Anticorpos que neutralizam a absorção celular de terapias de substituição enzimática com um ensaio de baseada em célula de

Avaliação da imunogenicidade é uma parte importante da segurança e da eficácia para qualquer produto terapêutico biológico, incluindo ERTs programa de monitorização. Pacientes podem desenvolver uma resposta imune que podem impactar diretamente perfis farmacocinéticos/farmacodinâmicos, eficácia e segurança dos medicamentos. Um subconjunto de estes ADA, chamado NAbs, pode inibir a eficácia ERT de duas maneiras: com a inibição da captação ERT para a célula alvo ou inibindo a atividade catalítica de ERT. O método apresentado aqui é projetado para medir NAbs que interferem com a absorção ERT em células. Para monitorar totalmente a segurança e a eficácia da ERT terapêutico, é crucial na elucidação de quaisquer potenciais correlações com os resultados clínicos ou efeitos farmacodinâmicos¹monitorização contínua dos NAbs.

Plataformas para avaliar NAbs contra terapêutica de proteína incluem atividade enzimática, baseada em célula e ensaios obrigatórios ligand¹. A plataforma de ensaio ideal é selecionada com base em vários critérios: o mecanismo de ação do produto terapêutico, a sensibilidade de plataforma de ensaio, seletividade, precisão e importante, sua capacidade de imitar a ação inibitória de NAbs na vivo . Ensaios obrigatórios-ligante podem ser apropriados em alguns casos (por exemplo, quando uma linha celular relevante não pode ser identificada ou se a sensibilidade adequada não pode ser alcançada em um ensaio de baseada em célula). No entanto, no projecto 2016 orientação da FDA para documento indústria e outros aceitos indústria white papers, baseada em célula NAb ensaios são recomendados porque eles podem melhor refletir o mecanismo biológico da droga na vivo^{1,2 , 3}.

Os componentes críticos para o desenvolvimento de um ensaio de NAb baseada em célula fluxo cytometry incluem uma linha de celular adequada que responde à estimulação de droga, um controle positivo de substituto NAb que neutraliza o ERT, um fluoróforo conjugado ERT e as espécies de teste biológicas matriz^4,5,6. A seleção de linha celular é dependente do mecanismo ERT da ação e várias linhas de célula devem ser avaliadas durante o ensaio de desenvolvimento³. O método descrito aqui, células Jurkat T humanas foram Selecionadodas por sua expressão CI-M6PR endógena na superfície da célula e a falta de receptores de fragmento de anticorpo (FcRs) que ligam indiscriminadamente a região Fc da maioria dos anticorpos^7,8 . Durante o desenvolvimento do ensaio, é importante estabelecer um controlo negativo para os estudos de validação e testes, tais como soro em pool de indivíduos que não tenham sido tratados com o artigo¹. teste de amostra do paciente. Linha celular também devem tolerar matrizes relevantes de diferentes espécies para continuidade em toda as fases adequadas, clínicas e pós-comercialização de drogas desenvolvimento¹. Outro componente é a seleção do controle positivo do ensaio. O controle positivo para o ensaio de absorção de célula ERT foi escolhido com base na sua capacidade de vincular o terapêutico e neutralizar a absorção através da CI-M6PR^9,1. Muitas vezes é difícil obter quantidades úteis ou sustentáveis de anti-soros neutralizantes de cobaias humanas para uso como um controle de ensaio, especialmente em populações de pacientes de doenças raras². As alternativas incluem anti-soros de animais imunizados hiper ou afinidade-purified policlonais ou monoclonais anticorpos cravados no ensaio relevantes matriz¹. Enquanto estiver usando uma matriz de espécie-específicos, é possível que fatores inibitórios diferente de anticorpos presentes na matriz podem inibir a absorção ERT. Outro componente crítico do ensaio é o ERT fluoróforo conjugado. A seleção do fluoróforo para a conjugação de ERT deve ser avaliada para cada ERT, baseado na necessidade do ensaio brilho, estabilidade do pH e potencial sobreposição espectral em outros canais sobre o citômetro de fluxo.

O ensaio descrito aqui é um exemplo para medir um NAb a uma proteína terapêutica, tais como um ERT, que insere a célula através de CI-M6PR. Vários ERTs, destinados a tratar doenças de depósito lisossômico (DDL), utilizar esta via para a captação de célula e direcionamento dos lisossomos, incluindo elosulfase alfa para síndrome de Morquio A, cerliponase alfa para a doença de Batten CLN2, agalsidase alfa para doença de Fabry, e alglucosidase alfa para a doença de Pompe^10,11. A finalidade desse método é medir os níveis relativos de NAbs que interferem com a droga vinculação e internalização através do CI-M6PR. Isto é realizado hierárquico do rastreio, confirmação, e sendo o título passos³. Amostras são selecionadas primeiramente para NAb positividade e depois confirmadas positivas na etapa de confirmação. Finalmente, amostras que tela e confirmam positivo podem ser diluídas em série para gerar um título de anticorpo¹. Este ensaio de absorção baseados em células de fluxo cytometry drogas fornece um método sensível e mecanicamente relevantes em vitro de medição NAbs drogas específicas que podem afetar o perfil farmacológico de uma droga. Nós anteriormente o método validado e testado usando esta plataforma para o elosulfase de drogas alfa⁸de amostras clínicas. Aqui descrevemos o protocolo passo a passo detalhado que pode ser aplicado a outras proteínas terapêuticas ou ERTs.

Matrizes humanas foram adquiridas a partir de fontes comerciais com aprovação de seus institucional Review Board (IRB), mas devem ser tratadas como potencialmente infecciosas. Certifique-se de que o ambiente de laboratório usado mantém uma cultura de segurança¹².

1. antes de começar o ensaio

1. Prepare estreptavidina conjugada ERT grânulos magnéticos de acordo com instruções^{13 as indicações do fabricante}.
2. Preparar amostras de controlo de qualidade (QCs): spike um anticorpo de controlo positivo (PC) (por exemplo, um NAb) na matriz da espécie-específicos (por exemplo, em pool CSF ou soro).
   Nota: Orientação do FDA e EMA recomenda preparar um alto e um baixo QC para validação de doseamento e rotina testes^1,14.
   1. Por exemplo, para obter um QC a 10 µ g/mL, adicione 10 µ l de controlo positivo das ações de 1 mg/mL em 990 µ l da matriz relevante (por exemplo, CSF) para um volume total de 1.000 µ l.
   2. Alíquota as amostras QC em um volume adequado para um único usam (por exemplo, 50 µ l) e congelam as alíquotas em -60 a-80 ° C¹.
   3. Alíquota um corte-ponto-controle (CC), espécie-específicos matriz não tratada com o artigo de teste (por exemplo, em pool CSF ou soro) para um único uso (por exemplo, 50 µ l) e congelar as alíquotas em -60 a-80 ° C¹.
3. Realize uma reação de conjugação entre o fluoróforo e a ERT usando um kit de proteína-rotulagem de acordo com protocolo^{15 do fabricante}. Alíquota da amostra em um volume adequado para um único uso (por exemplo, 50 µ l) e congelar as alíquotas em -60-80 ° c.

2. dia 1: Chapeamento de célula e preparação da amostra

1. Preparação da placa de células
   1. Usar um capuz de cultura de tecidos e manter um ambiente asséptico para as etapas seguintes. Pulverize a cada objeto que será colocado no capô com 70% de etanol e manter um ambiente limpo,^16,17,18.
   2. Aquecer o meio de crescimento celular (por exemplo, com 10% fetal bovino soro e 1% penicilina-estreptomicina RPMI-1640) num banho de água ou talão a 37 ° C¹⁹.
   3. As células Jurkat de linfócitos contagem o T humana e placa 100 µ l por alvéolo em 7,5 x 10⁵ células/mL em um fundo redondo 96 poços células adequadas para uso em um citômetro de fluxo, equipado com um carregador placa placa de cultura.
      1. Por exemplo, use um hemocytometer ou um contador de célula automatizada para contar as células de^20,21.
      2. Certifique-se de que as células têm pelo menos 70% viabilidade antes de prosseguir com o experimento (por exemplo, avaliar a viabilidade com coloração azul trypan)¹⁷.
   4. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C com 5% CO₂ e 95% de umidade durante a noite para 14 – 20 h.
2. Preparação da amostra de rastreio
   1. Diluir o assunto ou ensaio de amostras controle usando media serum-free (por exemplo, RPMI-1640). O método de exemplo aqui, dilua as amostras 1: 2.5 em RPMI-1640 adicionando 60 µ l da amostra a 90 µ l de soro livre mídia. (por exemplo, 8-faixa de tubos). Siga para o passo 3.1 para o procedimento de ensaio preparar um fluoróforo-rotulado ERT.
      Nota: A diluição de 1: 2.5 foi determinada experimentalmente e é ideal para o método apresentado aqui. Diluições da amostra ideal devem ser determinadas para cada método que é desenvolvido.
3. Confirmação do grânulo e amostra preparação
   1. Calcule o número de grânulos de ERT-conjugado necessário para amostras de confirmação.
      1. Por exemplo, para 10 amostras, usar 10 µ l de amostras x 100 de grânulos ERT-conjugados por amostra + 30% extra para compensar eventuais perdas durante a etapa de lavagem = 1.300 µ l de grânulos ERT-conjugados.
   2. Vórtice os grânulos completamente. Adicione o número estimado de grânulos para um tubo cônico de 15 mL para lavar.
   3. Lave os grânulos magnéticos de ERT-conjugados adicionando 1.300 µ l de tampão de ligação ou como sugerido pelo fabricante (por exemplo, com tampão fosfato salino com 0,1% polissorbato 20) seguindo os passos abaixo¹³.
   4. O tubo de vórtice completamente. Coloca o tubo em um rack de tubo magnético por 2 min. Sem perturbar os grânulos, cuidadosamente Aspire e descartar o sobrenadante.
      Nota: A solução girará de castanho escuro para claro quando os grânulos são puxados para o ímã.
   5. Resuspenda os grânulos com 1.300 µ l de tampão de ligação. Repita as etapas de lavagem para um total de quatro lavagens.
   6. Após a lavagem final, suspenda os grânulos em 1.300 µ l de tampão (anteriormente calculado na etapa 2.3.1.1) de ligação. Adicione 100 µ l por bem para um 96 poços, branco, fundo redondo, vinculativas polipropileno placa de acordo com o mapa de placa (por exemplo, uma confirmação bem por amostra ou QC; a vontade de amostra ser dividido em duplicatas quando incubadas com o fluoróforo-rotulado ERT).
   7. Colocar a placa em um ímã de lado-contornou de 96 poços e permitir que os grânulos formar um pellet. Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante claro e descartá-lo.
      Nota: A solução vai virar de escuro marrom a clara após aproximadamente 1 – 2 min sobre o ímã de lado-contornou. Os grânulos obtidos são chamados os grânulos "secos".
   8. Se as amostras selecionados positivas e estão sendo confirmadas, adicione 100 µ l de cada amostra com e sem grânulos ERT-conjugados para o apropriado/atribuído bem. Selar a placa com um filme plástico e agitá-lo durante pelo menos 60 min em um agitador rotativo a aproximadamente 800 rpm, à temperatura ambiente (RT).
      Nota: Anteriormente preparado e congelado, positivos e negativos QCs e o CC devem ser incluídos em cada prato.
   9. Após a incubação, coloque a placa de confirmação sobre o ímã de lado-contornou de 96 poços e permitir que os grânulos formar um pellet.
4. Preparação de série de diluição de título
   1. Para preparar uma série de título, serialmente, diluir a amostra na matriz em pool, um número suficiente de vezes para atravessar o título predeterminado corta ponto¹.
   2. Por exemplo, misture 30 µ l da amostra de 60 µ l de matriz em pool em uma série de diluição de 1:3 para um total de 8 diluições (por exemplo, 8-faixa de tubos). Siga para o passo 3.1 para o procedimento de ensaio preparar ERT fluoróforo-rotulados.

3. dia 1: Procedimento de ensaio

1. Prepare o ERT fluoróforo-rotulado no meio livre de soro (por exemplo, 60 µ l por bem, ou aproximadamente 6 mL/placa).
   1. Por exemplo, para preparar 10 mL de 1 µ g/mL fluoróforo-rotulado ERT, adicionar 10 µ l de 1 mg/mL estoque ERT fluoróforo-etiquetadas a 9,99 mL de soro livre de mídia (por exemplo, RPMI-1640).
2. Em uma nova incubação placa (por exemplo, placa de polipropileno de 96 poços, branca, fundo redondo, vinculativa), adicionar as amostras preparadas de passo 2.2, 2.3, ou 2.4 e um fluoróforo-rotulado ERT em uma mistura 1:1 em poços duplicados (por exemplo, transferência de 60 µ l de cada preparada a amostra e adicionar 60 µ l do ERT fluoróforo-rotulado por alvéolo).
   Nota: Um mapa de placa de experiência de exemplo é fornecido na Figura 1.

Figura 1: exemplo de um layout de placa de experiência. Amostras e um fluoróforo-rotulado ERT foram incubados durante a noite a 2 – 8 ° C. Controles tais como controle de qualidade (HQC), controle de baixa qualidade (LQC) e controle de qualidade negativa (NQC) foram selecionados e confirmados em cantos opostos da placa para avaliar a uniformidade da placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Misture as amostras e a ERT fluoróforo-rotulado por pipetagem para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta multicanal. Embrulhe as placas na folha e incube-os durante a noite a 2 – 8 ° C por 14 – 20 h.

4. dia 2: Adicionar as amostras preparadas para as células

1. Remover placas de incubação da amostra de incubação a 2 – 8 ° C e aquecer os pratos, colocando-os em um banho de pérola a 37 ° C por 10 a 15 min.
2. Remova as células a incubadora de CO₂ . Execute uma verificação visual das células chapeadas usando um microscópio invertido para garantir que as células aparecem saudáveis e uniformemente distribuída em toda a poços^17,19.
3. Adicione 100 µ l das amostras previamente misturadas e ERT fluoróforo-etiquetados para uma placa de células de acordo com o mapa de placa experimental.
4. Coloque a placa de celular com as amostras adicionadas para a incubadora de CO₂ a 37 ° C. Incubar a placa por 3 h e ± 15 min.
   Nota: Desta vez foi criada em laboratório como ideal para a resposta de sinal-ruído no ensaio.
5. Centrifugue a placa de celular para 6 min a 320 x g em uma centrífuga de mesa 14 e 18 ° c. Confirme a presença de um sedimento celular no fundo dos poços da placa.
6. Segure a placa em um ângulo de 30 a 45°. Retire cuidadosamente o sobrenadante de cada poço sem perturbar o centrifugado. Adicione 200 µ l de 1 x DPBS para o centrifugado em cada poço para Ressuspender as células.
7. Repita a célula lavar as etapas para um total de 3 lavagens. Dirijam-se para a etapa 5 para a coloração de viabilidade celular.

5. dia 2: Viabilidade de coloração de células

1. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 µ l de uma solução de trabalho de 1 x mancha Live/mortos para cada poço, selecionado para um comprimento de onda de emissão difere do ERT fluoróforo-etiquetadas e preparado de acordo com instruções^{22 as indicações do fabricante}.
2. Incube a placa por 15 min em RT no escuro. Centrifugue a placa para 6 min a 320 x g em uma centrífuga de mesa 14 e 18 ° c.
3. Retire cuidadosamente o sobrenadante de cada poço sem perturbar o centrifugado. Lavar as células 1 x com 1 x DPBS.

6. dia 2: Fixação das células com 1% paraformaldeído

1. Usando uma pipeta multicanal, dispense 100 µ l de refrigerados (a 2 – 8 ° C) 1% paraformaldeído (PFA) em cada poço.
2. Sele as placas e delicadamente o vórtice de pulso para misturar. Embrulhe a placa na folha e coloque-o a 2 – 8 ° C durante pelo menos 10 minutos para permitir a fixação.
   Nota: Tenha cuidado para evitar salpicos para o selo de placa.
3. Adicione 50 µ l de 1 x DPBS em cada poço usando uma pipeta multicanal de cima e para baixo antes da análise.

7. fluxo Cytometry

1. Coloque as placas sobre o citômetro de fluxo com o carregador de placa e executá-las.
2. Adquirir e registrar a intensidade de fluorescência médio medido (IFM) usando o software de citometria de fluxo (ver Tabela de materiais).
   Nota: Consulte a Figura 2 como um exemplo para as configurações do carregador. A taxa de fluxo de amostra, volume de amostra, misturando volumes, velocidades de mistura e número de misturas são otimizados para este ensaio. Esses critérios podem ser ajustados usando os botões "setas acima" ou "para baixo", ao lado os números para cada critério, dependendo do fluxo cytometry aquisição software²³.

Figura 2: exemplo das configurações do carregador de citômetro de fluxo. As configurações do carregador devem ser otimizadas para cada ensaio que é desenvolvido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Crie um citômetro análise/portões/parcelas conforme mostrado na Figura 3.
   Nota: A criação de portal e aplicação podem ser diferentes para cada fluxo cytometry software²³.

Figura 3: estratégia de retenção de citometria de fluxo. Células Jurkat foram separou os eventos totais e coletadas por conspirar para diante-scatter (FSC) vs lado-scatter (SSC) canais e puxando um portão ao redor da população-alvo. Camisolas interiores (células únicas) foram separados das parelhas ou maior célula agrega usando a área FSC (FSC-A) e canais FSC (FSC-H) de altura. Células vivas foram escolhidas por retenção de células singlet negativo para uma mancha de viabilidade. A intensidade de fluorescência mediana (IFM) foi medida em células Jurkat de single, ao vivo e é plotada como um histograma. Os valores de IFM de células com a absorção de drogas bloquearam (por exemplo, HQC) e de células com controle de quantidades de absorção são mostradas (vermelho e azul, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Excluir células mortas a partir da análise e gravar aproximadamente 10.000 eventos²³.

8. análise de dados

1. Exportar os dados (IFM cru) para o software de análise (ver Tabela de materiais).
   Nota: Dependendo da análise necessária, a análise de dados a seguir pode ser realizada usando o software de análise.
2. Calcule a média das IFM de poços duplicados (QCs e amostras) e o coeficiente de variação (% CV) para avaliar a variabilidade de propagação das duplicatas da média.
   
   
   
3. Para amostras e QCs que foram projectados no ensaio, calcular a porcentagem sinal (% SI) de inibição em relação a IMF média da para a matriz em pool QCs CC.
   
4. Se necessário, calcule as taxas de recuperação (RRs) para o QCs confirmados e amostras em relação os valores correspondentes da tela.
   

No primeiro dia do método, uma alíquota congelada de células Jurkat foi descongelada e chapeada, e as amostras foram preparadas. A Figura 1 mostra um mapa de placa de exemplo. No segundo dia, as amostras foram misturadas com as células Jurkat e incubadas a 37 ° C por aproximadamente 3 h e 15 min. As células foram então lavadas, fixo com PFA e analisadas em um citômetro de fluxo. A Figura 2 mostra o fluxo exemplo citômetro configurações.

A citometria de fluxo, retenção de estratégia foi projetada para medir a quantidade da droga fluoróforo conjugado ao vivo único Jurkat células24 (Figura 3). As células foram separadas de detritos desenhando um portão que exclui restos celulares [normalmente, baixa dispersão para a frente (FSC)] e as células mortas [normalmente, lado alto dispersão (SSC)], deixando apenas as células vivas para análise25. Células únicas foram então separadas de clusters de célula desenhando um portão que exclui a área alta do FSC e FSC baixa altura26. As células foram tratadas com uma mancha de viabilidade rotulado quaisquer células mortas ou insalubres sem uma membrana intacta, e uma porta adicional foi criada para excluir as células mortas,22. A IMF das células única ao vivo foi utilizada para a análise da absorção ERT fluoróforo conjugado. Como um exemplo do potencial de resultados de ensaio de triagem, matrix cravado com uma quantidade elevada de substituto anticorpo antidrogas controle positivo [por exemplo, controle de qualidade (HQC)] inibiu a captação ERT fluoróforo-conjugado, resultando em uma baixa IFM de aproximadamente 300 (Figura 3). Em contraste, as células incubadas com a matriz na ausência do anticorpo de controlo positivo devem ter uma maior IFM (MFI = 37.830 na Figura 3), demonstrando a absorção do ERT fluoróforo conjugado.

O neutralizando anticorpos controle positivo para o exemplo aqui foi selecionado com base no mecanismo de ação da droga (ou seja, a absorção ERT através de CI-M6PR). Um painel de fluorophores também foi testado e comparado para ensaio ótima sensibilidade e gama dinâmica1. CypHer 5e foi testado devido ao seu aumento da fluorescência em um pH ácido, que pode ser relevante para alguns ERTs como uma medida adicional de direcionamento dos lisossomos da droga27. Um corante fluorescente verde (por exemplo, Alexa Fluor 488) e uma tintura fluorescente far-red (por exemplo, Alexa Fluor 647) foram também examinados. Um exemplo de quão diferente fluorophores pode executar é apresentada na figura 4a e 4b. No exemplo, o Alexa Fluor 647 ERT teve o melhor desempenho devido a sua sensibilidade superior (por exemplo, o mais alto % SI na menor concentração de PC) e ampla faixa dinâmica (~ 3 ordens de magnitude).

Figura 4: exemplo de resultados de diferentes fluoróforo-ERT conjugados. (A) durante o desenvolvimento do ensaio, uma curva de diluição do controle positivo (PC) deve ser avaliada usando diferentes ERTs fluoróforo conjugado. No exemplo mostrado aqui, dois fluoróforo conjugado ERTs (Alexa Fluor 488 e CypHer 5e) 6,25 µ g/ml e um brilhante fluoróforo conjugado ERT (Alexa Fluor 647) 1,56 µ g/ml foram testados na presença de concentrações crescentes de NAbs controle positivo. (B), este painel mostra as curvas de painel A graficamente, usando IFM para mostrar o aumento significativo no intervalo dinâmico usando um ERT Alexa Fluor 647-conjugados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método descrito é uma abordagem faseada para detectar, confirmando e um nível quase quantitativo de NAb título3de interpolação. Para estabelecer o ensaio está pronto para validação, os parâmetros, incluindo o ensaio de sensibilidade, precisão, seletividade, especificidade, tolerância de droga, robustez, e pontos de corte devem ser avaliados de acordo com estabelecido guidances1,3 .

As amostras foram consideradas potencialmente positivas neste ensaio quando % SI valores maiores do que o rastreio corta ponto (SCP) foram obtidos. O SCP foi determinado estatisticamente testar amostras de drogas-ingênua de uma população representativa e medindo uma diminuição relativa (SI) de intensidade de sinal3. Orientação (por exemplo do FDA) recomenda que o SCP é estabelecido noth percentil 95 do conjunto de dados normalmente distribuído e métodos para o cálculo do SCP têm sido descritos em detalhe em outro lugar1. Qualquer amostra que diminuiu o sinal de ensaio (medido como o aumento da % de SI) igual ou superior o SCP estava determinada a ser potencialmente positiva e as amostras com resultados mais elevados do que o SCP (com n mudar ou diminuir no % SI) são considerados negativos.

Amostras que projectados positivo (% SI acima o SCP) foram testadas no ensaio de confirmação para determinar a especificidade de NAbs para o ERT. O teste de confirmação foi realizado por pré-incubação de amostras com grânulos magnéticos ERT-conjugados para remover anticorpos específicos drogas ou fatores inibitórios. O RR (a taxa de confirmação das IFM para triagem das IFM) foi avaliado para determinar que o número de NAbs retiradas da amostra. Um RR superior ao limiar calculado de positividade [ou seja, o ponto de corte confirmação (CCP)] indicou a presença de NAbs antidrogas. Como o ensaio de triagem, o CCP primeiro deve ser estabelecido através da avaliação de amostras de tratamento de uma população representativa no ensaio de confirmação. CCP foi baseado em uma taxa de falso-positivo de 1% estatisticamente determinado e foi o limiar designando uma amostra positiva confirmada (Figura 5)3.

Amostras que rastreada e confirmada positiva foram serialmente diluídas e testadas no ensaio de titulação para determinar o nível relativo ou título de NAbs em cada amostra. A maior diluição em que uma amostra testes positivos quando cruzava um limiar designado [por exemplo, o título de corte de ponto (TCP)] é o título (Figura 5) amostra1,3.

Figura 5: amostra de exemplo, os resultados dos testes. Estes painéis mostram exemplos de amostras que testou positivo ou negativo nos exames acima ou abaixo de um SCP de 17.51% SI. Amostras positivas em seguida foram analisadas com o teste de confirmação usando drogas-conjugado magnéticos grânulos para esgotar o anticorpo específico de drogas das amostras antes de serem testadas no ensaio de. Amostras com um rácio de recuperação (RR) maior do que o ponto de corte confirmação (i.e., RR = 1.315) foram considerados positivos para ser confirmada. Amostras que confirmaram positivo foram diluídas até o sinal cruzou o título ponto (TCP) para estabelecer o título (fator de diluição), no qual o resultado da amostra é igual a do título corta ponto de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Ensaio de repetitividade e variabilidade foram testados durante vários dias e com mais de um analista. As QCs foram inicialmente preparado em um lote e subaliquotadas para uso 1x. Ao longo de 3-d, dois analistas realizado o ensaio com vários conjuntos de QCs para demonstrar a precisão do ensaio. Nos dados de exemplo mostrados, o CV % de precisão intere intraensaio para os QCs são menos do que a recomendação, a orientação FDA de % CV < 20% (Figura 6)1.

Figura 6: exemplo de QC precisão dados gerados durante três dias com dois analistas. Os dados de precisão foram calculados por análise de variância (ANOVA) usando a fórmula apresentada em DeSilva et al 28. o intralote (dentro de corridas) e estatísticas de inter lotes (entre execuções) são relatadas como % CV clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores são colaboradores e acionistas da BioMarin Pharmaceutical Inc.