Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

Summary

O objetivo do presente protocolo é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos isolados de não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Este protocolo envolve congelado amostras de tecido intestinal humano, cryosectioning, coloração etanólica e desidratação, LCM, a preparar e a extração do RNA.

Abstract

A finalidade desse método é obter amostras de alta integridade do RNA dos gânglios entéricos colhidos não fixado, recém-ressecados tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). Nós identificamos cinco etapas do fluxo de trabalho que são cruciais para a obtenção de RNA isolados de gânglios entéricos com qualidade e quantidade para RNA-Seq Em primeiro lugar, ao preparar o tecido intestinal, cada amostra deve ter excesso de líquido removido pela mancha antes de achatamento do serosa, tanto quanto possível através da parte inferior dos moldes base grandes. Amostras são então rapidamente congeladas em cima de uma pasta de gelo seco e 2-methylbutane. Em segundo lugar, quando cortar o tecido, é importante para a posição cryomolds para que seções intestinais paralelo ao plano completo do Plexo mioentérico, produzindo, assim, a maior área de superfície dos gânglios entéricos por slide. Terceiro, durante a LCM, polietileno napthalate (caneta)-slides de membrana para oferecer a maior velocidade e flexibilidade para delinear as formas não-uniforme dos gânglios entéricos quando coletando gânglios entéricos. Em quarto lugar, para visualização distinta dos gânglios entéricos dentro de seções, etanol-compatível com corantes, como Violet cresilo, oferecem excelente preservação da integridade do RNA em relação a corantes aquosos. Finalmente, para a extração de RNA de gânglios capturados, observamos diferenças entre jogos comerciais da extração do RNA que rendeu superior quantidade de RNA e de qualidade, ao eliminar a contaminação de DNA. Otimização desses fatores no atual protocolo grandemente acelera o fluxo de trabalho e produz amostras de gânglios entéricos com excepcional qualidade de RNA e quantidade.

Introduction

Este método foi projetado para obter amostras de RNA de alta qualidade dos gânglios entéricos do tecido intestinal humano usando laser captura microdissection (LCM). O protocolo descrito aqui foi otimizado para fornecer qualidade de RNA e rendimentos suficientes para o RNA (RNA-seq) de sequenciamento e destina-se a ser usado com o recém-ressecados, não fixado, congelado tecido intestinal humano.

Transtornos da motilidade gastrointestinal e intestino funcional afetam um em cada quatro pessoas nos Estados Unidos. O sistema nervoso entérico (ENS), também conhecido como o segundo cérebro¹, muitas vezes está no centro des....

Protocol

Todos os protocolos aqui descritos foram aprovados pela Vanderbilt University institucional Review Board (IRB).

1. preparação antes da chegada do tecido

1. Obter a devida aprovação do IRB e coordenar com as agências de doação de órgão humano para obter o tecido intestinal não fixado, recém-ressecados de doadores que atendam todos os critérios de pesquisa necessários para o estudo.
   Nota: Este protocolo pode ser adaptado para uso com ratos e outros roedores modelos.
   1. Imediatamente após a ressecção de cada segmento intestinal, lave minuciosamente o lúmen com PBS refrigerados ou meio de armazenamento de tecido para remover mate....

Results

Fizemos várias melhorias para protocolos existentes que permitem a coleção relativamente rápida dos gânglios entéricos de amostras intestinais humanas usando LCM, atendendo aos padrões de RNA-Seq Primeiro, nós aperfeiçoamos a congelação rápida de segmentos de tecido intestinal em grandes moldes base colocados na superfície de uma suspensão de gelo seco em 2 MB (Figura 1B). O melhor sucesso durante cryosectioning e subsequente LCM foi obtido m.......

Discussion

Este procedimento possibilita a coleta eficiente de inúmeros gânglios entéricos como uma fonte para derivar do RNA para RNA-Seq Aqui, nós temos acelerado os processos descritos nos protocolos existentes, maximamente, preservando a integridade do RNA. Como todas as etapas neste procedimento são interdependentes, é importante que todas as questões sejam eliminados desde o início do estudo e que todas as amostras são preparadas como da mesma forma um ao outro quanto possível, para obter confiança RNA-Seq

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalina tamponada neutra	Sigma	HT501128-4L
2-Metilbutano	Seringa Fisher	O3551-4
3-mL	BD	309628
tubos cônicos de 50-mL, polipropileno	Moldes de base Corning	05-526B
37x24x5mm, descartáveis	Ciências de Microscopia Eletrônica	5025511
Belzer UW  Solução de armazenamento a frio	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM tampas	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press' n Selo	Que bom que	N.A.
Acetato Violeta Cresyl	Acros Organics	AC405760025
Corte	Microscopia Eletrônica Sciences	63308
Pharmco-AAPER	111000190 Etanol		à prova de 190
Pharmco-AAPER	111000200		prova de 200
Fisher		12-550-343
Luvas, punho estendido	Microflex
Batas, cirúrgicas-descartáveis	Kimberly-Clark	19-088-2116
Bandeja, 20 L (grande panela esterilizadora de polipropileno)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (grande)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (pequenos)	Kimberly-Clark	34133
Sistema de Microdissecação por Captura a Laser (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Mandril de Criostato Leica, grande,  40 mm	Serviço de Instrumentos de Patologia do Sudeste	N.A.
Microscópio de luz	Olympus	CX43
Objetiva de microscópio (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0,50, ∞/0,17	N.A.
Objetiva de microscópio (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Peneiras Moleculares	Acros Organics	AC197255000
Água livre de nuclease	Ambion	AM9937
Kit de extração de RNA PicoPure	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrana LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
Tubos livres de RNase, 1,5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Kit	Sigma Sigma-R2020
"A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
Kit de Extração de RNA "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
Método de extração de RNA "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
Kit de extração de RNA "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, protetor facial descartável	Fisher	17-310
Tesoura, Cirúrgica, 14,5 cm "sharp-sharp"	Ferramentas de Ciência Fina	14002-14
Filtro de seringa, acetato de celulose (0,2 μ m)	Nalgene	190-2520
Meio de congelamento de tecidos	Gerais Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL