Aqui, apresentamos um protocolo para matrizes de anticorpos identificar alterações nas vias de sinalização em vários modelos de celulares. Estas mudanças, causadas por drogas/hipóxia/ultra-violet luz/radiação ou superexpressão/downregulation/nocautes, são importantes para vários modelos da doença e podem indicar se uma terapia será eficaz ou pode identificar mecanismos de drogas resistência.
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Artigo de método
Avaliação da resistência aos inibidores de tirosina quinase por um interrogatório das vias de transdução de sinal por matrizes de anticorpo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pacientes com câncer com um regulamento aberrante das redes de fosforilação de proteínas são frequentemente tratados com os inibidores de tirosina quinase. Quase 85% as taxas de resposta são comuns. Infelizmente, os pacientes muitas vezes se tornam refratários ao tratamento, alterando suas vias de transdução de sinal. Uma implementação do perfil de expressão com microarrays pode identificar as alterações do nível de mRNA em geral, e proteomics pode identificar as mudanças globais nos níveis de proteína ou pode identificar as proteínas envolvidas, mas a atividade da transdução do sinal caminhos só podem ser estabelecidos por interrogar modificações borne-translational das proteínas. Como resultado, a capacidade de identificar se um tratamento medicamentoso for bem-sucedida ou se resistência surgiu, ou a capacidade de caracterizar qualquer alterações nas vias de sinalização, é um importante desafio clínico. Aqui, nós fornecemos uma explicação detalhada das matrizes de anticorpo como uma ferramenta que pode identificar alterações de todo o sistema em várias modificações borne-translational (por exemplo, a fosforilação). Uma das vantagens do uso de matrizes de anticorpo inclui sua acessibilidade (uma matriz não requer um especialista em proteômica ou equipamento caro) e a velocidade. A disponibilidade de matrizes, visando uma combinação de modificações borne-translational é a principal limitação. Além disso, abordagens imparciais (phosphoproteomics) podem ser mais adequadas para a descoberta do romance, Considerando que o anticorpo matrizes são ideais para os destinos mais amplamente caracterizados.
Introdução
A aplicação clínica dos inibidores da quinase de tirosina alvo (TKI) transformou-se tratamento de câncer, fornecendo os médicos com ferramentas eficazes para atingir as proteínas específicas essa transformação neoplásica de carro. Estes compostos inibem ou bloqueiam a fosforilação de proteínas alvejado de tirosina quinases1,2. TKIs foram desenvolvidos em parte porque as alterações genéticas na chave de vários genes de sinalização são suficientes para unidade câncer início e progressão [por exemplo, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), quinase de tirosina-proteína proto-oncogene Src (SRC), BCR-ABL e receptor de fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2]3,4. O impacto de TKIs sobre o ciclo celular5 e a de vias de sinalização molecular6 representa uma transformação do não segmentados para o tratamento de câncer molecularmente guiada. A principal vantagem dos TKIs versus quimioterapia é as taxas de resposta maior e o menor risco de toxicidade para as células saudáveis7. Como resultado, lá tem vindo a aumentar a atenção na pesquisa e no desenvolvimento do romance TKIs.
Acesso aos resultados de sequenciamento genômico começou com o projeto genoma humano8,9,10 e continua hoje com várias geração (NextGen) câncer sequenciamento esforços [por exemplo, o genoma do câncer Atlas (TCGA)11,12]. Isso inspirou muitas metodologias experimentais que fornecem informações simultâneas sobre milhares de genes e/ou fornecem instantâneos imparciais de genes ou proteínas moduladas por perturbações biológicas13. Desde que o Regulamento da função celular ocorre em múltiplos níveis, a partir da transcrição de genes para a modificação pós-traducional de proteínas e a sua actividade, uma compreensão completa dos eventos controlando a função celular será em última análise, requerem uma integração de dados de várias leituras biológicas. A capacidade de monitorar os níveis de RNA mensageiro (mRNA) de milhares de genes com uma resolução de célula única gene aumentou a capacidade de fazer inferências sobre a função dos genes e interações em uma escala do inteiro-genoma. No entanto, a interpretação de matrizes de expressão do gene sempre será inerentemente incompleta sem a integração de outros níveis de regulamentação: ou seja, os níveis de expressão de proteínas, os Estados de modificação de proteína e a proteína pós-traducional modificações (fosforilação, ubiquitylation, metilação, etc.). Aqui, descrevemos o utilitário de matrizes de anticorpo como meio para interrogar modificações borne-translational de componentes importantes de sinalização como uma função de várias condições em uma única experiência14,15, 16.
Matrizes de fosfo-anticorpo podem ser empregados para distinguir e analisar as alterações no de vias de transdução de sinal16. Estas podem surgir de uma modificação genética ou tratamentos de linhas celulares com inibidores da quinase, chemotherapeutics, estresse causado pela inanição de privação, hipóxia ou soro de glicose. De nota, a resistência de droga ou de um gene específico - up ou downregulation também pode causar mudanças no de vias de transdução de sinal17.
Resistência às drogas, por exemplo, pode surgir de mutações do alvo para evitar a sensibilidade. Em câncer de pulmão, conhecido mutações do EGFR processam o câncer insusceptíveis de certas TKIs, mas mais suscetíveis a outros. Alternativa de vias de sinalização pode ser ativada após a mutação17. Como uma aplicação mais ampla para a identificação de vias de transdução de sinal envolvidas na resistência e hipóxia, etc., matrizes phospho-anticorpo fornecem mais a introspecção e, consequentemente, a compreensão de, os mecanismos envolveram.
Tecnologias que permitissem uma avaliação de modificações de proteínas representam um componente importante da biologia de sistemas porque muitas vezes servem uma função reguladora, tais como a atividade de uma enzima ou as interações físicas entre proteínas de modulação. A importância das modificações borne-translational é ilustrada pelo papel da fosforilação de proteínas em quase todos os sinal extracelular acionadas transdução vias18. Tradicionalmente, a identificação de quinases ou do estado de fosforilação de proteínas também pode ser determinada por análise ocidental do borrão, especialmente se o pesquisador está interessado em apenas 1 – 5 alvos. No entanto, borrões ocidentais são muito seletivos e podem ser inclinados para o conhecimento prévio e podem perder alvos importantes como resultado. Anticorpo matrizes fornecem uma leitura de rendimento médio de alvos múltiplos incorporando vários anticorpos de captura [pan-específicos fosforilada tyrosine(s), antiubiquitina, etc] em uma matriz sólida (por exemplo, vidro ou nitrocelulose). Anticorpos secundários fornecem informações sobre proteínas específicas em um formato de ELISA baseado em sanduíche (Figura 1). Este ensaio se torna mais poderoso e pertinente como mais alvos são de interesse ou o conhecimento prévio é restrito15. As phospho-matrizes são mais amplamente empregáveis como podem comparar a fosforilação, bem como gerais quantidades de proteína de uma ampla variedade de destinos em um experimento e fornecem uma quantificação significativamente melhorada através de espectrometria de massa. Esta técnica não é aplicável para a identificação dos sítios de fosforilação novas ou desconhecidas.
Proteômica de espectrometria de massa-baseado em larga escala pode ser empregada para identificar sites específicos da fosforilação de proteínas19. Embora essa técnica pode enumerar milhares de eventos borne-translational, requer instrumentação cara, dutos experimentais dedicados e uma experiência computacional que estão fora do alcance da maioria dos pesquisadores.
Matrizes de anticorpo fornecem uma leitura simultânea em várias proteínas leituras16. Estes podem ser mudanças na proteína ubiquitylation (matriz de ubiquitina) ou fosforilação. A principal vantagem dessa tecnologia de matriz é que fornece importante feedback sobre o estado biológico de vários caminhos biológicos associados a parâmetros de célula importante (proteínas de 53 kDa, p53, quinase de tirosina do receptor e vias intracelulares) ao mesmo tempo. Além disso, é possível combinar vários tipos de matriz para aumentar a penetração de um ensaio (por exemplo, apoptose e ubiquitina e fosforilação). Esta capacidade de combinar várias matrizes para avaliar várias alterações pós-tradução em várias amostras simultaneamente de uma vez - e cost - effective forma que não requer instrumentação específica ou conhecimentos é uma vantagem significativa no caso de matrizes de anticorpo.
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Protocolo
1. extração de proteínas
- Placa de 5 x 106 células em uma placa de cultura de tecido de 10 mm (ou frasco) de um capuz de cultura de tecidos. Conte as células no momento do chapeamento com um contador automático de células ou hemocytometer. Alternativamente, estime a contagem de células.
- Enxagúe as células cultivadas na chapa de 10 mm (ou frasco) completamente 3x com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) (pH = 7,4). Certifique-se de remover todos os PBS antes de adicionar a Lise.
Nota: A lise é normalmente fornecido com o kit. Se não, então usar um buffer de ensaio radioimmunoprecipitation (RIPA) ou qualquer outro tampão de lise celular que contém um coquetel de inibidores de protease e fosfatase. - Lyse 1 x 107 células/mL de células no buffer de Lise, adicionando a quantidade correta de buffer para as células e raspando as células com um raspador de célula para o buffer de Lise. (por exemplo, para as células HeLa e MiaPaCa-2, use 600 µ l por placa de 10 cm).
- Pipetar o lisado acima e para baixo (aproximadamente 10 x) e transferi-lo para um novo tubo de 1,5 mL.
- Incube os lysates por 30 min a 4 ° C, de preferência em um balancim/shaker. Pressione o lisado por meio de uma seringa com uma agulha 27G x 10 garantir uma interrupção adequada do cell membrane(s). Em alternativa, proceda à sonicação o lisado. Armazenar os lysates a-20 ° C ou usá-los imediatamente.
- Centrifugue o lisado a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min e transferir o sobrenadante para um tubo limpo 1,5 mL.
- Dosar a quantidade de proteína total por bicinchoninic ensaio ácido (BCA)20 ou equivalente como Lowry ou Bradford e continuar pelo menos 50 – 400 μg. Use as proteínas imediatamente ou alíquota e congelamento/loja-los a-70 ° C (evitar vários ciclos de congelamento e descongelamento).
2. humano fosfoquinase matriz
- Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente antes de começar (por cerca de 1h).
Nota: Todos os reagentes e desgaste de plástico estão incluídos no kit. - Preparar todos os reagentes frescos (buffers de matriz) antes de iniciar o procedimento seguindo as instruções do fabricante (dependendo a escolha de objectivos/matrizes, as instruções podem variar ligeiramente).
- Reconstituir os cocktails de anticorpo deteção em 100 μL de água desionizada ou siga as instruções do fabricante devem diferem para o tubo de ensaio de 1,5 mL fornecido.
- Preparar o tampão de lavagem 1X diluindo 40ml de 25 x tampão de lavagem em 960 mL de água desionizada e misturá-los por inversão.
Nota: Cristais dissolvem à temperatura ambiente. O buffer pode amarelar com o tempo, mas ainda funcionará. - Pipete 1 mL de tampão de matriz 1 em cada poço de uma bandeja multi 8 poços (ou 2 mL em uma bandeja multi 4-bem).
- Com uma pinça de ponta plana, retire as membranas de matriz entre as folhas protetoras e colocá-los em poços. Certifique-se que os números na membrana estão virada para cima.
Nota: Após a submersão, o corante na membrana irá desaparecer. - Cubra a bandeja com uma tampa e incube-lo num agitador de plataforma oscilante para 60 min à temperatura ambiente.
Nota: Esta é a etapa de bloqueio de membrana. - Durante o período de incubação, prepare as amostras da proteína. Adicione 50 – 100 μg de proteína total. Dilua o lisado, tendo um volume máximo de 334 μL, com tampão de Lise até um volume final de 1 mL.
Nota: 50 a 100 μg de proteína total geralmente é suficiente. - Aspire cuidadosamente o buffer matriz 1 e incubar as membranas com 1 mL das amostras durante a noite a 2 – 8 ° C num agitador de plataforma oscilante.
Nota: Não toque/riscar as membranas. - No dia seguinte, lave a matriz cuidadosamente removendo cada matriz e colocá-lo em recipientes de plástico individuais (aproximadamente 8 x 11 cm2) com 20 mL de tampão de lavagem 1 x. Lave as membranas 3 x 10 min em uma plataforma de balanço em 1x tampão de lavagem à temperatura ambiente.
- Adicionar 20 μL do anticorpo reconstituído cocktail de passo 2.3 para 1 mL de tampão de matriz 2 1x. Adicione 1 mL desta solução para cada 8 poços para ser usado.
- Cuidadosamente, remova as membranas as bandejas de lavagem. Borre a borda inferior para as toalhas de papel para remover qualquer tampão de lavagem em excesso e transferi-los de volta na bandeja contendo os cocktails de anticorpo. Cubra a bandeja com a tampa e incube-lo por 2 h à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço. Cuidadosamente lave as bandejas usadas com dH2O e secá-las para uso posterior.
- Cuidadosamente, remova cada matriz e colocá-los de volta para os recipientes de plástico limpo individuais (aproximadamente 8 x 11 cm2) com 20 mL de tampão de lavagem 1X. Lave-os 3 x 10 min com o tampão de lavagem em uma plataforma de balanço à temperatura ambiente.
- Dilua o Streptavidin-HRP (fornecido com o kit) ou tintura de streptavidin-fluorescente (para uma detecção mais quantitativa) 1:1,000 no buffer de matriz 2 em um tubo de ensaio de 15 mL de 1x.
- Retorno as membranas para os pratos de 8 poços contendo a solução de HP e incube-os por 30 min à temperatura ambiente em uma plataforma de balanço (se usando fluorescência, envolva a bandeja em folha de alumínio para evitar qualquer exposição à luz).
- Remova o excesso buffer, colocando a membrana entre 2 pedaços de 5 mm de papel de 3 M. Para tratamento de imagens com uma câmera de filme/quimioluminescente de raio-x, incubar as membranas secas com uma solução de deteção de HRP (quimioluminescente mistura as duas soluções de 1:1) por 3 min e colocar a membrana em um protetor de folha de plástico transparente.
Nota: Membrane(s) secas também pode ser colocados em um sistema de imagem fluorescente para detectar o sinal fluorescente; Minimize a exposição à luz para a membrana antes de imagem. Para uma quantificação dos arquivos de filme ou câmera de raios-x, evite a superexposição. A maioria das impressoras a quimioluminescente/fluorescentes têm uma função para evitar a saturação do sinal.
3. análise de dados
- Baixar ImageJ, uma programa21, de processamento de imagem e instalar o software.
- ImageJ aberto clicando duas vezes no 'ícone do ImageJ ' ' '. Selecione a imagem a ser analisado clicando em 'Arquivo' na barra de menu, em seguida, selecione 'Abrir' do menu drop-down e procure os arquivos do computador para a imagem de interesse. Clique no arquivo para abri-lo.
- Inverta a foto para a análise (manchas pretas sobre fundo branco com manchas brancas sobre um fundo preto) clicando em 'Editar' na barra de menu e selecionando 'Inverter' do menu drop-down.
- Selecione o ícone' oval' na barra de ferramentas (a segunda opção da barra de ferramentas do ImageJ). Desenhe um círculo/oval clicando na imagem (Cruz preta) e movendo o mouse. Ajuste a tamanho/forma do círculo/oval para cercar os pontos sobre o borrão de ponto.
- Clique em 'Analisar' na barra de menu e selecione 'Medida' do menu drop-down para abrir automaticamente uma nova janela com os valores da área selecionada (área, média, mínimo e máximo).
- Mover a área circular arrastando o círculo do centro (colocar o ponto da seta para a direita no meio) e coloque-o em torno da próxima área de medição (ponto). Medir todos os pontos de interesse, o controle positivo, controle negativo e o plano de fundo para a análise.
Nota: O controle negativo é o PBS, o fundo é uma parte da membrana sem qualquer mancha (qualquer parte vai fazer), e o controle positivo é um controle fornecido pelo fabricante. - Selecione os pontos de controlo negativo PBS e subtraia o valor de cada ponto. Média da intensidade para cada par de pontos duplicados que representa cada receptor tirosina quinase (RTK). Cada intensidade média pode estar relacionada com o controle para calcular a variação de dobra.
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Resultados
Para investigar o efeito da resistência de TKI em vias de transdução de sinal em linhas celulares, quatro amostras foram analisadas. Uma amostra de controlo (H3255r1) e 3 linhas de célula TKI-resistente (H3255r2-4) (Figura 2) foram relacionadas ao modelo de detectar anticorpos (Figura 3). 4 todas as amostras foram preparadas usando este protocolo. Seis fosfoproteínas com atividade diferencial foram escolhidas para a demonstração ...
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Discussão
Abordagens que combinam muitas leituras biológicas são inerentemente mais precisas representações da maquinaria celular em um experimento realizado. O advento de matrizes phospho-anticorpo permite uma rápida caracterização do padrão de modificações que podem ser mais informativo do que o status de modificação de qualquer proteína única. O fluxo de trabalho geral para a aplicação das disposições do phospho-anticorpo é baseado em uma modificação em serina, treonina ou tirosina. Este exemplo focada em caracterizar as mudanç...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o generoso apoio financeiro do Lawrence J. Ellison Instituto de transformadora medicina da USC (um presente para David Agus). Agradecemos o apoio do outono Beemer e Lisa Flashner que conduzem à geração e publicação deste manuscrito. Agradecemos seu apoio administrativo-Laura Ng.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| Tubo de 1,5 mL | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate tamponed Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | tampão de lavagem para extração de proteínas |
| Placa de cultura de tecidos 100 mm | TRP | 93100 | |
| Seringa de insulina ICC U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27 G5/8, 1 mL para tratamento com agulha de amostras de proteína |
| Protein Profiler ARRAY | R& D | ARY003B | Matriz de fosfo humano MAPK |
| Protein Profiler ARRAY | R& D | ARY002B | Matriz de fosfoquinase humana |
| Centrífuga Eppendorf 5430R | Eppendorf | Centrífuga de mesa | |
| Pierce Kit de ensaio de proteína BCA | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX | M2 Molecular Devices | Leitor de absorbância para quantificação de proteínas | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Conjugado de estreptavidina para detecção fluorescente |
| LabGard ES Classe II, tipo A2 armário de biossegurança | NuAire | NU-425-400 | Capuz de cultura de tecidos |
| TC20 contador de células automatizado | Bio-Rad | 1450102 | Contador de células |
| Halt Protease & Coquetel Inibidor de Fosfatase (100x) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64 bits) | Microsoft |
Referências
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Reimpressões e permissões
