hermann Wätzig¹

¹Institute of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, TU Braunschweig

Neste artigo

Resumo

Este protocolo combina a caracterização de uma amostra de proteínas por eletroforese em gel capilar e uma triagem rápida ligação para ligantes carregadas por eletroforese capilar de afinidade. É recomendável para proteínas com uma estrutura flexível, tais como proteínas intrinsecamente desordenadas, para determinar as diferenças de ligação para diferentes conformistas.

Resumo

As plantas são fortemente dependentes de seu ambiente. A fim de ajustar-se às mudanças estressantes (por exemplo, a seca e alta salinidade), plantas superiores evoluem classes de proteínas intrinsecamente desordenadas (deslocados internos) para reduzir o stress oxidativo e osmótico. Este artigo utiliza uma combinação de electroforese em gel capilar (CGE) e electroforese de afinidade de turno de mobilidade (ACE) para descrever o comportamento de vinculação de conformistas diferentes de AtHIRD11 o IDP da Arabidopsis thaliana. CGE é usado para confirmar a pureza da AtHIRD11 e para excluir fragmentos, modificações do posttranslational e outras impurezas como razões para padrões complexos de pico. Nesta parte do experimento, os componentes de amostra diferentes são separados por um gel viscoso dentro de um capilar por suas massas diferentes e detectados com um detector de matriz de diodo. Depois disso, o comportamento de vinculação da amostra para vários íons metálicos é investigado pela ACE. Neste caso, o ligante é adicionado à solução tampão e a mudança no tempo de migração é medida para determinar se ocorreu um evento de ligação ou não. Uma das vantagens de usar a combinação de CGE e ACE para determinar o comportamento de vinculação de um IDP é a possibilidade de automatizar a electroforese do gel e o ensaio. Além disso, o CGE mostra um menor limite de detecção do que a eletroforese em gel de clássica e ACE é capaz de determinar o modo de ligação de um ligante de forma rápida. Além disso, ACE também pode ser aplicado a outras espécies carregadas de íons metálicos. No entanto, o uso desse método para experimentos de associação é limitado em sua capacidade de determinar o número de locais obrigatórios. No entanto, a combinação da CGE e ACE pode ser adaptada para caracterizar o comportamento de vinculação de qualquer amostra de proteína para inúmeros ligantes carregadas.

Introdução

As plantas são mais dependentes de seu ambiente do que muitas outras formas de vida. Uma vez que as plantas não podem mover-se para outros lugares, eles têm para se adaptarem às mudanças em seu ambiente (por exemplo, seca, fria e alta concentração de sal). Por conseguinte, plantas superiores desenvolveram proteínas de estresse especializadas como dehydrins, que cumprir tarefas múltiplas para reduzir o estresse de célula relacionada com alta salinidade. Estas proteínas ligam íons e água no interior das células, reduzir o estresse oxidativo vinculando Cu^{2 +}-íons e interagir com fosfolipídios, bem como o citoesqueleto. Além disso, a vinculação Zn^....