Artigo de método

Medição de níveis de exercício em Drosophila melanogaster , usando o sistema de quantificação de exercício de giro (REQS)

DOI:

10.3791/57751

⸱

27 de maio de 2018

 , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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O giro exercer quantificação sistema (REQS) pode induzir o exercício em Drosophila melanogaster através de rotação enquanto simultaneamente, medindo a quantidade de atividade realizada pelos animais. Aqui, apresentamos um protocolo ponto-a-ponto, detalhando como medir os níveis de atividade dos animais experimentando tratamentos rotacionais exercício usando o REQS.

Resumo

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Drosophila melanogaster é um novo organismo modelo para estudos em biologia de exercício. Até à data, dois sistemas principais do exercício, a torre de energia e a Treadwheel têm sido descritos. No entanto, um método para medir a quantidade de atividade animal adicional induzida através do tratamento de exercício tem faltado. O giro exercer quantificação sistema (REQS) preenche essa necessidade, fornecendo uma medida da atividade animal para animais experimentando exercício rotacional. Este protocolo fornece detalhes sobre como usar o REQS para avaliar a atividade animal durante o exercício rotacional e ilustra o tipo de dados que podem ser gerados. Aqui, demonstramos como o REQS é usado para medir as diferenças de sexo e estirpe específicos na atividade do exercício induzida. O REQS também pode ser usado para avaliar o impacto de vários outros parâmetros experimentais como idade, dieta ou população tamanho na atividade do exercício induzido. Além disso, ele pode ser usado para comparar a eficácia do exercício de diferentes protocolos de treinamento. Importante, fornece uma oportunidade para padronizar tratamentos de exercício entre estirpes, permitindo que o pesquisador conseguir quantidades iguais de atividade entre os grupos, se necessário. Assim, o REQS é um recurso novo notável para exercício biólogos trabalhando com o sistema modelo de Drosophila e complementa os sistemas existentes de exercício.

Introdução

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Recentemente, pesquisadores começaram a usar a mosca de fruta Drosophila melanogaster para estudar Biologia do exercício. D. melanogaster tem sido um sistema modelo genético para mais de 100 anos1,2. No entanto, pesquisa da drosófila contribuiu não apenas genética, mas também uma variedade de outras disciplinas, incluindo a neurobiologia, biologia do comportamento e fisiologia3. Em 2009, torre de energia, a primeira máquina de exercício para drosófila foi descrito4. Torre de energia aproveita-se da resposta de geotaxis negativo dos animais. Quando perturbado, Drosophila tendem a mover-se para a parte superior do seu gabinete. Esta resposta está bem estabelecida e é a base do ensaio popular "RING" (Geotaxis negativo iterativo rápido5) que é usado para estimar a capacidade de escalada e/ou aptidão física em Drosophila. Torre de energia usa um braço mecânico ligado a uma unidade do motor para levantar várias vezes um conjunto de animais dentro de seus gabinetes por diversas polegadas e soltando-os de volta à terra para induzir a resposta negativa geotaxis (Tinkerhess et al . 20126 fornece um vídeo ilustrando o uso da torre de energia). Tratamento prolongado na torre de energia, portanto, aumenta a quantidade de atividade física (correr ou voar) os animais executam comparado aos animais controle não tratados e ao longo do tempo leva a melhorar o desempenho no ensaio de anel para aptidão física4. Assim, este trabalho demonstrou a viabilidade do uso da drosófila como um modelo para a biologia do exercício.

Para expandir o repertório de ferramentas disponíveis para a pesquisa de exercício de Drosophila, em 2016, Mendez e colegas descreveram uma segunda máquina de exercício de Drosophila, a Treadwheel7. Semelhante à torre de energia, a Treadwheel explora a resposta negativa geotaxis da drosófila. No entanto, esta resposta é induzida pela rotação contínua dos cercos animais, ao invés de levantamento e soltando-os como em Torre de energia. Este método de indução é mais suave e permite um regime de exercício orientado mais resistência que evita qualquer trauma físico que possa ocorrer durante o exercício em Torre de energia (ver Katzenberger, R. J. et al . 20138 para o impacto das repetidas físico trauma na saúde da drosófila). Semelhante ao Power Tower4, exercício de tratamento de animais sobre a Treadwheel leva a uma variedade de respostas fisiológicas, incluindo alterações na aptidão física, os níveis de triglicérides e corpo peso7. Assim, dois métodos complementares estão disponíveis para os biólogos da drosófila, estudando o exercício.

Uma limitação da torre de energia e a Treadwheel é a incapacidade de medir a quantidade de atividade induzida pelo exercício tratamento. Análise de vídeo-gravações retirado a Treadwheel demonstrou que havia diferenças significativas entre as várias cepas de Drosophila em como eles respondem ao tratamento de exercício7. Especificamente, as estirpes estudaram diferiam em quanto atividade adicional, que os animais realizada quando estimulado7. Esta observação levou-na desenvolver um terceiro sistema de exercício, o giro exercer quantificação sistema (REQS), que nos permite medir os níveis de actividade animal durante exercício induzida pela rotação9. O REQS utiliza uma unidade que está instalada em um braço giratório para estimular o exercício através de rotação como a Treadwheel de monitoramento de atividades de comercialmente disponível. Trabalho inicial com o REQS confirma que geneticamente diferentes cepas de Drosophila — e sexos - pode ter significativamente diferentes respostas à estimulação rotacional e, assim, a quantidade de exercício induzida não é idêntica entre diferentes genótipos9 . Assim, o REQS agora permite que os biólogos da drosófila medir a quantidade de exercício induzida pelo tratamento, abrindo uma variedade de novas vias de investigação no campo de exercício.

Aqui descrevemos detalhadamente como usar o REQS para quantificação de exercício rotacional. O REQS induz exercício rotacional e simultaneamente mede os níveis de atividade dos animais sendo tratados. O REQS é capaz de acomodar uma variedade de programas de exercícios, que vão desde o simples 2 h contínuo exercício regime demonstrou aqui mais complexos métodos de treinamento de intervalo conforme descrito por Mendez e colegas7estimulação pode ser ajustada através velocidade de rotação (entre aproximadamente 1-13 rotações por minuto). Dependendo da unidade de monitor de atividade usada para produzir o REQS, esse método é adaptável para a análise de moscas única ou grandes populações de animais. Devido a esta versatilidade, o REQS fornece a pesquisadores da drosófila com uma matriz de oportunidades para estudar, por exemplo, exercício de diferentes regimes, intervenções de dieta ou impacto da densidade populacional.

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Protocolo

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O REQS consiste de uma unidade de Monitor de atividade de Drosophila (para fonte de informação, por favor consulte Tabela de materiais) montados em um braço giratório é controlada por uma unidade do motor (Figura 1). O monitor de atividade determina quantas vezes em um intervalo de tempo determinado, a matriz de raios laser, dissecando o meio do tubo de ensaio é interrompida. Para desenhos detalhados e uma caracterização detalhada, consulte nosso de publicação anterior9. Enquanto nosso sistema usa a unidade de LAM25H, o REQS pode ser modificado para acomodar outras unidades de Drosophila Activity Monitor também.

1. teste a instalação dos REQS

  1. Teste de carga voa em tubos de amostra de vidro por anestesiar os animais com CO2 ou outro método de escolha para tratamento, movendo-os para os tubos vazios e tampar os tubos.
  2. Inserir os tubos de amostra de vidro tampado nas ranhuras da unidade de monitor de atividade. Proteger os tubos usando anéis (calibre de 17-18) e/ou elásticos em ambos os lados da unidade para garantir que os tubos não se mova durante a rotação de borracha:
    1. Deslizar um-ring sobre o tubo de amostra e posicione o anel-o perto do ponto médio do tubo. Inserir o tubo de amostra em um slot do monitor de atividade de frente e centralizá-lo.
    2. Mover o anel-o conforme necessário e assegurar que, uma vez que o tubo de amostra é centrado, o-Ring é deslizado como próximo à unidade de monitor de atividade possível. Fixe o tubo de amostra por passar um segundo anel-o sobre o tubo de vidro na parte de trás, mudar novamente o-Ring como próximo à unidade de monitor de atividade possível.
  3. Inicie a rotação da REQS lanç o interruptor de alimentação na parte frontal da unidade. Ajuste a velocidade de rotação com o seletor na parte frontal da unidade para a velocidade desejada (4 rpm (rotações por minuto) neste exemplo).
    Nota: Neste exemplo, a velocidade rotatória foi escolhida para igualar um estudo anteriormente publicado7. Como diferentes velocidades de rotação resultará em níveis diferentes de atividade animal, ao iniciar um novo estudo, a otimização da velocidade de rotação para a montagem experimental específica (genótipo, comprimento de tal exercício, etc.) pode ser necessária.
    Nota: É importante assegurar que os tubos estão corretamente posicionados para que eles não arraste ao longo do fundo da unidade REQS durante a rotação.
  4. Teste a conexão para o sistema de coleta de dados fornecido com a unidade de Monitor de atividade de Drosophila abrindo o software DAMSystem308 e garantir que a luz de conexão permanece verde para várias rotações. O software começará a gravação de dados em um arquivo de texto "monitorX" (X sendo o número de unidade, se múltiplos monitores estão em uso) imediatamente após iniciação. Frequência de gravação pode ser ajustada na aba "Preferências"; Normalmente, nós gravamos em intervalos de 5 min.
  5. Investiga o arquivo de texto gerado pelo software DAMSystem308 para assegurar que a conexão de dados está funcionando corretamente. Problemas com a conexão resultar em recortes, pontos de tempo onde 0 atividade é registrada para todas as posições no REQS (ver Resultados de representante e tabela 2). Se ocorrerem recortes, ajuste as conexões de dados, levando à tomada de telefone rotativo, como durante a rotação, esta conexão pode tornar-se solto ou trançado. Achamos que a conexão com fita de estabilização ajuda a prevenir este problema.

2. preparação de animais

Nota: Todos os animais foram levantados e testados sob condições normais em uma incubadora (25 ° C, 60-70% de umidade, ciclo de 12 h claro/escuro) em melaço/farinha de milho media10.

  1. Duas semanas antes do experimento planejado, configurar os frascos com densidade controlada de animais para recolher as moscas experimentais normalmente montamos frascos com 7 machos e 10 fêmeas. Com um estoque saudável, de um único frasco, aproximadamente 15 virgens machos e 15 fêmeas podem ser coletadas ao longo de um período de tempo de 4 dias. Ajustar o número de frascos instituído com base no número de animais necessários para o ensaio; um ensaio típico em nosso laboratório inclui 10 conjuntos de 10 virgens machos e fêmeas por genótipo (100 homens e 100 mulheres).
    Nota: Não-virgem moscas podem ser usadas dependendo a questão experimental específica. Se realizando experiências de longo prazo com animais não-virgens, larvas rastejantes podem interferir com monitoramento de atividades de precisa.
  2. Remova as moscas do pai uma semana depois de configurar os frascos.
  3. Começando no dia 10, depois de configurar os frascos, coletar moscas virgens de frascos e armazená-los separados por sexo.
  4. Recolha animais suficientes para a experiência e a idade-los como necessários, 3 dias neste exemplo.
    Nota: Nós normalmente anestesiar os animais com CO2 para a manipulação. CO2 é conhecido para impactar os níveis de atividade do animal por longos períodos de tempo após o tratamento (por exemplo, ver Bartholomew et al . 201511). Se o CO2 efeito interfere com planejada a jusante ensaios ou análises, use um método diferente de anestesia como anesthetization de gelo.

3. dados coleção com o REQS

  1. Anestesia os animais a ser usado para o estudo de quantificação do exercício com CO2 ou outro método de anestesia. Dividi-los em grupos, conforme necessário e carregar os grupos de animais em tubos de vidro vazio de monitor de atividade; Neste exemplo, 10 animais da mesma idade são carregados por um tubo de vidro, com 10 repetições para cada tipo de animal (sexo/genótipo). Certifique-se de observar que tipo de animal é carregado em cada tubo.
    Nota: Para mais experiências, alimentos podem ser incluídos em tubos de amostra. Neste caso, é essencial que o alimento é seguro e não tornar-se desalojado durante a rotação.
  2. Carregar os tubos de ensaio de vidro para a unidade REQS e fixe-os com a anéis de borracha. Se trabalhando com mais de um sexo/genótipo, utilizar um delineamento de blocos ou randomização da posição dos animais na REQS eliminará quaisquer potenciais efeitos de posição. Randomização pode ser alcançada, atribuindo a cada frasco um número aleatório, por exemplo, de um web-based gerador de números aleatórios (por exemplo, https://www.randomizer.org/) ou em uma planilha e então encomendar os frascos com base no número aleatório.
  3. Coloque o REQS dentro da incubadora para assegurar a temperatura constante, umidade e luz condições. Certifique-se de que os cabos de dados e de alimentação estão conectados corretamente.
  4. Permitir que os animais para se recuperar da anestesia e se adapte ao novo ambiente por 1h.
  5. Começa o experimento por iniciar a rotação da REQS na velocidade desejada.
    Nota: Outra opção é primeiro coletar dados de atividade de base dos animais antes do início da rotação, seguido pelos níveis de atividade de gravação em resposta à estimulação rotatória.
  6. Inicie a coleta de dados abrindo o software DAMsystem308 (simplesmente abrindo a software inicia coleta de dados). Os dados são gravados em um arquivo de texto no intervalo definido (aqui, 5 min); se necessário, alterar as configurações de intervalo na aba "Preferências" (consulte a etapa 1.4).
  7. Para garantir que os dados são transmitidos com êxito para o computador, abra o arquivo de texto gerado pelo software DAMsystem308 depois de um ou dois intervalos de tempo tem passado e confirmam que os dados estão sendo gravados para o arquivo. Feche e reabra este arquivo para ver os dados de quaisquer pontos de tempo adicional. Coletar dados para a quantidade desejada de tempo; Neste exemplo, 2h.
    Nota: Não abra a incubadora durante o período de ensaio, os animais são muito sensíveis a qualquer perturbação e provavelmente irão responder com aumento da atividade.
  8. No final do ensaio do exercício, encerrar a coleta de dados, fechando o software DAMsystem308 e, em seguida, desligue o REQS. Retire os animais de tubos de ensaio de vidro e limpe os tubos. Os animais podem ser movidos volta dentro dos frascos de alimentos se repetidas são necessárias medidas em diferentes idades.
    Nota: Se mortes ocorrem durante o regime de exercício, ele deve ser registado, como a presença de moscas mortas pode afetar a atividade contagens. Em nossa experiência com a mosca linhas de DGRP212,13, exerce a 4 rpm para 2h não resultou em qualquer morte, mas cepas mais fracas podem respondem de forma diferente.

4. análise de dados

  1. Abra o arquivo. txt rotulado "Windows1" produzido pelo software DAMSystem308.
  2. Inspecionar o arquivo de dados para todos os problemas que podem ter ocorrido durante a aquisição de dados (pontos de tempo perdido, etc; A tabela 1). Se necessário, censura o arquivo, removendo pontos de dados no início e no final da gravação.
  3. Usando o software estatístico de sua escolha (por exemplo, R), analisar os dados coletados. Gerar estatísticas descritivas e realizar a análise de variância (ANOVA) para investigar os efeitos tais como o sexo e o genótipo, que os dados são normalmente distribuídos. Se os dados não são normalmente distribuídos, use métodos não-paramétricos, tais como testes de Kruskal-Wallis, para comparar grupos. As análises específicas necessárias dependerá a questão científica específica e o desenho experimental.

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Resultados

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A saída de uma corrida individual com o REQS é uma tabela de dados produzida pelo software DAMSystem308, que será rotulado "Monitor1.txt" por padrão (para um arquivo suplementar 1, ver exemplo). Um trecho de uma mesa tão é mostrado na tabela 1. Cada coluna contém os dados a partir de um tubo de ensaio individual, enquanto as linhas contêm a atividade medida em cada intervalo de tempo desde o início do experimento (topo) até o fim (parte inferior). Primeir...

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Discussão

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Como ilustram os resultados representativos, o REQS é capaz de medir com precisão a atividade do exercício da drosófila. O REQS é flexível e permite que os pesquisadores atender uma variedade de pesquisa questões relacionadas com a biologia de exercício ou exercício de intervenções. Há duas etapas críticas no protocolo para destacar. Em primeiro lugar, é essencial para testar a configuração do REQS para garantir que a transmissão de dados do REQS para o DAMSystem308 está funcionando corretamente. Se não for configurado c...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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O trabalho foi apoiado pelo prêmio número P30DK056336 do nacional Instituto de Diabetes e digestivos e doenças renais através de uma concessão piloto da nutrição e obesidade Research Center na Universidade do Alabama em Birmingham, a NCR.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Monitor de Atividade de Drosophila TrikineticsLAM25HREQS componente
Desembaraçador de Cabo TelefônicoUvitaluv20170719componente REQS
Fechos de frasco (flugs)Genesee Scientific49-102Suprimentos de cultura de Drosophila
Vials Genesee Scientific32-120 Suprimentos decultura de Drosophila
Rede de cultura de DrosophilaCarolina Biological Supply173090Suprimentos de cultura de Drosophila
FubáPepsico43375Mídia de Drosophila
MelaçoBarrelBLA-GALMídia de Drosophila
ÁgarApex Bioresearch66-103Mídia de Drosophila
Levedura seca inativaGenesee Scientific62-106Drosophila media
TegoseptApex Bioresearch20-258Drosophila media
Ácido propiônicoGenesee Scientific20-271Drosophila media
Golden

Referências

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  1. Rieder, L. E., Larschan, E. N. Wisdom from the fly. Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  4. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4 (6), e5886(2009).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), (2012).
  7. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila. PLoS One. 11 (10), e0164706(2016).
  8. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  9. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12 (10), e0185090(2017).
  10. Reed, L. K., et al. Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).
  11. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  12. Huang, W., et al. Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines. Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).
  13. Mackay, T. F., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).
  14. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease. Front Behav Neurosci. 11, 159(2017).
  15. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Sci Rep. 5, 8454(2015).

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