É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish

8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57767

⸱

12 de julho de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Biochemistry, Wayne State University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Zebrafish são um natural Vibrio cholerae hospedar e pode ser usado para recapitular e estudar o ciclo infeccioso de colonização para transmissão. Aqui, demonstramos como V. cholerae níveis de colonização de avaliar e quantificar a diarreia no zebrafish.

Resumo

Vibrio cholerae é conhecido como o agente infeccioso que causa a cólera de doenças humanas. Fora do hospedeiro humano, V. cholerae principalmente existe no ambiente aquático, onde interage com uma variedade de espécies aquáticas superiores. Vertebrados peixes são conhecidos por serem um host ambiental e são um reservatório potencial de V. cholerae na natureza. Tanto V. cholerae e as espécies de peixes teleósteos Danio rerio, comumente conhecidas como peixe-zebra, originam o subcontinente indiano, sugerindo uma interação de longa data em ambientes aquáticos. Zebrafish são um organismo modelo ideal para estudar muitos aspectos da biologia, incluindo doenças infecciosas. Zebrafish pode ser facilmente e rapidamente colonizado por V. cholerae após exposição na água. Colonização intestinal por V. cholerae leva à produção de diarreia e a excreção de replicada V. cholerae. Estas excretada bactérias pode, em seguida, vão para colonizar novos hospedeiros de peixe. Aqui, demonstramos como avaliar V. cholerae-colonização intestinal no zebrafish e como quantificar V. cholerae-induzida do zebrafish diarreia. O modelo de colonização deve ser útil para pesquisadores que estão estudando se os genes de interesse podem ser importantes para a colonização do hospedeiro e/ou de sobrevivência ambiental. A quantificação do zebrafish diarreia deve ser útil para pesquisadores estudando qualquer patógeno intestinal que estão interessados em explorar o zebrafish como um sistema modelo.

Introdução

Vibrio cholerae é uma bactéria Gram-negativa aquática que provoca a cólera de doenças humanas, bem como diarreia esporádica1,2. V. cholerae é encontrado no ambiente em muitas áreas do globo, muitas vezes associado com outros organismos aquáticos. Estes organismos associados incluem plâncton, massas de ovos de insetos, moluscos e vertebrados peixes espécie3,4,5,6,7. Vários estudos têm isolado V. cholerae do trato intestinal de peixes em diferentes zonas geográficas7,8,9,10. A presença de V. cholerae em peixes indica que o peixe pode atuar como um reservatório ambiental. Peixes também poderiam ser implicados na transmissão da doença aos seres humanos e na disseminação geográfica de V. cholerae estirpes6.

Para entender melhor como o V. cholerae interage com peixe, Danio rerio, mais conhecido como peixe-zebra, foi desenvolvido como um sistema modelo para estudar V. cólerae11. Zebrafish são nativas do Sul da Ásia, incluindo a região da Baía de Bengala, que é pensado para ser o mais antigo reservatório de V. cholerae. Antes do início primeiro cólera pandemia, em 1817, a cólera não tinha sido relatada fora do que é hoje a Índia e Bangladesh. Portanto, zebrafish e V. cholerae quase certamente associado com o outro em escalas de tempo evolutivo, sugerindo que zebrafish são uma série de V. cholerae no ambiente natural12.

O modelo de zebrafish para o V. cholerae é simples de executar e pode ser usado para estudar a patogenicidade de todo o ciclo de vida V. cholerae . Peixes são expostos para o V. cholerae por tomar banho na água que tenha sido inoculado com um número conhecido de V. cholerae. Dentro de algumas horas, colonização intestinal ocorre, seguido pela produção de diarreia. Diarreia consiste de mucina, proteínas, bactérias excretadas e outro conteúdo intestinal. O grau de diarreia pode ser quantificado usando algumas medições simples13. V. cholerae que tem sido excretado pelos peixes infectados pode então ir para infectar os peixes ingênuo, completando o ciclo infeccioso. Portanto, o modelo de zebrafish recapitula o V. cholerae doença humana processo12,14.

O mais frequentemente usado V. cholerae modelos animais têm sido, historicamente, ratos e coelhos14,15,16,17,18. Esses modelos têm sido fundamentais para adicionar ao nosso conhecimento de V. cholerae patogênese. No entanto, porque os ratos e coelhos não são naturais V. cholerae anfitriões, existem limitações a que aspectos do ciclo de vida V. cholerae podem ser estudados. A V. cholerae colonização de ratos e coelhos, normalmente, requer a ausência da microbiota intestinal ou um tratamento prévio com antibióticos para danificar a microbiota intestinal. Ambos os modelos requerem ou gavagem para introduzir as bactérias para o sistema digestivo ou manipulação cirúrgica para injetar diretamente as bactérias no intestino. Zebrafish têm uma vantagem em que peixes adultos com uma microbiota intestinal intacta prontamente são colonizados e o processo infeccioso acontece naturalmente, sem qualquer manipulação necessária.

O presente trabalho demonstra a utilização do zebrafish como modelo em V. cholerae infecção. A infecção, dissecação, enumeração de colonizar V. choleraee a quantificação de diarreia causada pelo V. cholerae será descrito12,13. Este modelo é provável que seja útil para os cientistas interessados no processo de doença V. cholerae e o V. cholerae ambiental estilo de vida.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Wayne State University. Esse método foi descrito pela primeira vez em Runft et al . 12

1. determinação dos níveis de colonização Intestinal

Nota: Colonização Intestinal é a métrica mais útil no modelo de zebrafish como ele pode ser usado para comparar a adequação relativa de diversas variedades de V. cholerae ou os efeitos de mutações ou nocautes de gene.

  1. Inoculação de zebrafish por imersão
    Nota: Este meio de exposição assemelha-se o curso natural da infecção.
    1. Preparação do V. cholerae
      1. Inocular 5ml de caldo lisogenia (LB) com um isolado V. cholerae colônia de um LB da placa e incubar a 37 ° C, com agitação (180 rpm) para 6-8 h (cultura durante a noite).
      2. Inocule 25 mL de meio fresco de LB esterilizado em um Erlenmeyer de 250 mL com 50 µ l de cultura acima durante a noite. Incube-16 – 18 h a 37 ° C, com agitação (150 rpm).
      3. Ler a densidade óptica em 600 nm (OD600) de uma diluição de 1/10 da cultura durante a noite para estimar o número de bactérias por mL (o OD600 = 1 é 10 ~9 UFC/mL.)
      4. Colher as células por centrifugação a 6.000 g durante 10 min. remover a mídia com uma pipeta ou derramá-lo fora em uma solução desinfetante. Ressuspender as células em PBS estéril para a concentração desejada, tipicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS.
        Nota: Aqui, nos referimos a autoclavado osmose reversa água contendo sais de 60 mg/L do mar como água estéril de infecção.
    2. Inoculação e incubação
      1. Colocar um copo de 400 mL, contendo 200 mL de água estéril infecção zebrafish quatro ou cinco.
      2. Adicione 1 mL de V. cholerae (da etapa 1.1.1.4.) para obter a concentração desejada de infecção (tipicamente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) em 200 mL de água de infecção.
      3. Cobrir o recipiente com uma tampa perfurada para evitar que os peixes saltem para fora; parte superior de uma caixa de dica de 200 µ l funciona bem para isso.
      4. Etiquete cada copo e colocá-los em uma incubadora de vidro da frente regulado a 28 ° C, para a duração do experimento.
    3. Procedimento para a exposição transitória
      Nota: Uma exposição transitória para o V. cholerae (tipicamente de 6 h) seguida da remoção das bactérias inoculando é útil para estudar a transmissão e para a quantificação mais precisa de bactérias excretadas.
      1. Após 6 h de exposição, deite fora a água do copo através de uma rede para recolher os peixes. Descarte a água infectada dentro de um recipiente de água sanitária para matar o V. cholerae.
      2. Coloque o peixe removido em um copo de 200 mL de água estéril de infecção. Permitir que os peixes a nadar nessa água limpa por 5 min remover as bactérias de superfície do peixe.
      3. Repita o procedimento líquido (etapa 1.2.2) e coloque o peixe em um novo copo de 200 mL de água estéril de infecção. Mantenha o peixe este copo para a duração do experimento.
  2. Eutanásia
    1. Quando o experimento alcançou seu ponto final desejado, tirar uma amostra da infecção água (15 mL é geralmente suficiente) permitir excretadas contagens bacterianas e a medição de diarreia (tais como o ensaio de mucina, teor de proteínas e/ou OD), se desejado (secção 2).
    2. Despeje o restante da água através de um arrastão (para recolher os peixes) em água sanitária para matar o V. cholerae na água.
    3. Coloque o peixe em um béquer contendo água de infecção mais 336 µ g/mL de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) e incube-os peixes nesta solução tricaina por 20 min no RT
      Nota: As redes de pesca foram esterilizados com uma solução de água sanitária 10%.
  3. Dissecação
    1. Preparação de peixes
      1. Escave um peixe para fora a solução tricaina com uma colher de plástico descartável e coloque-o na superfície de dissecação.
      2. Posição o peixe com o seu lado ventral virada para cima e pino através do maxilar inferior, com a extremidade romba do pino angular longe do centro do corpo. Coloque outro pino só posterior ao ânus, também em ângulo longe do corpo.
    2. Exposição do trato intestinal
      1. Limpe a superfície ventral do peixe com uma limpeza de fiapos, embebida em etanol 70%.
      2. É necessário esterilize um bisturi e Tesoura Vannas mergulhando-os em etanol a 70% e em chamas-los.
      3. Faça uma pequena incisão longitudinal na barriga apenas sob a pele, penetrando as escalas e usando o bisturi. Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, como o trato intestinal está localizado logo abaixo da pele.
      4. Usando a tesoura, estenda a incisão cuidadosamente ao longo do comprimento do corpo, evitando o ânus e a corte não mais profundo do que o nível da pele.
      5. Fazer dois cortes laterais com a tesoura em direção a cabeça do peixe para permitir uma abertura da incisão.
      6. Pino da pele de cada lado das incisões laterais à superfície dissecação, dobrando os pinos para fora, longe do corpo.
        Nota: As pontas dos pinos foram previamente esterilizadas por flamejante-los com álcool.
    3. Remoção do trato intestinal
      Nota: O trato intestinal deve ser visível como um tubo pálido, muito fino, em cima de outros órgãos.
      1. Flama-esterilizar o fórceps e então usá-los para remover todo trato intestinal (geralmente de 12 a 15 mm de comprimento). Coloque o intestino em um tubo de homogeneização contendo grânulos de vidro (ver passos 1.4.1–1.4.2) e 1 mL de 1X PBS ou LB, no gelo.
  4. Homogeneização
    1. Preparar os tubos de homogeneização com antecedência pelo derramamento ~1.5 g de grânulos de vidro de 1 mm em 2 mL tampa de rosca tubos (preenchê-los aproximadamente na metade do caminho) e então esterilizá-los em autoclave.
    2. Adicione 1 mL de LB estéril ou 1X PBS.
    3. Uma vez que os intestinos de zebrafish tem sido parafuso adicionado (etapa 1.3.3.1) para os tubos, as tampas na muito firmemente e prenda os tubos num homogeneizador vórtice.
    4. Homogeneizar as amostras por 1 min na configuração máxima e, em seguida, fixe-los no gelo para 1 a 2 min. Repita este ciclo de homogeneização mais uma vez para uma homogeneização completa.
      Nota: Vários métodos alternativos para homogeneização também irão funcionar.
  5. Quantificar os níveis de colonização intestinal
    1. Prepare tubos (tubos de ensaio de vidro pequeno ou tubos de microcentrifuga de 1,5 mL) para a diluição serial do homogenate adicionando 900 µ l de LB ou 1X PBS a cada tubo. Para cada peixe, preparar tubos de 5 – 6 e fazer 10 vezes diluições em série do homogenate intestinal adicionando-se 100 µ l de homogeneizado para o primeiro tubo, num Vortex para mistura e em seguida, adicionar 100 µ l do tubo do primeiro para o segundo tubo.
    2. Repita este procedimento até que todas as diluições foram preparadas.
    3. Placa de 100 a 200 µ l de cada diluição em placas de ágar LB contendo 100 µ g/mL de estreptomicina (se usando cepas resistentes de estreptomicina) e 40 µ g/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incube as placas a 30 ° C para 16 – 18 h.
    4. Após a incubação durante a noite, contagem das colónias V. cholerae nas placas, usando um contador de colônia automática ou manualmente, contando as colônias; é útil marcar as colônias contadas com uma ponta de marcador.
    5. Determine o CFU por intestino de peixe multiplicando-se a contagem de placa pelo factor de diluição da suspensão, tendo em conta o volume que foi chapeado.

2. medição de diarreia de peixe

Nota: Quatro métricas diferentes foram usadas para avaliar a diarreia de peixe: os níveis de mucina na água, os níveis de proteína excretados geral em água, o OD600 da água e o V. cholerae CFU na água13. Diarreia normalmente torna-se visualmente evidente aproximadamente 6 h após a exposição do zebrafish para V. cholerae conforme descrito acima.

  1. Determinar os níveis de mucina
    Nota: A secreção de mucina é induzida durante a colonização de V. cholerae e é uma boa medida de níveis de excreção, especialmente no início de infecção13. O ensaio de mucina é uma variação sobre o ácido periódico microtiter Schiff ensaio19.
    1. Preparar os seguintes materiais: solução de ácido periódico a 50% (p/v) e solução de 0,1% ácido periódico trabalho (10 µ l do estoque 50% ácido periódico adicionado a 5 mL de ácido acético 7% — usar imediatamente depois de fazer), padrões de mucina, placas de microtitulação 96 poços, Schiff reagente.
      1. Preparar padrões de mucina, suspendendo as seguintes quantidades de mucina (a partir de um tipo de suínos estômago III) em um tampão de acetato de sódio (100 mM de sódio acetato, 5mM EDTA, pH 5.5 com ácido acético glacial): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL.
        Preparar a placa adicionando-se 100 µ l de infecção a água a cada poço que será usado no ensaio da seguinte forma: em branco 1X PBS; padrões de mucina conforme descrito acima, ou uma amostra de água da infecção de peixe. Fazer cada amostra em triplicado.
    2. Adicione 50 µ l de solução de ácido periódico fresca de 0,1% para cada um bem com uma pipeta multicanal e misturá-lo pipetando subindo e descendo várias vezes.
    3. Embrulhe em filme plástico da placa e incubar a 37 ° C para 1-1.5 h.
    4. Fixe a placa até à temperatura de 5 a 10 min. Adicione 100 µ l de solução de fucsina (do reagente de Schiff) a cada poço e pipeta para cima e para baixo misturá-lo.
    5. Embrulhe o prato em filme plástico e incube-lo à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço até que desenvolveu a cor; a cor é geralmente desenvolvida dentro de 20 min. ler a absorvância a 560 nm, utilizando um leitor de placa.
    6. Traça uma curva padrão de mucina (OD560vs µ g/mL mucina padrão). Determine os níveis de mucina do soldado desconhecido, identificando onde o OD560 cada desconhecido cai na curva padrão e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
  2. Determinar os níveis de proteína
    Nota: Além de mucina, níveis de proteína total na água são outro proxy para os níveis de diarreia (fezes nublado, líquido) produzidos pelos peixes. Este procedimento usa um ensaio de Bradford padrão para estimar os níveis de proteína. Níveis de proteína são estimados com base em cima de uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA).
    1. Misture 100 µ l de uma das normas de BSA (ver nota abaixo) ou 100 µ l de água de infecção (água do Béquer contendo o peixe infectado) com 900 µ l de Bradford reagente de ensaio (Reagente de ensaio da proteína de Pierce funciona bem para isso) em uma cubeta descartável. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 min.
      Nota: As seguintes normas de BSA foram utilizadas: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Os padrões de BSA foram diluídos em água destilada esterilizada.
    2. Leia o OD660 de cada norma, ou prove-los usando um espectrofotômetro.
    3. Traça a curva padrão BSA (OD660vs µ g/mL). Determine os níveis de proteína do soldado desconhecido, identificando onde OD660 cada desconhecido cai sobre a curva padrão de BSA e ler a concentração de mucina correspondente para esse valor.
  3. Medida OD600
    Nota: A presença de diarreia (fezes nublado, líquido) manifesta-se visivelmente após vários h e uma simples determinação de600 OD podem ser usados para quantificar isso.
    1. Inverta o tubo contendo água a infecção várias vezes para distribuir o conteúdo. Adicione 1 mL da amostra de água para uma cubeta descartável. Use 1 mL de água estéril infecção como controlo negativo.
    2. Realizar uma medição "em branco", utilizando o espectrofotômetro a 600 nm, utilizando a amostra de controlo negativo. Leia cada amostra de água a 600 nm e registar os resultados.
  4. Determinação de excretada V. cholerae UFC/mL após a infecção
    Nota: Um componente importante da diarreia produzida pelo zebrafish é excretado V. cholerae. A determinação da CFU/mL pode ser utilizada para fins tais como estimar a replicação bacteriana no trato intestinal peixe e como uma medida de uma dose infecciosa em experimentos de transmissão. Esta medida é feita melhor quando uma infecção transitória tem ocorrido. Se uma infecção de 24 h é usada, este ensaio medirá o inóculo combinado, mais o excretados V. cholerae.
    1. Tirar uma amostra de água no ponto de tempo desejado e diluí-la em série conforme descrito anteriormente.
    2. As diluições de série em meios selectivos (ágar-ágar LB contendo estreptomicina ou outro antibiótico apropriado ou DCLS) da placa e incube-os a 30 ° C por 24 h.
    3. Conte as colônias. Calcule o UFC / mL de água, conforme descrito na etapa 1.5.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

V. cholerae colonização do trato intestinal de zebrafish

Para fornecer um exemplo dos níveis típicos de colonização que observamos, nós inoculado 5 x 106 UFC da pandemia EL Tor V. cholerae estirpe N16961 em 200 mL de água numa proveta contendo vários zebrafish. Após 6 h de infecção, os peixes foram lavados em água doce e transferidos para um copo de 200 mL de água esterilizada infecção conforme descrito...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O peixe-zebra é um modelo relativamente novo para o estudo V. cholerae , mas é uma grande promessa para a futura descoberta de aspectos anteriormente desconhecidos de V. cholerae biologia e patogênese11,12,13 . O modelo de zebrafish adulto tem as vantagens de ser ambos um natural V. cholerae host que contém microbiota intestinal intacta, madura e um modelo ambiental. Desvantagens do modelo são que os d...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Graças a melodia Neely, Jon Allen, Abuaita de Basileia e Donna Runft por seus esforços em ajudar a desenvolver o modelo de zebrafish. A pesquisa relatada aqui foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas do institutos nacionais da saúde sob números do prêmio R21AI095520 e R01AI127390 (para Jeffrey H. Withey). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Instrument
Shaker incubadoraNew Brunswick Scientific, Edison, NJExcella E25
IncubadoraNUAIRE, Plymouth, MNAuto Flow
SpectrophotometerThermo, Waltham, MAGeaesys 6
Vortex homogeneizadorMinibeadbeater24112011
Máquina de pesagemOhaus, Columbia, MDAgitador de calor Adventurer Pro
Corning, Corning, NYPC-420D
Contador de colônias automatizadode
Materiais
tampas perfuradasSuporte Microtip com furos da caixa
colheres de plástico descartáveisOffice Depot, Boca Raton, FLD15-25-7008
Sistema de tanque de peixesAquaneering, San Diego, CA
RO Purificador de água AquaFXTK001
Rede de peixesMarina
comida de peixeTetra fin
Camarão SalmouraSelva vermelha marcaO.S.I. pro 80
Placa
Pinos
BisturisFerramentas Fine Scientific, Foster City, CA10000-10
FórcepsFine Scientific tools, Foster City, CA11223-20
Tesoura VannasFine Scientific ferramentas, Foster City, CA15000-11
Tubos com tampa de rosca de 2 mlFisher Scientific, Hampton, NH02-681-375
Contas de vidro de 1 mmBio Spec11079110
Contas de vidro para espalharSigma, St. Louis, MO18406-500G
Placa de PetriFisher Brand, Hampton, NHFB0875713
Tubo de centrífuga de 1,5 mlMidsci, Valley Park, MOAVSS1700 Tubo
de centrífuga de 50 mlCorning Falcon, Corning, NY352098
Tubos de testePipeta de vidro Pyrex9820
MarcaFisher, Hampton, NH13675K
Micro pipetasSartorius Biohit, Gö ttingen, Alemanham1000/m200/m20
DicasGenesee Scientific, San Diego, CA24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered shalVWR Life Science, Radnor, PAK813-500ml
Tricaine (etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato salSigma, St. Louis, MOA5040
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeoSigma, St. Louis, MO10651745001
Schiff ' s reagenteSigma, St. Louis, MO84655-250 mL
de ácido periódicoFisher Scientific, Hampton, NH10450-60-9
Mucina de estômago suínoSigma, St. Louis, MOM2378-100G
Albumina de soro bovinoFisher Scientific, Hampton, NH9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay ReagentThermo, Waltham, MA22660
LB médio
TryptonBD Biosciences, San Jose, CA211705
Extrato de LesteBD Biosciences, San Jose, CA212750
NACLFisher Scientific, Hampton, NHBP358-212
ÁgarBD Biosciences, San Jose, CA214010
ÁgarTCBSBD Biosciences, San Jose, CA265020
DCLS AgarSigma, St. Louis, MO70135-500gm
Software
Microsoft Office
Prism 5
queimadores REVSCI 120417B 400 ml copos de vidro Pyrex de pontade isopor

Referências

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40(2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607(2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn,, Sprinz, H. Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff's reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Coloniza o IntestinalQuantifica o de DiarreiaInfec o BacterianaImers o de PeixesDilui o SeriadaContagem de Col niasEnsaio de MucinaEnsaio de Bradford
Quantificar a colonização de Vibrio cholerae e diarreia no adulto modelo de Zebrafish
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.