Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

O uso de modelos murino para imitar a doença de rim humano está se tornando cada vez mais comum. Tais modelos murino incluem modelos espontâneos como espontaneamente hipertensos (SHR) de ratos¹, estreptozotocina (STZ)-induzida ratos diabéticos e ratos², e o db/db tipo II ratos diabéticos³, modelos geneticamente modificados tais como primário podocyte específicas focal segmentar glomerular esclerose (FSGS) modelos⁴, o específico das endotelial fator de crescimento vascular (VEGF-A) nocaute (KO VEGF-A) modelo⁵, e a síndrome de Alport modelos⁶e adquiriu modelos como o de nefrectomia 5/6,⁷ e o modelo de obstrução ureteral unilateral (UUO)⁸. A fim de avaliar os diferentes aspectos da função glomerular nestes modelos, várias técnicas estão disponíveis. O propósito deste trabalho método é demonstrar um completo check-up deve ser executada em modelos do rato da doença renal para avaliar plenamente a função glomerular.

A lógica por trás do uso deste método é que ele permite que o fenótipo glomerular ser completamente avaliada de múltiplos aspectos. Isso inclui avaliar a permeabilidade glomerular, a proteína e a água, o glomerulares anormalidades estruturais e mudanças na expressão/emenda de mRNAs e proteínas essenciais para a função glomerular normal. Usando esse método, o pesquisador é capaz de determinar o fenótipo de rim do modelo e avaliar o mecanismo quanto por que desenvolve o fenótipo. Esta é a informação vital sobre o mecanismo da doença, que é necessária, ao examinar o potenciais terapêuticas avenidas nesses modelos.

Na literatura, é uma ocorrência comum para ser apresentado com um modelo do rato da doença glomerular, onde o fenótipo é determinado por um aumento do nível de albumina na urina. No entanto, há evidências que sugerem que um único método para determinar a função glomerular não é sempre eficaz; apenas medir a taxa de excreção de albumina urinária ou a creatinina urinária de albumina (uACR) fornece informações sobre a função renal total e não de glomérulos individuais. Estudos anteriores demonstraram que a permeabilidade pode variar em diferentes glomérulos do mesmo rim^5,9,10. Além disso, a avaliação da permeabilidade dos glomérulos individuais é uma maneira mais sensível de avaliação de função glomerular; a técnica de medir a permeabilidade de água glomerular individual (L_pA / V e_eu) tem demonstrado ser mais sensível às mudanças na função glomerular do que medir a uACR⁹. Este ensaio é benéfico em modelos do rato que são resistentes a proteinúria, tais como os de um fundo de c57BL/6¹¹. A vantagem do papel presente método é que ele examina a total permeabilidade renal de albumina, bem como a permeabilidade glomerular individual para água.

Exame de anormalidades estruturais glomerulares é muitas vezes avaliado por uma bateria de manchas, tais como ácido periódico Schiff (PAS), tricromo e manchas de prata. Estes permitem uma patologista renal treinada avaliar o nível de doença renal, através de um método de pontuação. Apesar de todos os bons métodos, alterações à macroestrutura glomerular não são sempre observados na lesão renal aguda modelos¹². Este método propõe que além de realizar as técnicas de histologia renal descritas acima, a ultraestrutura glomerular também deve ser avaliada através de microscopia eletrônica (EM). Um glomérulo manchado pode parecer relativamente normal sob um microscópio de luz normal; no entanto, após avaliação com EM, pequenas mudanças na largura da membrana basal glomerular (MBG), apagamento de processo podocyte pé, fenestrações endoteliais e a cobertura do espaço sub-podocyte é analisado. Portanto, é vital que a ultraestrutura glomerular e a microestrutura é avaliado para determinar o mecanismo da disfunção glomerular.

Além de avaliar anormalidades glomerulares estruturais, alterações em mRNA e expressão de proteínas e de emenda, bem como ativação de proteína (por exemplo, a fosforilação), devem ser examinadas para elucidar ainda mais os mecanismos de doença glomerular. Quando se olha para uma doença glomerular, ou, por exemplo, quando KO/over-expressing um gene especificamente em células glomerulares, como por exemplo o podocyte específico VEGF-A KO rato⁵, é importante que as alterações da proteína e do mRNA são examinadas apenas dentro do células glomerulares e não o rim. Este protocolo descreve um método em que os glomérulos são isolados do córtex renal do mouse, e então o proteína/RNA são isolados. Isto permite a análise da desregulação da proteína/mRNA em glomérulos do modelo de doença.

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular, permitindo uma vasta quantidade de informações sobre o rim e função glomerular para ser obtido um único rato. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com a legislação de UK e aprovação do Comitê de ética local. Estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Bristol Comitê de ética de pesquisa.

1. urinária albumina creatinina (uACR)

Nota: O uACR é usada para avaliar a permeabilidade da GFB à albumina. A presença de albumina na urina indica aumento da permeabilidade do outro lado da GFB, que é normalizado para creatinina para controle das variações de taxa de fluxo de urina. Albuminúria é um marcador comum de doença renal crônica.

1. Colete a urina para a linha de base experimental e em intervalos regulares (uma vez semanal para uma vez mensal) até o ponto de extremidade experimental.
2. Configure gaiolas metabólicas de rato com dieta de água e de enriquecimento. Coloque os ratos (sexo masculino, idade 6-8 semanas) em gaiolas individuais para 6 h em um quarto silencioso.
3. Retorno ratos para habitação regular e coletar urina de jaulas vazias. Um mínimo de 50 µ l é necessário.
   Nota: Se o mouse não produz urina no tempo determinado, repeti no outro dia em uma sala quente.
4. Centrifugar a urina a 500 x g durante 10 min. coletar a urina e reter sedimentos para avaliar a perda de podocyte. Armazene a urina a-20 º C a curto prazo, neste momento.
5. Dilua a urina em 1% albumina de soro bovino (BSA) em 1 x Tris tamponada salino (pH 7.5 de TBS) em um 1: 500 para diluição de 1: 10000, dependendo da gravidade da albuminúria.
   Nota: O volume final deve ser > 400 µ l. otimizar para determinar a diluição certa em cada ponto.
6. Quantificar a concentração de albumina urinária usando um rato albumina enzima vinculada do ensaio da imunoabsorção (ELISA) segundo as instruções do fabricante.
   1. Brevemente, revesti a placa de ELISA, que é otimizada para a ligação às proteínas, com 100 µ l do anticorpo primário anti-rato albumina (10 µ g/mL em 0,5 M pH de carbonato de bicarbonato 9.6) por 1h à temperatura ambiente.
   2. Anticorpo excesso de lavagem dos poços cinco vezes com 1 x TBS mais 0,05% Tween (pH 8.0) e adicionar 200 µ l de solução (1 x TBS com pH de 1% BSA 8.0) durante a noite à temperatura de bloqueio.
7. Lavar a placa cinco vezes e adicionar 100 µ l dos padrões (diluição serial: 2000 µ g/mL 15.63 µ g/ml em 1 x TBS com 1% de BSA, pH 8.0), o espaço em branco e as amostras diluídas em triplicado. Deixe por 1h à temperatura ambiente, em seguida, lave o prato cinco vezes.
   1. Adicione 100 µ l de anticorpo de detecção de HRP a cada poço (10 ng/mL em 1xTBS com 1% de BSA, pH 8.0) e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Lavar a placa cinco vezes e adicionar 100 µ l de solução de substrato de enzimas a cada poço. Deixar o prato no escuro para desenvolver por 15 min e pare a reação adicionando-se 100 µ l de ácido sulfúrico de 0,18 M (H₂SO₄).
      Cuidado: H₂para₄ é corrosivo.
8. Determinar a concentração de albumina de cada amostra, lendo a placa em uma absorvância de 450 nm. Use a curva padrão para quantificar a albumina, presente em cada amostra. Se as repetições técnicas tem um valor de CV superior a 5%, repeti o ensaio para as amostras.
9. Alternativamente, avalie a concentração de albumina urinária usando electroforese. Adicione 5 µ l de 4x do tampão de carregamento de amostra de proteína a 15 µ l de urina. Aquecer as amostras para 95 ° C por 10 min e em seguida carregar em um gel de Tris prefabricados de 4-12%.
   1. Funcione o gel em 100 V e mancha a noite em azul de Coomassie por protocolo do fabricante.
   2. Depois da imagem latente do gel, use densitometria para avaliar a concentração de albumina prega mudança em relação ao controle.
      Nota: Se não há bandas são observadas para albumina quando esperado, avaliar a concentração de proteína da urina e ajustar o volume da urina adicionado ao gel.
10. Dilua a amostra de urina cru na dH₂O às 01:10, 1:5 e 1:1.
    Nota: O volume final deve ser > 70 µ l. otimizar para determinar a diluição certa de cada amostra.
11. Quantificar a concentração de creatinina urinária usando um ensaio químico por instruções do kit. Brevemente, carrega 20 µ l de creatinina padrões, em branco, ou diluídos urina para um prato bem 96 em triplicado.
12. Determinar a concentração de creatinina de cada amostra, lendo a placa em uma absorvância de 490 nm antes e após a adição da solução de ácido (cuidado, corrosivo; evitar contato com a pele).
    Nota: A diferença entre os valores de absorvância é diretamente proporcional à concentração de creatinina em cada amostra. Uma curva-padrão é a geração dos padrões. Se as repetições técnicas tem um valor de CV superior a 5%, repeti o ensaio para as amostras.
13. Gere a uACR (µ g/mg). Normalize os dados para o valor de base de cada rato para a representação gráfica.

2. tecido e coleta de sangue

Nota: O rim e tecido glomerular podem ser usados para avaliar estruturais, proteínas e RNAm marcadores de expressão da doença renal. O sangue pode ser usado para avaliar os marcadores da função renal, tais como a creatinina, que pode ser regulada até na doença renal, indicando uma redução da capacidade de filtração dos glomérulos.

1. Preparar as seguintes soluções: fresco glutaraldeído 2,5% em cacodylate de sódio 0,1 M (pH 7,3), paraformaldeído 4% em 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS), solução de Ringer mamíferos (115 mM de cloreto de sódio (NaCl), acetato de sódio de 10 mM (CH₃COONa), 1.2 mM de fosfato de sódio (Na₂HPO₄), 25mm bicarbonato de sódio (NaHCO₃), 1,2 mM de sulfato de magnésio (MgSO₄), 1 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂), glicose D (+) de 5,5 mM, pH 7,4) com 1% de BSA e 1X PBS.
   PRECAUÇÃO: o glutaraldeído 2,5%: toxic, sensibilizador, irritante; Use em um armário de emanações. 0,1 cacodylate de sódio M: tóxico, uso em um armário de emanações. 4% PFA: fixador, uso no armário de emanações
2. Preparar os seguintes materiais: isoflurano, ácido pequeno ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-revestido tubos de sangue, agulhas de 23 a 25G, 5 mL EDTA revestido seringas, frascos de vidro de 10 mL, 10 mL frascos de plástico, tubos de plástico de 0,5 mL, moldes tecido descartável, gelo seco, líquido N ₂, instrumentos cirúrgicos do mouse e meio de corte ideal (OCT).
3. Coloque o rato sob anestesia profunda, que é verificada pelo mouse sendo não-responsivos a uma picada de agulha para a almofada do pé, usando uma câmara de isoflurano, ou equivalentes rotas de anestesia terminal como agentes anestésicos injetáveis (pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal [IP]; Avertin, IP de 240 mg/kg), ou dióxido de carbono (CO₂) exposição (75% CO₂25% O₂).
4. Abate do mouse através de punção cardíaca para o ventrículo esquerdo e coletar tanto sangue quanto possível. Transferir para o tubo de sangue EDTA-revestido para até 4 h. Se preferirem, os ratos podem ser culled através do deslocamento cervical com cuidado para não romper a veia jugular.
5. Disse os rins através do abdômen e lavagem em gelo frio 1X PBS.
6. Para examinar os glomérulos corticais, remover um polo de córtex renal e corte em pedaços de³ de 1 mm. Para examinar os glomérulos profundo juxta-medular, repita a mesma técnica com tecido da medula. Coloque em 5 mL de solução de glutaraldeído 2,5% em um tubo de ensaio EM vidro. Loja a 4 ° C.
   PRECAUÇÃO: solução de glutaraldeído 2,5%: toxic, sensibilizador, irritante; Use em um armário de emanações
   Nota: o processo dentro de 1 mês para obter melhores resultados.
7. Para histologia, remover o terço superior de um rim, para garantir a corticais e medular-juxta glomérulos estará presentes e a correção em 5 mL de 4% paraformaldeído a 4 ° C por 24 h. transferência para 5 mL de 70% EtOH por 24 horas antes de incorporação em parafina.
   Atenção: 4% PFA: fixador, uso no armário de emanações
8. Por imunofluorescência, coloque um terço do rim, para garantir a corticais e medulares glomérulos estará presentes, no molde de tecido e casaco em outubro lugar em gelo seco para congelar e armazenar a-80 ° C.
9. Para proteína e RNA, lugar 3 x 2 mm³ pedaços de córtex renal em tubos de plástico de 0,5 mL e snap freeze em líquido N₂. Loja a-80 ° C. Para armazenamento a longo prazo do tecido para o RNA, coloque o tecido em 5 volumes de solução de estabilização de RNA e armazenar a-80 ° C.
10. Para isolamento de glomérulos, cortar tecido renal restante e coloque em 5 mL de solução de Ringer mamíferos com 1% de BSA no gelo. Prepare-se para peneirar glomérulos imediatamente.

3. plasma creatinina

Nota: A creatinina do Plasma pode ser acima-está regulada na doença renal, indicando uma redução da capacidade de filtração dos glomérulos. Os níveis de nitrogênio (BUN) de ureia do sangue também podem ser avaliados, apesar do protocolo não está descrito aqui.

1. Centrifugar a amostra de sangue a 500 x g, durante 15 min a 4 ° C.
2. Colete o plasma, que pode ser armazenado a-20 ° C a curto prazo neste momento.
3. Quantificar a concentração de creatinina plasmática usando um ensaio de creatinina química pelas instruções acima para creatinina urinária em protocolo 1.11.
4. Determinar a concentração de creatinina de cada amostra, lendo a placa em uma absorvância de 490 nm antes e após a adição da solução de ácido.
   Nota: A diferença entre esses valores de absorvância é diretamente proporcional à concentração de creatinina em cada amostra. Uma curva-padrão é a geração dos padrões. Se as repetições técnicas tem um valor de CV superior a 5%, repeti o ensaio para as amostras.

4. isolamento de glomérulos

Nota: Glomérulos podem ser isolados para avaliar a permeabilidade dos glomérulos individuais ex vivo, bem como a expressão da proteína específica e marcadores de mRNA da doença glomerular.

1. Leve o tecido renal, colocado em solução de Ringer mamíferos com 1% de BSA e dissecar os glomérulos usando um padrão de peneiração técnica¹³. Brevemente, empilhe a 70 µm (parte inferior), 100 µm, 125 µm, 175 µm, 250 µm e 425 µm (top) peneiras para um copo de vidro.
2. Triture o rim, usando um êmbolo da seringa, na 425 µm peneira e continuar usando gelo frio mamíferos solução de Ringer com 1% de BSA. Como os bits de rim são empurrados, retire a peneira superior e continuar a fazer o mesmo na próxima. Repita até somente a 100 µm e 70 µm peneiras permanecem.
3. Transferir a colheita glomerular retida a 100 µm e 70 µm peneiras para 10 mL de solução de Ringer mamíferos fresco com 1% de BSA, no gelo.
   Nota: Se o número de glomérulos por solução de Ringer-mL é pouco, reduza o volume de solução de Ringer, usado para coletar os glomérulos das últimas duas peneiras.
4. Remover 5 mL da solução contendo glomérulos em dois tubos separados (2,5 mL cada) e centrifugar a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Remover o sobrenadante e snap freeze glomérulos em líquido N₂ antes de armazenar a-80 ° C para proteína e extração de RNA em uma data posterior.
5. Coloque o restante da solução contendo glomérulos em banho-maria a 37 ° C, para a medição do glomerular L_pA / Vex vivo. Completa dentro de 3 h de remover o rim.

5. permeabilidade de água glomerular (L_pA / V e_eu)

Nota: O glomerular L_pA / V_eu ensaio de ativa a ex vivo medição da permeabilidade dos glomérulos individuais em um rápido uma maneira reproduzível. Aumento o glomerular L_pA V_eu indica perturbação da GFB, que é sugestivo de doença renal.

1. Configurar o glomerular L_pA / V_eu rig conforme descrito no salmão et al.¹⁰. Por favor, consulte a Figura 1 para um diagrama detalhado o instituído.
2. Preparar as seguintes soluções: solução de Ringer mamíferos com 1% de BSA (pH 7,4) e solução de Ringer mamíferos com 8% de BSA (pH 7,4). Aquecer a ambos a 37 ° C.
3. Puxe Micropipetas de tubos capilares de vidro (densidade óptica: 1,2 mm). Gere uma ponta de abertura 5-8 µm cortando a micropipeta sob um microscópio.
4. Use o glomerular L_pA / V_eu rig pegar intactos glomérulos individuais que estão livres da cápsula de Bowman e fragmentos tubulares para a micropipeta usando sucção. Um resumo detalhado do ensaio oncometric é encontrado no salmão et al.¹⁰. Em breve, uma vez que um glomérulo é apanhado e acondicionado sobre a sucção micropipeta, começará a gravar o vídeo do glomérulo sob o microscópio.
5. Em primeiro lugar, equilibrar o glomérulo em solução de Ringer de BSA a 1% por 30 s antes de mudar o perifusate para a solução de Ringer BSA concentrado 8% para 10 s. Então o perifusate volte ao solução de 1% BSA Ringer e parar a gravação.
6. Lavar o glomérulo e repita o processo para 10-15 glomérulos por rato. Certifique-se das taxas de fluxo de perifusate são idênticos e não a rápida (10 mL/min), para não distorcer a estrutura glomerular.
7. Medir a taxa inicial de encolhimento glomerular para calcular a permeabilidade de água glomerular (L A_p) normalizada para o volume glomerular (V_eu). Informações detalhadas sobre a análise podem ser encontradas no salmão et al.¹⁰.

6. ácido periódico mancha de Schiff (PAS)

Nota: A mancha PAS irá destacar as membranas do porão de loops capilares glomerulares e o epitélio tubular. Permite visualização detalhada do células glomerulares, mesangiais matriz e potencial de expansão e possíveis alterações do GBM (ou seja, espessamento e irregularidades).

1. Seção do córtex renal de parafina, PFA-corrigido usando um micrótomo na espessura de 5 µm para corrediças revestidas de poli-L-lisina. Seco a 37 ° C por 1 h. Certifique-se de seção não contém quaisquer dobras ou buracos, que podem distorcer a morfologia sob o microscópio.
2. Deparaffinize slides incubando-se duas vezes em xilol (cuidado, irritante; uso no armário de emanações) por 3 min cada, duas vezes em 100% EtOH por 3 min cada e então uma vez em 95%, 70% e 50% EtOH por 3 min cada, todos em temperatura ambiente. Re-hidratar os slides em dH₂O.
3. Incubar as lâminas em solução de ácido periódico (cuidado, irritante; uso no armário de emanações) (1 g/dL) por 5 min e em seguida enxaguar os slides em várias mudanças de dH₂O. Utilize um recipiente com 100ml dH₂O à temperatura ambiente.
   PRECAUÇÃO: solução de ácido periódico: irritante; usar no armário de emanações
4. Incubar em reagente de Schiff (Parasoaniline HCl 6 g/L e sódio metabissulfito 4% em HCl 0,25 mol/L) durante 15 minutos à temperatura ambiente. Lave os slides em água corrente por 5 min.
5. Corante de contraste com hematoxilina por 3 s antes de enxaguar cuidadosamente slides em água corrente por 15 min.
   Nota: Pode ser necessário alguma otimização para determinar o tempo ideal para coloração de hematoxilina.
6. Desidrate slides usando o inverso do protocolo deparaffinization em passo 6.2. Terminar com xilol.
7. Ar secos slides e montagem com mídia de montagem baseada em xilol.
8. Imagem em um microscópio de luz na ampliação de X 400 para avaliar estruturas glomerulares. Avaliar o seguinte: espessamento e irregularidades do GBM, colapso de loops de capilares, tecido fibrótico, esclerose, proliferação celular (endotelial, podocyte e mesangiais, ou células inflamatórias, infiltrando o topete).
   Nota: Para uma avaliação detalhada da fisiopatologia glomerular, lesões em outras partes do rim devem ser avaliado, tal como os túbulos.

7. transmissão microscopia de elétron (TEM)

Nota: TEM permite o exame de anormalidades ultra-estruturais no rim, tais como o GBM, podocyte processos de pé e fenestrações endoteliais, que não são visíveis com microscopia de luz. Isso é importante em modelos onde dano renal não é tão pronunciado (ou seja, sem albuminúria e anormalidades estruturais principais).

1. Tirar o 2,5% gluteraldehdye - fixa cubos nos rins e fixar em tetróxido de ósmio 1% para 1 h. lavagem em 50 mL de tampão de cacodylate de 0,1 M (pH 7,3) e, em seguida, 50 mL de dH₂O (mudanças de 3 x 15 min).
   PRECAUÇÃO: o glutaraldeído 2,5%: toxic, sensibilizador, irritante; Use em um armário de emanações. 0,1 cacodylate de sódio M: tóxico, uso em um armário de emanações
2. Desidratar com EtOH e incorporar em resina Araldite.
3. Cortar seções na espessura de 50-100 nm e mancha com 3% de acetato de uranilo (aquosa) e solução de citrato de chumbo de Reynolds.
4. Assumir várias áreas do glomérulo em 940 X o micrografias Digitas, 1250 X e 6200 X para certificar os podócitos, GEnCs, GBM e mesangium podem ser identificados.
5. Use o ImageJ para analisar os glomérulos cegos. Defina a escala para cada lâmina histológica 6200 X desenhando uma linha entre dois pontos de distância conhecida, como uma régua. Vá para analisar e então definir a escala, onde será exibido o comprimento da linha em pixels. Digite a distância conhecida e unidades de medida. Use os protocolos listados abaixo para a medição de cada parâmetro.
   Nota: Esta análise requer cerca de 1 dia por rato. Para poder estatístico adequado, use as médias medições de 3 glomérulos de 3 ratos.
   1. Para GBM, insira uma grade fixa digital (10 x 10) sobre a micrografia 6200 X e medir a espessura do GBM no ponto onde as linhas de grade entre o GBM. Medir da membrana da célula endotelial basal, a membrana da célula basal das pé processo numa tangente perpendicular à membrana da célula endotelial, usando a ferramenta de linha reta. Determine a medida média por cada glomérulo de 10 medições individuais.
   2. Para o número de fenestração endotelial, medir o comprimento do GBM presente na Micrografia 6200 X e contar o número de fenestrações endoteliais por unidade de comprimento do GBM. Leva uma média pelo menos 4 micrografias por glomérulo.
   3. Para a podocyte pés de largura de processo, insira uma grade fixa digital (10 x 10) sobre a micrografia 6200 X. Meça a largura dos processos podocyte pé que cruzam as linhas de grade. Meça a largura na parte mais larga do pé processo onde se encontra com o GBM; Certifique-se que a linha é perpendicular à tangente da membrana basal podocyte. Determine a medida média por cada glomérulo de 10 medições individuais.
   4. Para cortar a largura de podocyte, insira uma grade fixa digital (10 x 10) sobre a micrografia 6200 X. Meça a largura da fenda podocyte diafragmas que cruzam as linhas de grade. Este é o ponto onde os processos de pé são mais próximos juntos, na parte mais larga de cada processo de pé, de podocyte membrana de membrana. Certifique-se que a medição é perpendicular à tangente da membrana basal podocyte. Determine a medida média por cada glomérulo de 10 medições individuais.
   5. Para o número de podocyte processos do pé, meça o comprimento do GBM presente na Micrografia 6200 X e contar o número de processos de pé podocyte por unidade de comprimento do GBM. Leva uma média pelo menos 4 micrografias por glomérulo.
   6. Para a cobertura do espaço sub-podocyte, consulte método detalhado em Neal et al. ¹⁴.
6. Usando as 940 micrografias de X, examine glomérulos para a presença de estrutura anormal, depósitos e infiltrados pelo olho.

8. imunofluorescência para Podocyte e marcadores endoteliais

Nota: Immunostaining permite a visualização dos padrões de expressão da proteína, como loops capilares endoteliais, que podem entrar em colapso na doença glomerular.

1. Coloque o molde-OCT contendo rim congelado a-20 ° C durante 2 h antes da corte. Certifique-se de que superfície de corte do rim é cuidadosamente colocado contra a parte inferior do molde-OCT para ativar seções de tecido bem orientado.
2. Usando um criostato, tecido de seção em uma espessura de 5 µm para poli-L-lysine revestido de slides.
   Nota: Certifique-se não há dobras ou buracos na seção de tecido, que pode distorcer a morfologia.
3. Após a remoção do criostato, corrigir slides em 4% PFA durante 10 min. Lave os slides 3 x 5 min em um recipiente com 100ml de dH₂O.
   Atenção: 4% PFA: fixador, uso no armário de emanações
4. Para minimizar a quantidade de anticorpos utilizados, desenhe em torno de seções com uma caneta hidrofóbica. Não seque as seções.
5. Incube em solução (BSA 3% e 5% de soro normal em 1X PBS) por 1h à temperatura de bloqueio.
6. Remover a solução de bloqueio com um aspirador e incubar seções com anticorpo primário (Nefrina, podocin ou PECAM-1) diluído 1: 250 (BSA 3% em PBS 1x). Coloque slides em uma câmara umidificada a 4 ° C durante a noite. Se não houver uma câmara úmida, levemente, coloque uma pequena faixa de parafilm sobre o slide anticorpo-revestido. Preste atenção ao retirar no dia seguinte para não perturbar a seção.
7. Lave slides 3 x 5 min em 1X PBS.
8. Incube com anticorpo secundário fluorescente apropriado de diluição 1: 1000 (3% BSA em 1X PBS) para 2 h à temperatura ambiente no escuro.
9. Lave slides 3 x 5 min em 1X PBS. Montar com fluorescentes montagem mídia contendo DAPI.
10. Slides de imagem com um microscópio fluorescente na ampliação de X 400 para ver os glomérulos. Certifique-se de que isto é cegado para evitar o viés.
11. Uso ImageJ para analisar a intensidade de coloração, normalizada para a zona glomerular e o padrão de coloração, ou seja, número de loops capilares normalizados para a zona glomerular, de forma cega.

9. a proteína extração e mancha ocidental

Nota: Mancha ocidental nos permite avaliar as proteínas de expressão, conhecidas por ser prejudicado em doença renal. Por exemplo, uma redução na expressão podocin e Nefrina indica perda de podocyte.

1. Extrair a proteína do córtex renal e peneirados glomérulos; o protocolo é o mesmo para cada um e o volume de Lise é ajustado para a quantidade de tecido.
2. Degelo no rim/glomérulos no gelo antes de adicionar o NP-40 lise tampão contendo inibidores de protease e fosfatase (150 mM de NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris pH 8). Homogeneizar a amostra por 30 s.
3. Incube as amostras homogeneizadas no gelo por 30 min, num Vortex em intervalos regulares.
4. Centrifugar as amostras a 10.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
5. Remova o sobrenadante para um tubo fresco no gelo.
   Nota: pretende recuperar cerca de 1 mg de proteína por amostra.
6. Desnature as proteínas usando o padrão 4 x Laemmli buffer. Ferva a mistura em 95-100 ° C por 5 min.
7. Avaliar a expressão de proteínas de marcador de células glomerulares (Nefrina, Podocin, PECAM-1, etc.) e a fosforilação e expressão de proteínas conhecido/a hipótese de ser alterada no rim/glomérulos do modelo doença usando mancha (Ocidental método padrão; Marques e Yang¹⁵).
   Nota: O protocolo pode variar dependendo do tamanho e da abundância da proteína de interesse.

10. RNA extração e reação em cadeia da polimerase (PCR)

Nota: análise da expressão do mRNA permite determinar como os genes são regulados na doença renal, tais como mudanças na expressão gênica e splicing alternativo.

1. Enquanto o córtex renal ainda está congelado, moa completamente em 3 mL de reagente fenol usando um pilão e almofariz. Se usar extratos glomerulares, adicionar 1 mL do reagente fenol e homogeneizar a amostra por 30 s.
   Cuidado: O reagente de TRIzol: irritante; usar no armário de emanações
2. Realize uma extração de RNA, usando o método descrito por Chomczynski e Sacchi¹⁶.
   Nota: Kits de extração de RNA comercial estão disponíveis como uma alternativa para este método.
3. Avalie a quantidade e a qualidade do RNA obtido usando um dos vários métodos disponíveis. O RNA é aliquotadas e armazenado a-80 ° C neste momento. Evitar repetição congelar descongelar.
   Nota: Se nova para este método, verifique a qualidade do RNA antes de prosseguir para a próxima etapa executando o RNA em um gel de agarose para garantir uma clara 28S e banda ribosomal 18S. Esperava recuperar entre 2 a 5 µ g de RNA usando esse método.
4. DNase tratar 1 µ g de RNA (volume de fazer até 10 µ l com água livre de RNase plus 1 µ l de DNase e 1 µ l de tampão de DNase) para 1 h a 37 ° C. Pare a reação com 1 µ l da solução de paragem DNase a 65 ° C por 10 min.
5. Adicione 0,5 µ l de primers aleatórios e oligo (dT). Incube a 70 ° C durante 10 min.
6. Imediatamente saciar no gelo por 5 min.
7. Adicione o seguinte; Enzima transcriptase reversa MMLV (400 U; substituir com DEPC H₂O na RT - amostra de controlo), buffer de MMLV (1x), dNTP mix (0,5 mM) e ribonuclease inibidor (40 U); fazer até 50 µ l com água DEPC.
8. Incube a mistura de reação a 37 ° C, durante 1 h seguida de 95 ° C por 5 min desactivar a enzima.
   Nota: Para gerar um rendimento mais elevado do cDNA, incube a 37 ° C por até 3 h.
9. Avalie a quantidade e a qualidade do cDNA usando vários métodos disponíveis.
10. Uso do PCR para avaliar os padrões de expressão e de emenda de mRNA de genes a hipótese de ser prejudicado no modelo de doença glomerular. O protocolo irá variar dependendo do gene de interesse.

Urina foi coletada usando gaiolas metabólicas do tipo selvagem (WT), inducible podocyte específicos VEGF-A nocaute (KO VEGF-A) e VEGF-A KO X Neph-VEGF165b ratos (os ratos VEGF-A KO que excesso expressam a isoforma de b humano VEGF-A165nos podócitos em um forma constitutiva). Sobre medição de creatinina a albumina urinária em semanas 0, 4, 10 e 14 após a indução de doxiciclina de VEGF-A KO, KO VEGF-A ratos desenvolveram albuminúria progressiva por 10 semanas em comparação com controles de littermate WT. Os valores absolutos pode ser vistos na Figura 2Ae o normalizado para a linha de base de cada valores do mouse na Figura 2B. No entanto, albuminúria em não observado nos ratos b165VEGF-A X Neph-VEGF-A (Figura 2), indicando o VEGF-A165b é protetora no modelo de albuminúria5.

O glomerular LpAVeu foi medido em glomérulos individuais peneirados de WT, VEGF-A KO e rins de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165. Um exemplo de como um glomérulo é detectado e o encolhimento observado quando perifused com 8% BSA é mostrado na Figura 3A. Este encolhimento é usado para determinar o glomerular LpA / V para cada glomérulo (Figura 3B). Camundongos KO de VEGF-A tinham um significativamente aumento glomerular LpA / V com 14 semanas pós indução VEGF-KO, em comparação com glomérulos de controle do WT. Embora menor em camundongos de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165, o aumento glomerular LpA / V, não foi impedido por excesso de expressão de VEGF-A165b às 14 semanas5.

Coloração de PAS de seções de córtex renal 14 semanas após a indução de VEGF-A KO não revelaram qualquer anormalidade estrutural glomerular nos VEGF-A KO ou VEGF-A X Neph-VEGF-A165b ratos (Figura 4A). No entanto, após a análise da ultraestrutura glomerular através EM, ratos VEGF-A KO tinham desenvolvido uma maior largura GBM, diminuiu o número de fenestras endoteliais, diminuição da cobertura SPS e aumentou a média podocyte fenda de largura (Figura 4-4F ). O pé de média podocyte processo de largura e número de fendas permanecido inalterado (Figura 3B e 3 G). Excesso de expressão de VEGF-A165b nos ratos VEGF-A KO impediu as alterações para o GBM e fenda de largura (Figura 4 e 4F). No entanto, VEGF-A165b não teve efeito sobre o número de fenestras alterados e SPS cobertura (Figura 4 e 4E)5.

RT-PCR, realizada na RNA extraído de glomérulos peneirados revelou que a humana VEGF-165b mRNA só está presente nos ratos VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b (Figura 5A). Quando extrair proteína de glomérulos peneirados e avaliar os níveis de proteínas através da mancha ocidental, a expressão da proteína glomerular de VEGFR-2 foi encontrada para ser diminuída em camundongos VEGF-A KO, que foi impedido por excesso de expressão de VEGF-A165b ( Figura 5B e C 5)5.

Figura 1. Diagramática configurar o equipamento de permeabilidade glomerular (LpA). (A) o glomérulo é capturado em (B) a micropipeta dentro de um suporte usando sucção, que é fixada em um monte de estabilidade. (C) microslide retangular. (D) 4 X objetivo um microscópio com uma câmera de vídeo. (E) solução a 1% BSA aquecido a 37 ° C. (F) solução a 8% BSA aquecido a 37 ° C. (G) controle remoto toque rolamento de duas linhas que contêm perifusate, que permite a troca rápida de perifusate. (H) rota de perifusate em direção a microslide, que então banha o glomérulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Creatinina de albumina urinária. (A) os valores uACR em semanas 0, 4, 10 e 14 após a indução de VEGF-A KO em ratos de b165WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Neph-VEGF-A. (B) os mesmos valores de uACR normalizados para o valor de base (semana 0) de cada rato individual. A uACR aumentou significativamente em camundongos VEGF-A KO em semanas 10 e 14 em comparação com controles de littermate WT, que foi impedida nos ratos b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; ANOVA de duas vias, correção para comparação entre pares; n = 4-12 ratos por ponto de tempo; barras de erro: erro padrão da média [SEM]). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Medição da permeabilidade de água glomerular. (A) o glomérulo é apanhado sobre a micropipeta através de sucção; o perifusate é mudado de 1% de BSA (Ai) para 8% BSA (todos), e encolhimento glomerular é observado. (B) as medições realizadas antes e após o interruptor de BSA 8% são usadas para determinar o glomerular LpA / V eeu. (C) ratos VEGF-A KO desenvolvem um aumento glomerular LpA / V com 14 semanas pós indução de VEGF-A KO comparados aos controles do WT. Isto não foi significativamente impedido em ratos de b VEGF-A X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = ratos de 4-9, 15-30 glomérulos; barras de erro: SEM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Análise estrutural glomerular. (A) coloração PAS do córtex renal não indicaram quaisquer anormalidades estruturais nos glomérulos dos ratos de b165WT, VEGF-A KO e VEGF-A X Neph-VEGF-A (Ai - iii). EM revelou anormalidades ultra-estruturais em glomérulos VEGF-A KO (Aiv - vi). (B) o FPW média não se alterou entre grupos. (C) o GBM aumentou em glomérulos VEGF-A KO, que foi impedido por VEGF-A165b (D) o número de fenestras diminuiu em glomérulos VEGF-A KO, que permaneceu inalterados por VEGF-A165b. cobertura do SPS (E) foi diminuído em glomérulos VEGF-A KO, que também permaneceram inalterados por VEGF-A165b (F) a cortar a largura média foi aumentada em glomérulos VEGF-A KO, que foi impedido por VEGF-A165b (G) o número de fenda foi inalterado entre os três grupos (* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = 3 ratos, 9 glomérulos; barras de erro: SEM). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. expressão do mRNA e proteína de marcadores. (A) RT-PCR mostrou que a expressão humana VEGF-A165b mRNA só era evidente em glomérulos peneirados de ratos de b165VEGF-A KO X Neph-VEGF-A. (B) mancha ocidental indicou que expressão da proteína de VEGFR-2 foi para baixo-regulado em glomérulos VEGF-A KO, o que foi evitado em glomérulos de b VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165(* p < 0,05; One-way ANOVA, correção de Bonferroni para comparação entre pares; n = 3 - 6 ratos; barras de erro: SEM). Esta figura foi modificada de Stevens et al.5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.