A gigante Ciliophora, Stentor coeruleus, é um excelente sistema para estudar regeneração e cicatrização de feridas. Apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de culturas de células de Stentor de células únicas ou fragmentos de células, induzindo a regeneração de células de corte, quimicamente, induzindo a regeneração da banda membranellar e aparelhos orais, imagem e análise de célula regeneração.
Artigo de método
Métodos para o estudo da regeneração em Stentor
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células precisam ser capazes de regenerar as partes para se recuperar de perturbações externas. Os ciliados unicelulares Stentor coeruleus é um organismo modelo excelente para estudar a cicatrização e regeneração celular subsequente. O genoma de Stentor tornou-se disponível recentemente, juntamente com métodos de biologia molecular moderna, tais como RNAi. Estas ferramentas possibilitam estudar regeneração de célula única a nível molecular. A primeira seção do protocolo abrange estabelecendo Stentor culturas de células de células únicas ou fragmentos de células, juntamente com as orientações gerais para a manutenção de culturas de Stentor . Cultivo de Stentor em grandes quantidades permite a utilização de ferramentas valiosas como bioquímica, sequenciamento e espectrometria de massa. As seções subsequentes do protocolo cobrem diferentes abordagens para a indução de regeneração em Stentor. Manualmente, cortando as células com uma agulha de vidro permite estudar a regeneração de partes de células grandes, enquanto o tratamento de células com sacarose ou ureia permite estudar a regeneração de estruturas específicas, localizadas na extremidade anterior da célula. Um método de imagem células individuais de regeneração é fornecido, juntamente com uma rubrica para encenar e analisar a dinâmica da regeneração. Todo o processo de regeneração é dividido em três fases. Visualizando a dinâmica da progressão de uma população de células através dos estágios, é demonstrada a heterogeneidade no calendário de regeneração.
Introdução
As células não são simples sacos de enzimas, mas prefiro altamente complexas máquinas cujos componentes são cuidadosamente dimensionados para o tamanho correto e dispostos em posições bem definidas. A morfogênese das células individuais representa um processo chave em biologia celular e do desenvolvimento, mas seu mecanismo molecular é desconhecido1,2. Enquanto algumas células cultivadas assemelham-se a bolhas, organismos unicelulares podem ter extremamente complicado arquiteturas, exemplificadas pelos complexos padrões corticais vistos em ciliados3,4.
Talvez o exemplo mais extremo de uma célula altamente estruturado é Stentor coeruleus, um heterotrichous gigante ciliados parente Tetrahymena e Paramecium. Stentor é de 1 mm de comprimento e é coberto com mais de 100 listras longitudinais de pigmento azul, alternando com fileiras de cílios organizados pelo paralelas pilhas de fitas de microtúbulos que correm o comprimento da célula inteira. A célula é trombeta-dadas forma (Figura 1), com uma banda de membranellar e um aparelho oral (OA) em sua extremidade anterior e um holdfast que atribui a célula ao substrato em sua extremidade posterior. Além da polaridade claro ântero-posterior, a célula também mostra uma distintiva padronização quiral, tal que o espaçamento entre linhas ciliares gradualmente aumenta no sentido horário. Isso resulta em uma descontinuidade onde se encontra com a linha mais estreita a linha mais ampla e esta região da superfície celular, conhecida como o locus de contraste de listra, pode induzir a formação do segundo conjunto de estruturas da extremidade anterior quando enxertado em outra cela5, tornando-se formalmente equivalente ao organizador de Spemann. Assim, todos os processos-chave da biologia do desenvolvimento tem seus análogos em Stentor: axiation, formação de padrão e indução. Em um embrião, estes processos são movidos por diferenças de destino entre células diferentes, mas no Stentor, eles devem ser conduzidos por destino as diferenças entre regiões diferentes dentro de uma única célula. O que define as diferenças entre as regiões dentro Stentor é um mistério.
Se qualquer parte de Stentor é cortado, a peça que faltava da célula pode regenerar para produzir uma célula normal em questão de horas. Se uma célula é cortado na metade, ou mesmo em pedaços muito pequenos, cada peça reorganiza em uma célula de aparência normal, mas menor e restaura adequada proporcionalidade entre célula peças6,7. Mesmo pequenos fragmentos, 1/64th o tamanho da célula original, são capazes de regenerar-se em uma célula pequena, mas normalmente proporcionada e então crescer para o tamanho6. Stentor , portanto, apresenta uma oportunidade única para estudar os mecanismos da organela tamanho dimensionamento e célula crescimento Regulamento usando métodos cirúrgicos que geralmente são aplicados a nível de tecidos ou organismos todo.
Uma das propriedades de Stentor que lhe permite regenerar-se de uma ampla gama de operações cirúrgicas é que ele contém um único noduladas Macronúcleo (Figura 1), com cerca de 50.000 cópias do genoma inteiro8. Enquanto um fragmento de célula contém pelo menos um nó macronuclear, tem a capacidade de se regenerar totalmente. Outra propriedade subjacente a capacidade de regeneração do Stentoré sua prodigiosa capacidade de cicatrização de feridas. Embora muitos tipos de células são capazes de curar suas feridas9, Stentor é capaz de recuperar-se de uma extraordinária gama de perturbações físicas. Um exemplo de recuperação de Stentor de uma perturbação drástica, juntamente com os métodos para a visualização fluxo citoplasmático em Stentor10 anteriormente foram relatadas. Estes métodos permitem o estudo do efeito de regeneração como ferindo e subsequentes o estado físico do citoplasma.
Stentordo enorme tamanho, capacidade de regeneração extraordinária e o fato de que ela se manifesta de muitos dos fenômenos do desenvolvimento vistos em embriões multicelulares (como organizadores, axiation e padronização) atraíram muitos biólogos do desenvolvimento durante a virada do século passado, incluindo Thomas Hunt Morgan7. Durante os anos 50 e 60, abordagens microcirúrgicos demonstraram uma variedade surpreendente de processos regenerativos e morfogenéticas neste organismo unicelular11. No entanto, Stentor foi desenvolvido como um sistema modelo de biologia molecular apenas recentemente. Durante os últimos anos, o genoma de Stentor foi sequenciado e montados8, e o método para perturbar a expressão gênica usando RNAi alimentando foi desenvolvido12.
Uma das razões que Stentor foi desenvolvido num organismo modelo para a moderna biologia molecular só recentemente foi a dificuldade de cultivar grandes culturas devido ao seu longo ciclo de célula (3 a 5 dias). No entanto, os métodos modernos de genômica e proteômica exigem menos material do que costumavam, e o volume de uma única célula de Stentor é suficiente para estes métodos, mesmo sem recorrer a métodos ultra-sensível que foram desenvolvidos para a análise do single células que são mais pequenas que Stentor. Secção 1 do protocolo detalha o procedimento para o estabelecimento de uma grande cultura de uma única célula de Stentor . A mesma abordagem pode ser usada para estabelecer uma grande cultura de um fragmento de célula obtida pelo corte de uma célula. Secção 1 também fornece as diretrizes para a manutenção saudável Stentor culturas durante longos períodos de tempo. Secção 2 do protocolo prevê que a metodologia de indução de regeneração celular cortando as células manualmente com uma agulha de vidro. Secção 3 do protocolo é dedicado a dois métodos de induzir a regeneração de estruturas celulares específicos (aparelhos de membranellar banda e oral): tratar as células com sacarose ou ureia conduz ao derramamento destas estruturas, seguido por seus regeneração. Secção 4 do protocolo detalha um método para o tratamento de imagens de regeneração de células individuais durante longos períodos de tempo. Secção 4 termina com a descrição dos estágios de regeneração e dicas sobre a análise da dinâmica de regeneração.
Protocolo
1. cultivo Stentor e estabelecer Stentor culturas de células únicas ou fragmentos de células
- Prepare Chlamydomonas reinhardtii cultura a ser usado como alimento para Stentor.
- Obter células Chlamydomonas reinhardtii de um fornecedor comercial (Tabela de materiais).
- Estabelecer uma cultura líquida 500ml de Chlamydomonas reinhardtii na mídia de torneira comercialmente disponíveis usando uma técnica estéril13.
- Conservar a cultura de Chlamydomonas sob uma lâmpada em uma concentração perto de saturação (no O.D. de cerca de 1) diluindo-lo com mídia de torneira duas vezes por semana.
Nota: A cultura de Chlamydomonas pode ser crescida em um shaker. - Verifique regularmente se a cultura de Chlamydomonas é saudável, colocando uma gota de cultura em um slide, cobrindo-o com uma lamela, e verificando-lo sob um microscópio na ampliação de X 40.
Nota: Não use a cultura para a alimentação de Stentor se está contaminado com bactérias ou células Chlamydomonas são agregadas em clusters. Se qualquer um destes problemas ocorre, inicie uma nova cultura de Chlamydomonas .
- Obter Stentor coeruleus células de um fornecedor comercial (Tabela de materiais).
- Se as células Stentor são necessários de seu habitat natural, recolhê-los de uma lagoa, lago ou Rio11.
- Para coletar Stentor de uma lagoa, lago ou rio, encontre uma área com alguma vegetação, onde a água está relativamente calmo, sombrio e clara.
Nota: Há uma maior probabilidade de encontrar Stentor nos locais onde cresce a lentilha. - Colete pelo menos 2 L de água em um recipiente que seja fácil verter.
- Depois de detritos e matéria particulada instalaram-se no fundo do recipiente, delicadamente preencha alguns recipientes menores para examinar para Stentor, esperando por alguns segundos após cada coleta de detritos resolver no recipiente grande.
- Concluída a coleta de amostras em um local, mover para um novo local que é pelo menos 10 m de distância e repetir a coleta de amostras lá.
Nota: Nem todos os lagoa tem uma população de Stentor , assim várias lagoas podem ter que ser amostrados. - Retornar com as amostras para o laboratório e transferir a água dos recipientes para pratos de Petri individuais.
- Em cada placa de Petri, procure Stentor sob um estereomicroscópio com luz rasante na ampliação de X 5. Transferência de células individuais de Stentor usando uma pipeta de 1 mL para um poço de uma placa de ponto de vidro contendo pelo menos 100 µ l de água de nascente pasteurizado comercialmente disponíveis (PSW).
Nota: Stentor células têm uma forma de trombeta, como quando eles estão conectados a um substrato (Figura 1). Células nadadoras Stentor são menos prolongadas do que as células ligadas a um substrato (vídeo 1). - Lave Stentor na PSW pelo menos 3 x. Executar as lavagens, removendo cerca de 90% da água do poço, mantendo as células Stentor no poço, seguido pela adição de 500 µ l do PSW dentro do poço.
Nota: Antes de manusear Stentor usando pipetas com pontas de pipeta de 10 µ l ou menor, cortar cerca de 0,5 mm a extremidade da ponta da pipeta com uma tesoura para evitar ferir as células devido a forças de cisalhamento geradas como uma grande célula flui através de muito pequeno de uma op de ponta SOS.
- Para coletar Stentor de uma lagoa, lago ou rio, encontre uma área com alguma vegetação, onde a água está relativamente calmo, sombrio e clara.
- Prepare-se antes de cada mamada de Stentor Chlamydomonas .
- Transferi 1 mL da cultura Chlamydomonas preparada como etapa 1.1 em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugar a 2.095 x g, durante 3 min.
- Remover o sobrenadante e resuspended a pelota em 1 mL de PSW. Centrifugar a 2.095 x g, durante 3 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 500 µ l do PSW.
Nota: Assim, lavado e concentrado Chlamydomonas será referido como "preparado Chlamydomonas"nas etapas a seguir. TORNEIRA de mídia é prejudicial à Stentor, assim, lavar Chlamydomonas antes alimentação Stentor é importante.
- Se houver necessidade de uma cultura de Stentor clonal, inicie a cultura de uma célula individual de Stentor ou um fragmento de célula.
- Desde que o único Stentor células não crescem bem em PSW, prepare a mídia condicionadas pelo filtro esterilizante 500 µ l de meios de comunicação de uma cultura de Stentor existente, saudável.
- Transferi 500 µ l de mídia condicionadas a um dos poços de uma placa de ponto de vidro.
- Transferi um Stentor dentro do poço da placa de ponto de vidro contendo mídia condicionadas. Use como pequeno meio possível para fazer a transferência.
- Alimentação de preparado Chlamydomonas , µ l cada Stentor 5 cada 48 h. Quando Stentor dividir, contar o número de células no poço e adicionar 5 µ l de preparado Chlamydomonas por célula.
- Manter Stentor em um lugar sombreado, desde que as células são sensíveis à luz (por exemplo, em caixas de plástico transparente coberto com toalhas de papel).
- Troca de Stentor médio no poço com meio condicionado fresco cada 96 h.
- Prepare a mídia condicionada fresca como na etapa 1.5.1.
- Fazer com que todas as células de Stentor desanexar do fundo do poço, pipetando suavemente o líquido subir e descer no poço.
- Aspire cuidadosamente com o líquido do bem usando uma pipeta de 1 mL, certificando-se de que todas as células permanecem no poço. Adicione 500 µ l de mídia condicionada fresca para o poço.
- Quando o número de células no poço for superior a 20, mova as células para um recipiente maior, por exemplo, um frasco de vidro de boca larga.
- Adicione 20 mL de PSW em um frasco de vidro de boca larga esterilizado.
Nota: Autoclave de vidro para Stentor pode ser substituído com o cuidado de lavar e enxaguar. - Pipete cuidadosamente a mídia acima e para baixo no poço para retirar todas as células do fundo do poço. Recolher todas as pilhas de Stentor usando uma ponta de pipeta de 1ml e delicadamente, transferi-los para o frasco de vidro.
- Adicione 20 mL de PSW em um frasco de vidro de boca larga esterilizado.
- Não aperte as tampas nos frascos com culturas de Stentor , para permitir o acesso suficiente para o ar.
- Adicione PSW na jarra cada 48 h para manter a densidade de Stentor a cerca de 20 células/mL. Estime a densidade de células pelo olho.
Nota: Como alternativa, use uma pipeta de 1 mL de ar de bolha na jarra para fazer células desapegar das paredes, pipeta de 1 mL da cultura e contar o número de células na ponta da pipeta. - Cada 48h, alimentos preparados Chlamydomonas Stentor culturas em frascos (veja etapa 1.4). Comece com a alimentação da cultura com 200 µ l de preparado Chlamydomonas. À medida que aumenta o volume da cultura, gradualmente aumente a quantidade de preparado Chlamydomonas utilizado para alimentação de até 1 mL.
- Quando o volume de cultura atinge cerca de 90% da capacidade do frasco, transferi a cultura para um recipiente maior.
- Pipete a cultura dentro do frasco, acima e para baixo, com uma pipeta de 1 mL para desanexar Stentor partir o vidro.
- Despeje todo o conteúdo do frasco em um recipiente de vidro de 2 xícaras.
- Lave o frasco com cerca de 25 mL de PSW no recipiente para coletar o restante Stentor2 chávenas de vidro.
- Manter saudáveis culturas em recipientes de vidro de 2 xícaras.
- Alimente Stentor culturas 2 mL do preparado Chlamydomonas por 100 mL da cultura a cada 4-5 dias. Adicione PSW para o recipiente de vidro em 4-5 dias para manter a densidade de Stentor a cerca de 20 células/mL.
Nota: 450 mL é o volume máximo que detém um recipiente de 2 xícaras. - Uma vez por semana, inspecione as culturas sob um 5x microscópio para rotíferos, fungos e outro crescimento de dissecção. Para prolongar a saúde da cultura, remova microrganismos contaminantes juntamente com células de Stentor anormalmente em forma e incolores com uma pipeta de 1 mL.
- Quando o recipiente de vidro é cerca de 90% completo, dividi a cultura.
- Adicione 25 mL de PSW para o recipiente de vidro. Use uma pipeta para pipetas de 25ml acima e para baixo para desanexar Stentor partir o vidro. Cerca de 50% da cultura de movimento em um recipiente de vidro 2-copo novo.
- Adicionar 25 mL de PSW para ambas as culturas e continuar mantendo as duas culturas, conforme descrito nesta seção do protocolo.
Nota: Desde Stentor células são sensíveis à alta temperatura, manter a temperatura do ambiente onde as culturas são mantidas a 25 ° C ou inferior. Alternativamente, as culturas podem ser mantidas em uma incubadora. Consulte a tabela 1 para solução de problemas de Stentor cultivo.
- Alimente Stentor culturas 2 mL do preparado Chlamydomonas por 100 mL da cultura a cada 4-5 dias. Adicione PSW para o recipiente de vidro em 4-5 dias para manter a densidade de Stentor a cerca de 20 células/mL.
2. indução de regeneração por corte Stentor células
- Usar um extrator de agulha para fazer várias agulhas de tubos capilares, usando o programa da seguinte maneira: calor - 735, pull - 100, velocidade - tempo 110, - 150, pressão - 400.
- Prepare uma solução de metilcelulose 4% em 50 mL de PSW.
- Adicionar 1 g de metilcelulose (viscosidade: 1500 cP) a 50 mL de PSW.
- Incube a 4 ° C, durante pelo menos 8 h facilitar a dissolução de metilcelulose.
- Manter a solução de metilcelulose 4% à temperatura ambiente.
- Prepare um prato de vidro local para armazenar os fragmentos de célula depois de executar os cortes.
- Filtro de esterilizar meios de comunicação de uma cultura saudável, 500 mL por placa de ponto de vidro bem precisava.
- Transferi 500 mL de mídia esterilizada em cada um dos poços necessários.
- Recolher uma saudável Stentor (tendo uma forma de trombeta definidas, cores vibrantes de azul e verde e sem grandes vacúolos) em uma gota de 2 µ l e coloque-o sobre uma lamela ou slide. Adicione 2 µ l de metilcelulose 4% (Figura 2). Deixe Stentor devagar antes de cortar (vídeo 2).
- Segure a agulha de vidro como paralela à superfície de corte quanto possível para evitar quebrar a agulha.
- Usando um estéreo microscópio de dissecção, localizar a ponta da agulha vidro e aproximá-la à célula (Figura 3A). Observe o contrato de Stentor em caso de contacto com a agulha (Figura 3B e C).
Nota: Se a célula estiver em uma orientação que faz separa a extremidade anterior da extremidade posterior difícil, girá-lo suavemente com o lado da agulha. - Pressione suavemente sobre a contratada Stentor com o lado da agulha vidro para cortar a célula em dois (Figura 3D e vídeo 3). Mova os dois fragmentos separados, assegurando que não haja nenhuma conexão citoplasmática entre eles, para evitar a fusão do fragmento (Figura 3F).
- Verifique se os dois fragmentos tem pelo menos um nó macronuclear cada examinando os fragmentos sob um microscópio dissecação com iluminação oblíqua.
Nota: Ter pelo menos um nó macronuclear é essencial para a sobrevivência da pilha. A célula pode lançar sua pellicle (escudo transparente), juntamente com o pigmento azul esverdeado durante ou após o corte. Na maioria dos casos, isso não afetará a viabilidade a longo prazo da célula. - Mova os fragmentos em poços de uma placa de vidro local preparado no passo 2.3.
- Corte várias células porque uma fração das células cortadas não se regenerará.
- Se efectuar cortes múltiplos em uma única sessão, substitua a agulha de vidro quando ele torna-se fortemente revestido com resíduo de Stentor ou quando sua ponta está quebrada. Em alternativa, limpe a agulha suavemente sobre um pedaço de espaçador de silicone.
Nota: As agulhas de vidro podem ser usadas para várias sessões de corte de célula. - Mantenha o prato de vidro local com fragmentos de células em uma câmara de umidade.
- Prossiga para a secção 4 do protocolo para obter detalhes sobre a imagem e a interpretação dos resultados de regeneração Stentor .
3. indução de regeneração de banda Membranellar e aparelhos orais por sacarose ou tratamento de ureia
- Membranellar uma remoção de aparelhos de banda e oral usando sacarose
- Prepare uma solução de 25% de sacarose em PSW.
- Adicione 500 µ l de 25% de sacarose em PSW para um tubo de microcentrifugadora com uma tampa de pressão.
- Prepare-se para lavar as células após o tratamento de sacarose 3 microcentrifuga tubos com tampas de pressão com 1 mL de PSW em cada tubo.
- Recolha pilhas de Stentor 30-60 em 1 mL de seus meios de cultura para um tubo de microcentrifuga separadas usando uma pipeta de 1 mL (Figura 4, seta A).
- Recolha todas as células do tubo em volume de final 125 µ l usando uma pipeta de 200 µ l em um único sorteio. Transferi-los para o tubo com 500 µ l de 25% de sacarose (preparado na etapa 3.1.2) para obter 625 µ l da solução de sacarose 20% (Figura 4, seta B). Inicie um cronômetro.
- Incube Stentor nesta solução de sacarose 20% e flick-gire o tubo microcentrifuga no rack para 1 min.
- Recolher todas as células em um único empate (ajustar a pipeta para capacidade máxima de 200 µ l de coleção mais fácil).
- Manter as células na ponta da pipeta, até que o cronômetro mostra 2 min de tratamento de sacarose.
- Ejete Stentor em um dos tubos microcentrifuga preparados no passo 3.1.3 (Figura 4, seta C). Filme-gire o tubo no rack.
- Lave as células duas vezes mais, uma vez em cada um dos dois restantes microcentrifuga tubos contendo PSW preparada no passo 3.1.3 (Figura 4, setas, D e E).
Nota: A técnica de coleta de célula único draw não é importante entre as lavagens. - Prossiga para a secção 4 do protocolo para detalhes nas imagens e interpretação da dinâmica de regeneração de Stentor (Figura 4, as setas F e G).
- Membranellar uma remoção de aparelhos de banda e oral usando ureia
- Prepare uma solução de 4% de ureia em PSW.
- Adicione 300 µ l de 4% de ureia em PSW para um tubo de microcentrifugadora com uma tampa de pressão.
- Prepare 3 microcentrifuga tubos com tampas de pressão contendo 1 mL de PSW em cada tubo para lavagem das células após o tratamento de ureia.
- Recolha pilhas de Stentor 30-60 em 1 mL de seus meios de cultura para um tubo de microcentrifuga separadas usando uma pipeta de 1 mL (Figura 4, seta A).
- Recolha todas as células do tubo em volume de final 300 µ l utilizando uma pipeta de 1ml em um único sorteio. Transferi-los para o tubo com 300 µ l de 4% de ureia (preparado no passo 3.2.2) para obter 600 µ l da solução de ureia 2% (Figura 4, seta B). Inicie um cronômetro.
- Incube Stentor nesta solução de 2% de ureia e flick-gire o tubo microcentrifuga no rack para 1 min.
- Recolha todas as células em um único sorteio.
- Manter as células na ponta da pipeta, até que o cronômetro mostra 2 min de tratamento de ureia.
- Ejete Stentor em um dos tubos microcentrifuga preparados na etapa 3.2.3 (Figura 4, seta C). Filme-gire o tubo no rack.
- Lave as células duas vezes mais, uma vez em cada um dos dois restantes microcentrifuga tubos contendo PSW preparada na etapa 3.2.3 (Figura 4, setas, D e E).
Nota: A técnica de coleta de célula único draw não é importante entre as lavagens. - Prossiga para a secção 4 do protocolo para detalhes nas imagens e interpretação da dinâmica de regeneração de Stentor (Figura 4, as setas F e G).
4. imagem latente e analisando a regeneração celular
- Se usando um microscópio vertical, use o enforcamento método da gota para regeneração de imagem de células individuais.
- Coloque 100 µ l de PSW num poço de uma placa de ponto de vidro.
- Isolar a 1 célula de Stentor em 4 µ l de cultura mídia (o que eles estão em), usando um 10 ou 20 µ l Pipetar. Depósito da gota no meio de uma lamela de2 22 x 22 mm (Figura 5).
Nota: Se as células que estão 1) insalubre (anormalmente em forma ou fortemente vacuolated) ou 2) ainda tem bandas de membranellar ou aparelhos orais (para experiências de tratamento químico), não use para a imagem latente. - Organize 4 mais gotículas de Stentor nos meios de cultura em torno da gota anterior, deixando espaço suficiente entre as gotas.
- Inverta a lamela com gotículas e delicadamente, coloque-o sobre o poço da placa de vidro local ao qual PSW foi adicionado no passo 4.1.
- Nota: PSW no poço irá minimizar a evaporação de gotas (Figura 5).
- Prepare as células restantes para a imagem latente, seguindo passos 4.1.1 - 4.1.4.
- Imagem as regenerar células sob um microscópio com a resolução de tempo desejado. Alternativamente, observe a regeneração usando um microscópio estéreo dissecação.
Nota: A regeneração começará imediatamente após o corte de célula ou tratamento com sacarose ou ureia. No entanto, visíveis novas estruturas orais formarão cerca de 3h após o início da regeneração.
- Para cada ponto de tempo, atribua um dos três estágios de regeneração para cada uma das células. Para fazer isso, compare cada célula para as imagens representativas, ilustrando as fases (Figura 4 e Figura 6).
- Atribua a fase 1 para as células que não têm ainda uma banda de membranellar (figura 6A).
- Atribua a fase 2 para as células com uma banda de membranellar.
Nota: Uma banda de membranellar aparece 3-6 h após o tratamento (Figura 4, Figura 6B). No final desta fase, uma curvatura adicional da extremidade posterior da banda membranellar aparecerá antes de um Primórdio oral aparece. - Atribua a fase 3 para as células com um Primórdio oral.
Nota: Um Primórdio oral é uma invaginação aparecendo 6-8 h após o tratamento na extremidade posterior da banda membranellar (Figura 4, Figura 6 e 6 D). Regeneração é concluída quando as células têm uma banda de membranellar na sua extremidade anterior e a forma de célula de trompete característico (Figura 4, Figura 6E). A maioria das células de Stentor são totalmente regeneradas dentro de 8-9 h desde o início da regeneração.
- Traça a percentagem de células em cada uma das etapas de regeneração para cada ponto de tempo, sob a forma de uma trama de caixa empilhada (Figura 7).
Nota: Este tipo de enredo permite a visualização da dinâmica da regeneração em uma população de células.
Resultados
Stentor culturas foram confiantemente estabelecidas e mantidas de células individuais ou fragmentos de células usando a secção 1 do protocolo. Um exemplo representativo de uma cultura saudável grande é mostrado no vídeo 1.
O curso de tempo de regeneração foi medido em Stentor , usando o método de tratamento de sacarose para iniciar a regeneração descrita no passo 3.1, combinado com a imagem e o método de análise, discutido na seção 4 (Figura 7). Este enredo indica que há uma propagação de uma hora de duração no tempo levado pela população de células para alcançar qualquer estágio particular. Este tipo de análise permite o estudo da heterogeneidade temporal no processo de regeneração em uma população de regenerar as células.
A seguir está um resumo de tempo de regeneração que tem sido observado até agora depois de dezenas de tratamentos de sacarose (Figura 4 e Figura 6). Fase 1 é quando as células Stentor parecem lágrimas sem qualquer banda de membranellar (nesta fase começa imediatamente após o fracasso de sacarose). Este estágio dura de 3-6 h 2 fase é quando uma banda membranellar aparece e cresce (3-6 h após o tratamento de sacarose). Este estágio dura de 3-4 h.. fase 3 é quando um Primórdio oral aparece na extremidade posterior da banda membranellar (6-8 h após o tratamento de sacarose), e ambas as estruturas são movidas em direção a extremidade anterior da célula. Esta fase tem a duração de 1-2h. Quando tanto a banda membranellar e o aparelho oral alcançou a extremidade anterior da célula, isto indica a conclusão da regeneração. A célula adoptou a forma de trombeta-como característica Stentor . As células foram completamente regenerada 8-9h após tratamento de sacarose.
Figura 1. Instantâneo de Stentor. A banda membranellar e os aparelhos orais são mostrados na extremidade anterior da célula. O holdfast está na extremidade posterior da célula. Stentor Macronúcleo é noduladas. Um bem alimentados Stentor tem verdes comida vacúolos contendo principalmente Chlamydomonas. Barra de escala é 0,5 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Instalação de corte Stentor . Corte de célula é executada manualmente manipulando uma agulha de vidro enquanto olha para a célula, usando um microscópio estéreo dissecação comercialmente disponível. O propósito o lenço de papel é fornecer o fundo branco para ver melhor as células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Instantâneos de vídeo 3 ilustrando como cortar um Stentor com uma agulha de vidro. (A) A Stentor imediatamente antes da agulha toca nela. (B) A Stentor suavemente espremido entre uma lâmina de vidro e agulha. (C) A contratada Stentor , reagindo à força da agulha. (D) A Stentor corte pressionando suavemente na célula com o lado da agulha. (E) A Stentor agora cortado em dois, mas não separados. Dois fragmentos de Stentor (F). Barra de escala é 0,25 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Visualização esquemática da seção 3 e seção 4 do protocolo. Este é um protocolo ilustrado para a realização de sacarose ou tratamento de ureia e observação de regeneração celular. O tempo indicado no painel de fundo é medido desde o início da lavagem 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. A configuração para a observação de imagens e/ou direta de regeneração com um microscópio ereto. Em cada gota de µ l 4 pendurados em lamela, há uma célula em fase de regeneração. Água dos poços da placa de vidro local limita a evaporação das gotas. Esta configuração permite que após a regeneração de várias células em paralelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Instantâneos de Stentor em cada estágio da banda membranellar e a regeneração de aparelho oral. (A) estágio 1 é caracterizado por uma forma de lágrima, como celulares e a ausência da banda membranellar. (B) fase 2 caracteriza-se pelo aparecimento da banda membranellar, uma estrutura baseada em cílios que bate continuamente. Membranellar bandas são marcadas com linhas tracejadas brancas em painéis B - D. (C e D) estágio 3 é caracterizado pelo aparecimento do primórdio oral (marcado com uma seta). Primórdio oral parece uma invaginação na extremidade posterior da banda membranellar. O Primórdio oral então vai subir para a parte anterior da célula tornar-se o aparelho oral. (E) regeneração é concluída quando a célula tem adotado a característica forma de trombeta, como Stentor , e o aparelho bucal (marcado com uma seta) alargou-se na extremidade anterior da célula. Barra de escala é 0,25 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Empilhado apresentando enredo de caixa como proporções de células em todas as fases da regeneração após tratamento de sacarose muda ao longo do tempo. A trama mostra a heterogeneidade no calendário dos estágios de regeneração dentro de uma população de células de regeneração. "Fim de reg." indica a conclusão da regeneração. O número de células: 28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo de 1. Exemplo de uma cultura saudável de Stentor . Geralmente, se uma cultura é concentrado, dividindo a cultura é recomendado. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2. A abrandar Stentor com metilcelulose. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo de 3. Corte Stentor. Células individuais podem ser cortadas manualmente em várias peças sob um estéreo microscópio de dissecção pressionando uma agulha de vidro através da célula. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
| Problema com cultura | Possível solução | Prevenção de possível |
| Cultura é oprimida por rotíferos ou outros organismos grandes. | Remova tantos Stentor quanto possível, para uma nova placa de cultura. Em seguida lave as células três vezes. | Lave Stentor quando recebê-los, mesmo quando compra-los de um fornecedor comercial. |
| Cultura é oprimida por fungos ou outros organismos pequenos. | Identificar um canto onde há o mínimo Stentor. Nessa área, remover a mídia tanto quanto possível, sem remover muitos Stentor e adicione novo PSW. Misture delicadamente mas completamente para distrubute os organismos invasores. Saltar a próxima refeição e o Stentor comerem. | Observar a cultura regularmente e remover contaminantes pequenos através da troca de mídia para fresco PSW. |
| Stentor está deitado em cima um do outro. | Dividi a cultura para que a concentração seja inferior a 20 células/mL. | Dividir as culturas mais vezes. |
| Células de Stentor estão acasalando. | Alimente a cada 4 dias em vez da cada 5 dias. | |
| A cultura tem um monte de material escuro de resíduos. | Retire o máximo do material escuro, resíduos de Stentor , quanto possível, sem retirar as células. Se Stentor são anexados ao material escuro, pipete acima e para baixo para liberar as células Stentor de seus resíduos e em seguida, remova a mídia com o lixo sem remover as células. Ou, remover aqueles Stentor e alimentar adequadamente menos. | Alimentação Stentor 1ml menos comida por 100 mL de cultura. |
| Insalubre para o futuro (vacuolated/inchado ou arredondados) Stentor. | Remover mídia tanto quanto possível, sem remover muitas células Stentor e adicionar novo PSW. | Troca a mídia regularmente. |
Tabela 1. Guia de solução de problemas para cultivo Stentor.
Discussão
Cultivo de Stentor apresenta uma série de desafios. Em primeiro lugar, para realizar experimentos que exigem um grande número de células, é necessário manter um grande número de culturas Stentor , como as culturas se tornam insalubres quando Stentor concentração excede 20 células/mL. Em segundo lugar, os organismos que podem contaminar Stentor culturas muitas vezes dividem mais rápido que Stentor e oprimem a cultura (um contaminante comum é rotíferos). Assim, é necessário verificar periodicamente o a cultura sob um microscópio e remover os contaminantes. Ocasionalmente, uma nova cultura precisa ser iniciado a partir de um pequeno número de células manualmente resgatou uma cultura contaminada. Isto aumenta o tempo necessário para se manter saudável Stentor culturas. Em terceiro lugar, expandindo uma única célula em uma cultura de 400 mL requer pelo menos um mês, porque o ciclo celular de Stentor é 3-5 dias. Em quarto lugar, ao contrário de outro modelo ciliados, Stentor raramente entram em forma de cisto e eles não podem ser congelados.
Um aspecto importante de cultivo Stentor é a seleção de um organismo de alimentação adequada. Vários métodos para cultivo Stentor foram descritos anteriormente. Um deles sugere para usar leite desnatado para bactérias de cultura que alimentam então Stentor. Tal técnica é eficaz em cultivo Stentor; no entanto, aplicação de técnicas de genômicas requer amostras puras para evitar confusões resultantes de leituras genômicas de organismos comida indefinido. Usando o protocolo atual, Stentor podem ser cultivadas em massa e, porque a comida deles, Chlamydomonas, foi sequenciada, a presença de contaminação genômica do organismo comida pode ser detectada e controlada para. Por razões desconhecidas, o tártaro tinha que reabastecer seus estoques, retornando para onde ele encontrou Stentor antes. Com o protocolo atual, fomos capazes de manter Stentor por anos.
Experimentos de regeneração com Stentor são geralmente simples, mas existem alguns detalhes importantes para manter em mente. Em relação à seção 2, corte Stentor células ao meio podem ser dominadas em minutos. Dominar os procedimentos mais avançados Microcirurgia de Stentor pode exigir uma semana de treinos. Enquanto realizando um tratamento de sacarose ou de ureia (seção 3), se no início da imagem latente, a maioria das células ainda tem suas bandas membranellar, aumentar o tempo de incubação por 10-30 s para quando o tratamento de sacarose é executado em seguida. Não aumentam o tempo de tratamento de sacarose, além de incubação de 3 min porque ele irá resultar em morte celular.
Imagem de Stentor regeneração requer métodos de grandes células de imagem durante longos períodos de tempo. O método de imagem detalhado na seção 4 só pode ser usado com um microscópio vertical. Se um microscópio invertido está disponível, em vez disso, as células podem ser colocadas em um slide ou lamela em câmaras pequenas. Um método é criar uma câmara sem vaselina e cobrir com outra lamela para evitar a evaporação. Alternativamente, uma câmara para uma célula individual pode ser feita por fazer um buraco com um furador do tamanho desejado em um 1 x 1 cm2 quadrados de espaçador de silicone (tabela de materiais), colocação do espaçador em uma lamela, colocando as células na câmara e cobrindo a câmara com outra lamela. Quando a imagem, se não vai a orientação correta para observar as características de cada etapa de regeneração Stentor , toque a placa firmemente, para fazer o contrato de célula. Assistir a célula estender para identificar o estágio de regeneração (extensão completa leva cerca de 45 s). Se a célula estiver ainda na orientação errada, repita as batidas. As imagens mostradas na Figura 1 e Figura 6 foram tiradas por um microscópio estéreo zoom; no entanto, todos os experimentos detalhados podem ser executados usando um 5 X estéreo microscópio de dissecção.
Outro desafio além de cultivo e imaging Stentor é o rastreamento de regeneração, especificamente a quantidade de tempo necessário para identificar estágios. Se a regeneração celular está perfeitamente orientado com a região do primórdio oral claramente visível, a identificação do estágio leva alguns segundos. Às vezes, no entanto, a célula de Stentor é em uma orientação impedindo a clara atribuição de fase de regeneração, tendo assim mais tempo para identificar. A quantidade significativa de tempo necessário para a fase de regeneração de células individuais podem atrasar a quantificação de todas as células em regeneração, diminuindo assim a precisão temporal do estadiamento e exigir que o observador para esperar e refazer a imagem da célula depois mudou-se para uma nova orientação. Consequentemente, esta experiência é tanto tempo e trabalho intensivo. Por estas razões, seria altamente desejável para desenvolver métodos automatizados para detectar células Stentor e atribuição de estágios de regeneração em dados de vídeo microscopia. Estas também permitiria mais experimentos reprodutíveis, aumenta o tamanho da amostra e a remoção de viés humano.
O surgimento de métodos altamente sensíveis, genômicos e proteômica, começou-se a colocar estudos de células únicas em alcance. Para tais análises de célula única, o tamanho gigante de uma célula de Stentor torna desejável cobaia para experimentos de prova de conceito. Para tais experiências ser possível, cultivo Stentor é fundamental, e então os métodos descritos aqui devem desempenhar um papel no desenvolvimento de técnicas mais avançadas de célula única.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH grant R01 GM113602 (WFM) e NSF 1144247 (AL). Reconhecemos o Mark Slabodnick e Natalie Kirkland para desenvolver as versões iniciais de alguns desses protocolos e discussões informativas. Agradecemos a Karina Perlaza e Greyson Lewis pela leitura crítica do manuscrito.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Stentor coeruleus cultura viva | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii em ágar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Água de nascente pasteurizada, garrafa de 1 litro | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Metilcelulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Placa de vidro Pyrex | Fisher Scientific | 13748B | |
| Frasco de vidro de boca larga com tampa de rosca, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| Recipiente de vidro de 2 xícaras com tampa de vidro | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell material de folha de silicone | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL tubo de microcentrífuga | Denville | C2170 | |
| Tampa de Vidro | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, otimizado para cultura Chlamydomonas | ThermoFisher | A1379801 | |
| Espaçador de silicone, folha de silicone CultureWell, 0.25mm de espessura/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolato, vaselina, | White Spectrum P1037 | ||
OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, comprimento: 10 cm. | Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Extrator de agulhas P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 microscópio estéreo | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, microscópio estéreo com zoom | Zeiss |
Referências
- Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular "vitalism". Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
- Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
- Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
- Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
- Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
- Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
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- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
- Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848(2013).
- Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861(2014).
- Harris, E. The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).
Reimpressões e permissões
