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Artigo de método

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

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DOI:

10.3791/57756

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24 de junho de 2018

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1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo, 2Department of Restorative Dentistry, School of Dentistry of Ribeirão Preto, University of São Paulo

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, incluindo a análise de viabilidade de células bacterianas e características morfológicas. Um modelo in situ associado com técnicas de microscopia poderoso é usado para a análise do biofilme oral.

Resumo

Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilmes. O uso de materiais que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e a progressão das doenças peri-implante. Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir uma análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular. O modelo in situ para avaliar a formação de biofilme oral em titânio e zircônio materiais para pilares de prótese dentária, conforme descrito neste estudo fornece uma boa conservação de biofilme a 48 h, mostrando assim a adequação metodológica. Microscopia do multiphoton permite a análise de um representante da área do biofilme formado sobre os materiais de teste. Além disso, o uso de fluorophores e o processamento das imagens usando microscopia do multiphoton permite a análise da viabilidade bacteriana em uma população muito heterogénea de microorganismos. A preparação de espécimes biológicos para microscopia eletrônica promove a preservação estrutural do biofilme, imagens com boa resolução e sem artefatos.

Introdução

Biofilmes bacterianos são complexas, funcionalmente e estruturalmente organizaram comunidades microbianas, caracterizam por uma diversidade de espécies microbianas que sintetizam uma matriz extracelular, biologicamente ativo polímero1,2. A aderência bacteriana às superfícies bióticas ou abióticas é precedida por uma formação da película adquirida, composta principalmente de glicoproteínas salivares1,3,4. Fracas físico-químicas interações entre os microrganismos e o pellicle são inicialmente estabelecidas e seguidas por interações mais fortes entre adesinas bacterianas e receptores de glicoproteína da película adquirida. Diversidade microbiana aumenta gradualmente através do coaggregation de colonizadores secundários aos receptores das bactérias já anexados, formando uma comunidade terminousua1,3,4, 5.

Homeostase da microbiota oral e sua relação simbiótica com o host é importante na manutenção da saúde bucal. A disbiose dentro biofilme oral pode aumentar o risco para o desenvolvimento da cárie e doença periodontal2,5. Estudos clínicos demonstram uma relação de causa-efeito entre o acúmulo de biofilme sobre dentes ou implantes dentários e o desenvolvimento de gengivite ou peri-implante mucosite6,7. A progressão do processo inflamatório leva à peri-implantite e a consequente perda do implante8.

Implantes dentários e seus componentes protéticos são propensos a colonização bacteriana e formação de biofilme9. O uso de materiais com uma composição química e a topografia da superfície que fornece baixa adesão microbiana pode reduzir a prevalência e progressão de doenças de peri-implante9,10. O titânio é o material mais utilizado para a fabricação de pilares protéticos para implantes; no entanto, materiais cerâmicos foram introduzidos recentemente e estão ganhando popularidade como uma alternativa ao titânio devido a suas propriedades estéticas e biocompatibilidade11,12. Também importante, os materiais cerâmicos têm sido associados com um potencial supostamente reduzido para aderir aos microrganismos, principalmente devido à sua rugosidade da superfície, molhabilidade e energia de superfície livre10,13.

Estudos in vitro têm contribuído para avanços significativos na compreensão da adesão microbiana a Pilar protético superfícies9,14,15,16,17. No entanto, o ambiente dinâmico da cavidade oral, caracterizada pela sua variação de temperatura e pH e disponibilidade de nutrientes, bem como pela presença de forças de cisalhamento, não é reproduzível em vitro protocolos experimentais18, 19. Para superar este problema, uma alternativa é o uso de modelos em situ da formação de biofilme, que vantajosamente preserva sua estrutura tridimensional por ex vivo análise10,20, 21 , 22 , 23 , 24.

A análise da estrutura complexa do biofilme formado em substratos orais requer o uso de técnicas de microscopia capazes de exibir matéria densa opticamente25. Microscopia eletrônica de varredura do laser do multiphoton é uma opção moderna para análise estrutural de biofilme26. É caracterizada pelo uso de óptica não-linear com uma fonte de iluminação perto do comprimento de onda infravermelho, pulsada femtoseconds27. Este método é indicado para a aquisição de imagens de autofluorescência marcados por fluorophores, além de imagens geradas por sinais ópticos não-lineares derivados de um fenômeno conhecido como segunda geração harmônica ou materiais. Entre as vantagens da microscopia do multiphoton é a profundidade da imagem grande obtida com mínima célula danos causados pela intensidade da luz da excitação27.

Para uma análise de viabilidade de biofilme em superfícies abióticas por microscopia do multiphoton, o uso de fluorescente ácido nucleico tinge-se com diferentes características espectrais e uma capacidade de penetração nas células bacterianas é necessário28. Fluorophores SYTO9 (verde-fluorescente) e iodeto de propidium (vermelho-fluorescente) podem ser usados para uma diferenciação visual entre bactérias vivas e mortas28,29,30. Iodeto de propidium penetra apenas bactérias com membranas danificadas, enquanto SYTO9 entra em células bacterianas, com uma membrana intacta e comprometida. Quando ambos os corantes estão presentes dentro de uma célula, iodeto de propidium tem uma maior afinidade para os ácidos nucleicos e desloca SYTO9, marcando-o vermelho28,30.

Tendo em conta o ambiente oral complexidade e oral biofilme heterogeneidade, microscopia, são necessárias técnicas que pode permitir a análise de biofilme das superfícies dos dentes e materiais dentários. Este artigo descreve uma série de protocolos implementados para comparar a formação de biofilme oral em titânio e materiais cerâmicos para pilares protéticos, bem como os métodos envolvidos em análises de biofilmes oral a nível morfológico e celular.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da escola de Odontologia de Ribeirão Preto, e o participante voluntário assinou o termo de consentimento (processo 2011.1.371.583).

1. biofilme formação in Situ

  1. Seleção dos participantes
    1. Selecionar os pacientes com base nos seguintes critérios de inclusão: um indivíduo saudável, com uma dentição completa e sem sinais clínicos de doenças orais.
    2. Excluir os pacientes com base nos seguintes critérios de exclusão: gravidez, lactação, cárie dentária, doença periodontal ou tratamento com antibióticos nos últimos 3 meses, fumante ou qualquer doença sistêmica que pode influenciar o estado periodontal.
  2. Preparação do dispositivo intraoral
    1. Registro do arco maxilar por meio de uma impressão de alginato.
    2. Prepare tipo IV pedra adicionando 19 mL de água para 100 g de pó de pedra. Despeje a pedra do molde de alginato para fazer um modelo do arco maxilar.
    3. Projetar e fabricar um dispositivo intraoral acrílico para apoiar os provetes (discos de cerâmicos e titânio).
      1. Fabricar fechos retentivos do fio de NiCr (0,7 mm no diâmetro) usando alicates ortodônticos #139 e posicioná-los sobre o modelo. Para posicionar a pinça entre os pré-molares superiores, dobre uma das extremidades de cada fio para que eles formam um loop.
        1. Adapte o loop na região da papila interdental. A oclusal, inserir uma curvatura suave para não interferir com os pontos de contacto e a oclusão. Fazer um 90° dobre no fim da mordaça para uma retenção no acrílico.
        2. Para encaixar o molar superior segundo o grampo, adaptar-se a curvatura do fio no terço cervical (vestibular) para contornar o dente (distal) e fazer um 90° dobre no fim da mordaça para uma retenção no acrílico.
          Nota: A fim de fornecer retenção/estabilidade adequada para o dispositivo intraoral, os fechos retentivos foram posicionados entre os pré-molares superiores e aspecto distal do segundo molar de ambos os lados da arcada dentária.
      2. Manipular a resina acrílica autopolimerizável de acordo com as instruções do fabricante e pressione a resina acrílica entre 2 placas de vidro (com um espaçador de espessura de 3mm interposta) durante a fase de plástico, para fazer uma folha de espessura de 3 mm.
      3. Coloque a folha acrílica na região palatal do modelo, de acordo com o projeto do dispositivo e retire a excesso da resina acrílica com um carver, antes de polimerização.
      4. Fabrica discos de cera, usando uma matriz metálica [10 mm de diâmetro, 2 mm de espessura (área de superfície de 78,5 mm2)] colocando cera derretida na matriz e esperando a cera para solidificar. Manualmente incorpore a resina acrílica, 2 deles entre os pré-molares e os outros 2 ao lado do segundo molares 4 discos de cera.
      5. Deixe a resina acrílica polimerizar-se em uma panela de pressão abaixo dos 20 psi de ar comprimido por 20 min.
      6. Terminar o dispositivo intraoral com um handpiece de laboratório de prótese dentária elétrica e cortador e lustrá-la com borracha abrasiva.
      7. Ajuste o dispositivo para um ajuste apropriado na boca usando o equipamento descrito acima.
  3. Preparação das amostras de titânio e zircônio
    Nota: As amostras (n = 14) são 10 mm de diâmetro e 2 mm de espessura e tem uma área de 78,5 mm2.
    1. Polir as superfícies dos espécimes com lixas Water-cooled decrescente de abrasividade (600, 1200 e 2000 grão), por aproximadamente 20 min.
      Nota: O polimento das amostras foi realizado para padronizar a rugosidade da superfície de 0,2 µm.
    2. Limpar e desinfectar os espécimes e dispositivo intraoral com detergente líquido e água da torneira e em seguida, use álcool isopropílico banho de ultra-sons para 15 min. seque-as com toalhas de papel absorvente.
    3. Corrigi os espécimes no dispositivo intraoral oral com cerca de 0,1 mL de adesivo quente do derretimento tóxicos (Figura 1).
    4. Instale o dispositivo, contendo os espécimes na cavidade oral.
      Nota: O dispositivo intraoral, contendo os espécimes deve ser usado por 48 h. O dispositivo foi removido e armazenado em salina tamponada fosfato (PBS), enquanto o paciente estava comendo e realizando a limpeza oral.

2. avaliação da viabilidade bacteriana

Nota: de tamanho da amostra n = 10.

  1. Preparar uma solução de tingimento, adicionando 3 µ l de SYTO9 (verde tintura fluorescente ácido nucleico) e água destilada, 3 µ l de iodeto de propidium (corante vermelho fluorescente de ácidos nucleicos) a 1 mL de estéril.
    Nota: Prepare soluções, protegidas da luz.
  2. Transferir as amostras para uma placa de 24 e lave-as com PBS para remover todas as células não-aderentes.
  3. Adicione o volume apropriado (1 mL) da solução de tintura fluorescente para cobrir a amostra contendo biofilme. Adicione o corante com muito cuidado para não desorganizar o biofilme.
  4. Incube a amostra por 20-30 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
  5. Lave delicadamente a biofilme amostra com água destilada esterilizada para remover qualquer corante em excesso.
  6. Colocar a amostra em um prato fundo de vidro e executar do laser do multiphoton microscopia para a análise de biofilme.
    Nota: A análise da viabilidade de células bacterianas foi realizada usando um sistema de microscopia do multiphoton. A fluorescência de iodeto de propidium foi detectada usando um filtro com um comprimento de onda de excitação/emissão de 546/680 nm e 477/600 nm para SYTO9. O tamanho das imagens obtidas foi 5.16188 x 5.16188 mm, o que corresponde a 26,64 mm2 de área total de cada amostra (78,5 mm2) ou 33.94% da área total. As imagens foram feitas a partir da porção mais central da amostra, com resolução de 1.024 x 1.024 pixels. O canal vermelho e verde canal imagens foram analisadas separadamente, usando software de Fiji31. Cada célula foi Selecionadoda usando uma ferramenta de seleção e a intensidade da fluorescência foi medida através da densidade integrada dos pixels, subtraindo-se o fundo da imagem.

3. análise da composição química dos espécimes por espectroscopia de energia dispersiva (EDS)

Nota: de tamanho da amostra n = 3.

  1. Selecione 3 amostras de cada material de teste livre de biofilme e avaliar a composição química de cada amostra, usando um microscópio eletrônico de varredura acoplado a um espectrômetro de energia dispersiva, com uma tensão de feixe de elétrons de 10 kV32em 2 áreas diferentes.

4. morfológica análise do biofilme bacteriano por microscopia eletrônica

Nota: de tamanho da amostra n = 1.

  1. Corrigi o biofilme por imersão dos espécimes em glutaraldeído 2,5% diluído em buffer de cacodylate de sódio 0,1 M, pH 7,0-7.3, por 24 h.
  2. Lavar a amostra em tampão PBS (pH = 7,6).
  3. O postfix o biofilme com tetróxido de ósmio 1% por 1h.
  4. Lavar a amostra em tampão PBS (pH = 7,6).
  5. Desidrate as amostras de biofilme cuidadosamente, mantendo-os imersos em concentrações crescentes de soluções de etanol (50%, 70%, 90%, 95% e 100%).
    Nota: Execute 3 trocas de etanol em uma concentração de 100%. A etapa de desidratação total leva cerca de 2 h.
  6. Transferir as amostras do ponto crítico secador e fazer várias substituições com dióxido de carbono (CO2) até que os espécimes estão secos.
  7. Remova as amostras secas do aparelho e montá-los para os titulares de microscópio eletrônico de varredura.
  8. Revestimento por pulverização catódica uma camada de 20 nm de ouro na superfície do espécime para 120 s.
  9. Inserir os discos de ouro-revestido na câmara de microscópio eletrônico de varredura. Obter imagens de 5 diferentes áreas de cada amostra, em 20-30 kV sob pressão variável e em 650 X ampliação12.

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Resultados

A densidade de colonização do biofilme após 48 h de crescimento em situ foi representada neste estudo pela proporção da área colonizada sobre os discos de titânio e zircônio em relação à área total digitalizada da amostra usando microscopia do multiphoton ( 26.64 mm2). A Figura 2 representa a densidade de colonização bacteriana na superfície dos 3 materiais testados. Uma maior densidade de biofilme foi observada sobre as superfícies do ele...

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Discussão

O protocolo descrito neste estudo foi desenvolvido para avaliar a formação de biofilme em titânio e zircônio materiais para pilares protéticos, incluindo a análise de viabilidade celular bacteriana e características morfológicas. Para realizar isso, foi desenhado um modelo in situ de formação de biofilmes, constituído por um dispositivo intraoral capaz de acomodar amostras dos materiais teste e mantê-los expostos ao ambiente oral dinâmico por 48 h. O dispositivo foi considerado confortável e fácil de inserir, re...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores graças a José Augusto Maulin do laboratório multiusuário de microscopia (Faculdade de medicina de Ribeirão Preto) pela ajuda generosa com o EDS e SEM análises e Hermano Teixeira Machado, por sua generosa assistência técnica na edição de vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hydrogum 5Zhermack DentalC302070
Durone IVDentsply17130500002
fio NiCr Morelli55.01.070
JET auto polimerização acrílicaClá ssico
Cera dental Clá ssico
Pote de pressão Essencedental
Lixas 600 grãoNORTONT216
Lixas 1200 grãoNORTONT401
Lixas 2000 grãoNORTONT402
Máquina de polimento metalográficoArotec
Álcool isopropílicoSIGMA-ALDRICHW292907
Adesivo hot meltTECSILPAH M20017
Filmtracer LIVE/DEAD Kit de Viabilidade de BiofilmeInvitrogenL10316
Pontas de Pipeta, 10 µ LKASVIK8-10   
Ponteiras de Pipeta, 1.000 µ LKASVIK8-1000B   
Placa de 24 poços KASVIK12-024
Thermo Scientific150680
Microscópio invertido AxioObserver Laser ZEISS
Chameleon Vision IIObjetivo Coerente
Plano EC-Neofluar 40x/1.30 Óleo Sensores SDD DICZEISS440452-9903-000
- X-Max 20mm²Solução de
SIGMA-ALDRICHG5882
Tampão de cacodilato de sódio SIGMA-ALDRICH97068 
Tetróxido de ósmioSIGMA-ALDRICH201030
Na2HPO4SIGMA-ALDRICHS9638Usado para preparação de solução salina tamponada com fosfato
KH2PO4SIGMA-ALDRICHP9791 
NaClMERK1.06404
KclSIGMA-ALDRICHP9333 
Etanol absoluto para análise EMSUREMERK1.00983
CPD 030 Secador de Ponto CríticoBAL-TEC
JSM-6610 Série Microscópio Eletrônico de VarreduraJEOL
SCD 050 Revestidor de pulverização catódicaBAL-TEC
Prato com Fundo de Vidro glutaraldeído da Oxford Instruments

Referências

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