Method Article

A TreadWheel: Protocolo de treinamento de intervalo para suavemente induzido por exercício em Drosophila melanogaster.

DOI:

10.3791/57788

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June 8th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A TreadWheel usa movimento rotacional para suavemente induzir exercício em adultos Drosophila melanogaster explorando geotaxis de inata, negativo dos moscas. Permite a análise das interações entre o exercício e fatores, tais como o genótipo, sexo e dieta e seus efeitos em ensaios fisiológicos e moleculares para avaliar a saúde metabólica.

Abstract

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A incidência de doenças metabólicas complexas aumentou como resultado de uma transição generalizada para estilos de vida do aumento da ingestão calórico e níveis de actividade reduzida. Estas doenças multifatoriais surgem de uma combinação de fatores genéticos, ambientais e comportamentais. Uma doença tão complexa é a síndrome metabólica (MetS), que é um cluster de distúrbios metabólicos, incluindo hipertensão, hiperglicemia e obesidade abdominal. Exercício e intervenção dietética são os tratamentos primários recomendados por médicos para reduzir a obesidade e as doenças metabólicas subsequentes. Exercício de intervenção, nomeadamente aeróbio intervalo de formação, estimula mudanças favoráveis nos fatores de risco comuns para o tipo 2 Diabetes Mellitus (T2DM), doenças cardiovasculares (DCV) e outras condições. Com o afluxo de evidência descrever o exercício de efeito terapêutico tem na saúde metabólica, que institui um sistema de modelos de exercem em um ambiente controlado fornece uma ferramenta valiosa para avaliar os efeitos do exercício em um contexto experimental. Drosophila melanogaster é uma ótima ferramenta para investigar as alterações fisiológicas e moleculares que resultam da intervenção de exercício. As moscas têm expectativa de vida curta e mecanismos similares de metabolizar nutrientes quando comparado aos seres humanos. Para induzir o exercício em Drosophila, desenvolvemos uma máquina chamada a TreadWheel, que utiliza a tendência de geotaxis inata, negativo da mosca para induzir suavemente a escalada. Isso permite que os pesquisadores realizar experiências em grandes coortes de moscas geneticamente diversificadas para melhor compreender as interações genótipo-por-ambiente subjacente os efeitos do exercício na saúde metabólica.

Introduction

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Infância e obesidade adulta estão crescendo epidemias em culturas que consomem dietas calóricas elevadas e permanecem ocioso por longos períodos de tempo, que pode levar a graves consequências a longo prazo, incluindo a resistência à insulina, inflamação crônica e osteoartrose 1 , 2 , 3 , 4. a prevalência desses distúrbios continua a aumentar devido o crescente desequilíbrio na ingestão calórica e despesas atribuídas ao consumo elevado de gorduras e açúcares e um estilo de vida sedentário principalmente5. Correspondentemente, este desequilíbrio de energia tem levado a um aumento dos casos de tipo 2 Diabetes Mellitus (T2DM) e doenças cardiovasculares (DCV)5. Os indivíduos estão em um risco maior de desenvolver ambos os transtornos, se eles foram diagnosticados com o transtorno de síndrome metabólica (MetS), cujas sintomas incluem obesidade abdominal e dislipidemia2. MetS é formado por complexas interações entre genótipo e diversos fatores ambientais, tais como dieta e exercício6. Assim, para obter um entendimento completo dos mecanismos subjacentes da doença complexa, todos estes fatores devem ser considerados.

Quando se trata de combater o MetS, os médicos recomendam primeiro passando por mudanças de estilo de vida que incluem a comer uma dieta saudável, equilibrada e atividade física2,7,8. Desde medicamentos eficazes são limitados e a cirurgia de bypass gástrico é dispendiosa e requer acompanhamento médico ao longo da vida, a intervenção farmacológica e cirúrgica só é recomendada para casos graves e somente em combinação com essas mudanças de estilo de vida3 ,7,8. Enquanto as intervenções de estilo de vida, tais como exercício e dieta, podem produzir e manter metas de perda de peso a longo prazo, estas medidas corretivas ou não totalmente amenizar os efeitos negativos associados com MetS precisa de um estudo mais aprofundado7, 8.

Modelos de mouse têm sido utilizados para examinar os efeitos do exercício sobre doenças metabólicas durante anos; no entanto, a introdução do exercício para voar a pesquisa em MetS é uma relativamente recente empreendimento9,10,11,12. Moscas fornecem o veículo perfeito para estudar o exercício em um ambiente controlado de laboratório, desde que eles são facilmente manipulados, têm vida curta, são baratos de manter e vias metabólicas energéticas são altamente conservadas entre da drosófila e os seres humanos13. D. melanogaster genomas são bem caracterizadas, e há uma grande variedade de ferramentas de genética disponível para uso em Drosophila que podem fornecer insights diferentes genótipos e interações genótipo-por-ambiente que podem modular o efeito do exercício sobre a saúde14.

Métodos atuais de exercício Drosophila invocar a tendência da mosca geotaxis inata, negativo, o instinto comportamental para subir para cima, para estimular a escalada em adultos dentro de seus recintos11,12,15 . Torre de energia, um método para estimular o exercício de moscas, sistematicamente gera os cercos voar verticalmente e depois recua-los para a superfície da bancada, efetivamente batendo as moscas no fundo do frasco, induzindo assim seu instinto geotaxis negativo 12 , 16. experimentos conduzidos usando esta máquina mostraram que o exercício é um fator poderoso de proteção contra muitas doenças relacionadas à idade, incluindo CVD e T2DM e promove o envelhecimento saudável12,17,18 . Especificamente, eles demonstraram que exercício pode reduzir o início do declínio da mobilidade relacionada à idade em moscas e melhorar vários sintomas relacionados com a idade, como desempenho cardíaco e frisar a resposta17,18. No entanto, o controle voa nunca colocado na torre mostrou escores mais altos de escalada do que aqueles que experimentam a máquina, sugerindo que a força das gotas repetitivas pode estar ferindo as moscas e que afectam a mobilidade12. Isto sugere que um método alternativo de indução de exercício que é menos enérgica e evita causar trauma físico seria um método complementar, útil para a torre do poder protocolo n º16.

Para induzir suavemente exercício em Drosophila, desenvolvemos uma máquina de exercício chamada a TreadWheel (Figura 1). A TreadWheel é (doravante abreviado como TW) movimento rotacional desencadeia a tendência das moscas geotaxis inata, negativo redefinindo constantemente gravitacional topo dos frascos, que, por sua vez, estimula a escalada nas moscas. Ao contrário de outros métodos, o movimento rotacional do TW é inerentemente suave, que minimiza o número de estressores adicionais que podem surgir e os resultados de impacto. Assim, a máquina fornece os meios para induzir o exercício em grande número de moscas sem indução de estresse, que permitirá aos pesquisadores estudar os efeitos do exercício na saúde metabólica (Figura 2), envelhecimento, sono e muitos outros tópicos11.

Nosso método segue um inverso piramidal, o protocolo de treinamento de intervalo, que em grande parte, incorpora aspectos do intervalo aeróbio, treinamento (AIT) com alguma resistência exercício de treinamento. O regime padrão de AIT é alterado neste protocolo para aumentar gradualmente a duração de cada intervalo durante um período de cinco dias para promover a resistência. AIT tem sido particularmente útil na prevenção dos MetS em relação a outros métodos de intervenção e foi mais eficaz em reverter os fatores de risco comuns da síndrome metabólica de contínuo exercício moderado19,20. No entanto, uma desvantagem a TW em relação a torre de energia é que moscas se habituar mais rapidamente para o movimento de rotação, assim, variação na propensão inata para se habituar entre as moscas pode complicar a interpretação dos benefícios do exercício. 11 uma solução elegante para essa limitação é descrita por Watanabe e enigma15 e sua complementar do artigo21.

Protocol

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1. TreadWheel instalação e operação

Nota: Ver suplementar Figura 1 para esquemas sobre TW exercício de construção da máquina. As peças necessárias estão listadas na Tabela de materiais. As frases "TW", "TreadWheel", "máquina de exercício" e "máquina" é usada permutavelmente em todo o protocolo.

  1. Calibrar o motor usando o interruptor, tal que um período de rotação completa é 15 s (4 rpm). Calibre a velocidade de rotação da máquina antes de colocar frascos de voar em grampos protegidos anexados aos braços rotativos.
    1. Ajuste a velocidade usando um cronômetro padrão e um objeto imóvel temporariamente anexado à máquina, tais como um pequeno pincel grudado a tampa do motor com o pincel apenas tocando um dos suportes de rotação. Tempo o número de rotações em um minuto usando o objeto imóvel como ponto de referência e ajustar a velocidade para alcançar um período rotacional 15 s (4 rpm).

2. recolha e manutenção de voar

Nota: Todas as moscas são mantidas em uma incubadora de 25 ° C com 50% de umidade e um ciclo de luz/escuro de 12 h entre bancada manipulações descritas abaixo. Moscas são alimentadas uma dieta de laboratório de fubá-melaço padrão a menos que indicado o contrário.

  1. Preparar a postura de câmaras para cada genótipo de interesse usando placas de ágar de suco de maçã, uma gota de levedura colar por placa e 6 oz garrafas de plástico para recolher os ovos que eclodirão em larvas.
    1. Para preparar o suco de maçã placas de ágar, encher os pratos de Petri 35 x 10 mm ¾ cheio com 3% de ágar dissolvido em suco de maçã comprado. Armazene placas solidificadas em geladeira até o uso.
    2. Em um tubo de centrifuga conico de 50 mL, combine fermento seco ativo comprado com água destilada na proporção de 2 mL de água para cada grama de fermento. Mistura de fermento com água para criar uma pasta com a consistência de ketchup, usando um copo mexendo haste. Ajuste de proporções de levedura e água conforme necessário para atingir a consistência desejada.
    3. Loja fermento colar no frigorífico entre usos. Mantenha a tampa do tubo solto para permitir a eliminação de gás.
    4. Use uma agulha afiada ou faca de abrir pequenos buracos para os 6 oz quadrado-fundo garrafas (polipropileno) como furos de ventilação para as câmaras de postura.
    5. Aplique uma pequena mancha de massa de levedura (~ 3 mm de diâmetro) em cada placa de ágar de suco de maçã.
  2. Coloque adulta voa com o genótipo desejado para o 6 oz garrafa e a garrafa de tampa com a placa de ágar de suco de maçã. Segure o prato a garrafa com um elástico. Inverter e coloque em uma incubadora para permitir que os adultos para pôr ovos.
  3. Mudar placas de ágar suco de maçã em uma câmara de postura duas vezes por dia (manhã e noite). Placas de licença usada na incubadora para outro 12 – 24 h permitir que o primeiro ínstar as larvas que eclodem.
  4. Recolher primeiro ínstar larvas utilizando um pincel ou coleção palito fino (agulha fina flexível unida a um punho). Colocar 50 primeiro ínstar larvas de um genótipo específico em um frasco de alimentação do tipo de alimento desejado experimental para desenvolver e metamorfose completa enquanto alojados na incubadora (Figura 2).
  5. Colete os adultos para o tratamento de exercício (Figura 2).
    1. A pupa, coletar as pupas com um pincel pequeno, úmido e coloque em frascos vazios antes da eclosão para evitar moscas adultas de ser exposto à dieta larval.
    2. Transferência de moscas adultas para frascos de comida de dieta padrão de laboratório como eles eclose. Um a cinco dias após a eclosão, separe moscas baseadas no sexo.
  6. Metade designar os adultos recolhidos cada para o experimental e grupos de controle. Manter os frascos de dieta padrão de laboratório em uma concentração de 50 moscas por frasco de moscas.
  7. Transferência de adultos para os frascos de alimentos frescos em dois dias para impedi-los de ficar preso durante o exercício. Adicione vários grãos de leveduras vivas suplementar ao novo alimento, imediatamente antes de introduzir as moscas.
    Nota: Embora seja possível manter moscas sem um suplemento de leveduras vivas, encontramos que as moscas adultas executam melhor com a suplementação. Suplementação de leveduras vivas é uma variável que poderia ser modificada para atender objetivos experimentais do pesquisador.

3. protocolo de exercício

  1. No primeiro dia do exercício (dia 1), frasco de empurrar plugues para deixar 1cm de espaço em frascos de controle e 6 cm de espaço entre o alimento e o plugue em frascos de exercício (Figura 1).
    Nota: Os frascos de controle serão limitado espaço para moscas de continuar enquanto a máquina de exercício e assim moscas acoplará em muito menos movimento do que em frascos de exercício.
  2. Coloque os frascos nas mordaças e depois dar as moscas 10 minutos para se aclimatar na máquina (Figura 1B).
    Nota: Um controle alternativo é manter as moscas unexercised sobre a bancada ao lado da máquina de exercício com 6 cm de espaço (no frasco) para mover-se normalmente. Foram encontrados resultados semelhantes de exercício em relação tanto o "1cm na TreadWheel" e os controles de "6 cm na bancada"11.
  3. Tratar os dois controle e exercício voa a rotação da máquina em temperatura constante durante 5 dias consecutivos por semana, com a alternância de episódios de rotação e de repouso (Figura 1D).
    Nota: Uma temperatura constante é necessária para evitar os confusão efeitos da temperatura sobre os níveis de atividade. Para estudos de manipulação da temperatura, coloque o TW dentro de uma incubadora para modificar os tratamentos de temperatura durante o exercício de treinamento.
    1. Acione a máquina para quatro episódios de 15 min de exercício no dia 1. Alternam esses acessos com períodos de descanso de 5min.
    2. Cada um dos dias seguintes, adicionar 5 min de exercício para um dos combates exercício preexistente. Por exemplo, no dia 2, faz o primeiro exercício bout longo 20 min, mas manter o resto dos combates no tempo de 15 min.
    3. No dia 3, exercício voa para 20 min durante os dois primeiros episódios e 15 min para os seguintes dois ataques.
    4. No dia 4, use ataques de exercício 20 min para todos, exceto o combate final, que deve ser apenas 15 min de tempo.
    5. No dia 5, mantenha todos os surtos de exercício longo 20 min.
      Nota: Durante os períodos de descanso, os frascos contendo as moscas devem permanecer firmemente preso ao TW. A orientação dos frascos durante estes períodos não é relevante, porque a força gravitacional experimentada por todas as moscas será proveniente de mesma direção.
  4. Depois de completar o tratamento de exercício para um determinado dia, retornar os tampões de frasco de comida para a sua posição normal e retornar moscas para suas incubadoras até o dia seguinte.
  5. Após a conclusão do regime de pleno exercício, anestesia moscas usando métodos de anestesia padrão mosca CO2 . Então transfira moscas para novos frascos de comida ou microcentrifuge tubos para avaliação de características fenotípicas de interesse.
    Nota: Fenótipos de exemplo incluem escalada de capacidade (frasco de comida), armazenamento de triglicérides (microcentrifuga tubo) ou expressão gênica (tubo de microcentrifugadora). O protocolo pode ser pausado aqui com amostras armazenadas adequadamente dependendo das avaliações a serem executadas. Ensaios envolvendo vida moscas precisará ser realizados prontamente em conformidade com os objetivos específicos do ensaio fenotípico.

4. avaliação de escalada

  1. Após um dia de descanso após a conclusão do protocolo de exercício, teste geral mosca escalada desempenho usando uma rápida geotaxis negativo iterativo (anel)-como negativo geotaxis escalada do ensaio22.
    1. Coloque grupos de 10 moscas em frascos vazios usando CO2 anestesia (ou tocando diretamente a partir de frascos de comida se já classificados) e selar com película de parafina para evitar as moscas escapem. Dar a moscas pelo menos 10 min para se aclimatar ao novo frasco. Para evitar frascos tombe, fita um círculo de cardstock ~ 5 cm de diâmetro no fundo do frasco para fornecer superfície extra.
      Nota: Tampões de frasco não devem ser usados porque eles impedem que parte do frasco usado para determinar a altura subiu.
    2. Coloque frascos 20 cm em frente a uma grade de 1 x 1 cm à frente de uma câmera montada, estacionária com um temporizador interno (um telefone inteligente com um temporizador câmera aplicativo funciona bem).
    3. Brevemente os frascos delicadamente as contador três vezes para bater todas as moscas para baixo a parte inferior do frasco. Depois de bater o frasco para baixo pela terceira vez, iniciar imediatamente o temporizador de câmera 4 s para capturar uma imagem para determinar a altura subiu por cada mosca.
      Nota: Batida deve ser feita em uma intensidade consistente e pelo mesmo pesquisador em contraste cada exercício-controle para minimizar a variação nas respostas dos moscas devido à batida.
    4. Repita a etapa 4.1.3 duas vezes, pelo menos 1 min descanso entre ensaios, para produzir um total de três ensaios por frasco.
  2. Para preservar as moscas para outras análises, imediatamente após a conclusão do ensaio de escalada, flash congelar as moscas por imersão em nitrogênio líquido.
    1. Use um frasco de dewar raso, abrir-coberto cheio até uma profundidade de cerca de 5 cm com nitrogênio líquido.
    2. Moscas de transferência para tubos de pequeno microcentrifuga usando anestesia de CO2 e em seguida, coloque os tubos no frasco de dewar preenchido com nitrogênio líquido. Como alternativa, se análises futuras exigem evasão de CO2, snap congelar as moscas diretamente em seus frascos de escalada tocando suavemente moscas no fundo de seu frasco, enquanto o fundo está submersa em nitrogênio líquido e depois transferir as moscas congeladas para microcentrifuge tubos usando fórceps.
      Nota: Nitrogênio líquido é criogênico e só deve ser usado com ventilação apropriada de equipamentos e sala de proteção.
  3. Imagens de processo usando a ferramenta de seleção de pontos múltiplos de23 ImageJ.
    1. Abra uma imagem para processar dentro ImageJ.
    2. Defina uma escala de 1 cm baseada o papel de grade de fundo para calcular a distância escalada por cada mosca individual. Use a "ferramenta de linha" da barra de ferramenta ao lado de um quadrado de2 cm 1 traço do papel da grade do plano de fundo. Clique na aba "Analisar" e selecione "Definir escala". Definir a distância de"conhecido" como "Unidade de comprimento", como 'cm' e '1.00' Certifique-se de "Global" está desmarcada e clique em "Okey".
    3. Selecione o ícone de "Seleção multi-point" da barra de ferramenta e zoom na parte inferior do frasco na imagem. Defina o primeiro ponto como a parte inferior do frasco clicando na parte mais baixa do frasco.
    4. Clique no centro de cada mosca no frasco para marcá-lo como um ponto de dados. Tome nota que há um total de 11 pontos por frasco, uma marcação no fundo do frasco e outra para cada mosca.
    5. Clique na aba "Analisar" e selecione "Medida" para gerar uma tabela de valores medidos. Salve a tabela como um arquivo csv.
    6. Abra o arquivo csv em um programa de planilha e calcular a distância exata escalada por cada mosca subtraindo-se os valores de y dos pontos 2-11 do ponto 1 da tabela de valores medidos.
    7. Repita as etapas 4.3.1 através de 4.3.6 para cada imagem.

5. ensaio de armazenamento de triglicérides

Nota: As amostras, padrões, solução-padrão de glicerol e solução de trabalho de triglicerol usado durante todo o ensaio devem ser mantidos no gelo para a duração do protocolo e devem ser armazenados em geladeira quando não estiver em uso.

  1. Prepare padrões usando a solução-padrão de glicerol.
    1. Fazer o em branco (B) adicionando 1.000 µ l de tampão de homogeneização para um tubo de microcentrifugadora rotulado B.
    2. Fazer 1 padrão (S1), 2,5 mg/mL por alvéolo, adicionando 1.000 µ l da solução padrão de glicerol para um tubo de microcentrifugadora rotulado S1.
    3. Fazer 2 Standard (S2), 1,25 mg/mL por alvéolo, adicionando 500 µ l da solução padrão de glicerol a 500 µ l de diH2O em um tubo de microcentrifugadora rotulado S2.
    4. Fazer 3 padrão (S3), 0,625 mg/mL, por bem, adicionando 250 µ l da solução padrão de glicerol a 750 µ l de diH2O em um tubo de microcentrifugadora rotulado S3.
    5. Fazer 4 Standard (S4), 0,3125 mg/mL por alvéolo, adicionando 125 µ l da solução padrão de glicerol a 875 µ l de diH20 em um tubo de microcentrifugadora rotulado S4.
  2. Prepare solução de trabalho triglicerol do Kit de determinação de triglicérides de soro.
    1. Adicionar 40 mL de diH2O para o reagente de glicerol livre do kit e misture por inversão a garrafa.
    2. Adicionar 10 mL de diH2O para a solução de triglicéridos do kit e misture por inversão a garrafa.
    3. Combinam a solução reagente e triglicéridos de glicerol e misture por inversão para preparar a solução de trabalho de triglicerol.
      Nota: A solução de trabalho de triglicerol é bom para 60 dias e pode completar quatro ensaios de placa de 96 poços por conjunto usando o protocolo abaixo. Os volumes usados são reduzidos proporcionalmente do kit de determinação de triglicérides do soro oficial para uso no formato de placa de 96 poços.
  3. Verifique se o branco e padrões cuidadosamente pipetando 5 µ l de cada norma, para um apartamento de 96 poços, fundo, microplacas clara em triplicado (ou quatro exemplares no ensaio em branco).
    1. Adicione exatamente 125 µ l de solução de triglicerol trabalhando para cada bem que contém um padrão. Permita soluções reagir durante 30 min.
    2. Coloque uma placa de 96 poços em um espectrofotômetro e ler a absorbância a 540 nm. Use as medidas de absorvância para criar uma curva padrão e verificar a exactidão das normas pela avaliação do valor de2 R. Se o R2 para as normas é menor que 0,98, re-Prepare-se as normas mais cuidadosamente.
  4. Começar o dia 1 do ensaio para triglicérides armazenamento14 usando microcentrifuga tubos contendo 10 congelado voa cada um.
    Nota: Uma pipeta de repetição ou multi-canal nunca deve ser usada nesta etapa porque as quantidades de cada reagente utilizado no ensaio devem ser muito precisos e consistentes para obter resultados reprodutíveis. Em nossa experiência, pipetas de repetição e multi-canal não têm esse grau de precisão e consistência. Cada alíquota de uma pipeta de canal único pode ser confirmada visualmente pelo experimentador para controle de qualidade e preconceitos de pipeta específica qualquer canal único serão experimentados por todas as amostras no mesmo grau.
    1. Prepare um estoque de 200 mL de tampão de homogeneização combinando 0,272 g de KH2PO4, 400 µ l de EDTA 0,5 M e 199,6 mL de diH2O em uma garrafa de vidro.
    2. Adicione exatamente 100 µ l de tampão de homogeneização para cada um dos 40 tubos microcentrifuga contendo 10 adultos congelados após o ensaio de escalada. Em seguida, Centrifugar as amostras por 30 s a 18.000 g.
    3. Moagem voa usando um moedor motorizado e pilão (ou outra forma de homogeneização de tecido) para preparar uma solução leitosa. Certifique-se de que um pilão fresco é usado para cada amostra. Centrifugar as amostras por 2 min em 18.000 g.
    4. Pipete apenas o µ top 75 l do sobrenadante de cada tubo para novos tubos de microcentrifuga. Certifique-se de que não voar pedaços da pelota são transferidos. Coloque novos tubos no frigorífico durante a noite.
  5. Comece o dia 2 do protocolo de triglicéridos removendo amostras de 1 dia na geladeira.
    Nota: Passo 5.5 pode ser realizado no mesmo dia que 5.4, mas encontramos o sinal para a concentração de triglicérides ser mais robusto depois de uma noite na geladeira. No entanto, o tempo entre passos 5.4 e 5.5 não deve exceder 36 h.
    1. (Opcional) Vórtice o primeiro tubo com fluido sobrenadante de 10 s e pipeta 5 µ l em um tubo limpo microcentrifuga. Adicione 95 µ l de 0,15 M de NaCl no tubo de microcentrifuga de novo. Armazene esses subamostras no congelador-20 ° C para um posterior doseamento da proteína, se desejado.
      Nota: Estas amostras de sobrenadante com a solução de NaCl adicionada podem ser usadas para determinar o teor de proteínas usando ensaio preferencial do pesquisador. Nós usamos o método de Bradford24. O teor de proteínas é uma forma de padronizar a medida do conteúdo de triglicerídeos, mas o pesquisador também deve ser cauteloso em interpretar estas relações desde exercício e dieta também pode afetar o armazenamento de proteína.
    2. Para os frascos de sobrenadante originais, vórtice o primeiro tubo com fluido sobrenadante de 10 s, em seguida, pipeta 5 µ l em dois separados poços de uma microplaca de 96 poços para produzir técnica Replica. Certifique-se a nota que poços são usados para cada amostra. Repita esta etapa para os 39 outros tubos.
    3. Pipetar exatamente 5 µ l do branco quatro poços do microplate, e para os restantes poços, pipete exatamente 5 µ l de cada norma em triplicado.
    4. Adicionar a solução de trabalho de triglicerol exatamente 125 µ l de cada poço e permitir que a solução se reagir durante 30 min.
    5. Coloque a placa de 96 poços em um espectrofotômetro e ler a absorbância a 540 nm.
    6. Converta valores de absorvância em concentração (mg/mL) usando a curva padrão calculada a partir dos padrões.

Results

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Estamos especialmente interessados em identificar os fatores que contribuem para a saúde global metabólica de um indivíduo. Verificou-se anteriormente que interações genótipo-por-dieta contribuem substancialmente para variação de nível população em características metabólicas14. Isto significa que cada genótipo responde às diferenças ambientais de forma única e complexa. Para estender o nosso trabalho sobre os efeitos do genótipo-por-ambiente para incluir o exercício físico, desenvolvemos a TreadWheel, que é capaz de expor um grande número de genótipos de intervalo aeróbio, treinamento (AIT) de uma forma de alta produtividade.

Para estabelecer se o exercício sobre o TW influenciado características metabólicas, medimos o armazenamento de triglicérides no Oregon-R (OreR) e y1w1 moscas, moscas de sua comum (B-C(Figura 2) e normalizado esses valores contra as moscas concentração de proteína, como originalmente relatada em Mendez et al . 11. foram analisados os dados por análise multivariada de variância (MANOVA) contabilidade para exercer o genótipo, sexo, tratamento (e suas interações), e efeitos de bloco experimental como tempo repetições e alimentos frasco e constatou que houve uma significativa interação genótipo-por-exercício (p = 0,0017) que afetam o armazenamento de triglicérides. Houve um efeito significativo de dimorfismo sexual entre machos e fêmeas, com os machos armazenar os triglicerídeos mais do que as fêmeas (p < 0,0001). Vimos que, nas fêmeas, moscas exercidas tinham níveis de triglicérides significativamente menores do que suas contrapartes unexercised (Figura 2B, p < 0,0001). Nos machos, enquanto a diminuição no armazenamento de triglicérides, observada em Oregon-R exercido moscas (em comparação com controles) não foi estatisticamente significativa, foi observada uma diferença significativa no armazenamento de triglicérides entre as duas linhas separadas (Figura 2C, p < 0,0001). Observe que, enquanto a padronização de concentração de triglicérides, contra a concentração de proteína fornece a introspecção no corpo em geral voar rácios de composição, comparação de concentração de triglicérides ou proteína direta entre grupos diferentes de moscas também pode fornecer informações específicas sobre o efeito do exercício nestes fenótipos individualmente.

Desde que as variáveis como exercício adulto, sexo, e genótipo são mostrados para afetar o armazenamento de triglicérides, esperava-se que estes fatores também afetar outros fenótipos e interagirem com a dieta. Levantamos as larvas de um representante de sua Drosophila genética painel de referência linha (153 DGRP)25 em um alto teor de gordura ou normal dieta e exercício induzido em moscas adultas durante uma semana(Figura 2). Posteriormente, foi realizado um ensaio de anel geotaxis negativo para medir a capacidade de escalada. O ensaio de escalada usado diferia de um ensaio de anel padrão; em vez de um aparato de anel, frascos com película de parafina, cobrindo as aberturas foram usados para moscas domésticas durante o ensaio. Outros aspectos do ensaio do anel original, tais como o tempo entre bater as moscas no fundo do frasco e tirar a foto, foram retidos22.

Todos os tratamentos foram repetidos três vezes com um mínimo de 59 moscas individuais por tempo replicar e tratamento. Dados foram analisados pela contabilidade MANOVA para dieta, genótipo, sexo, exercício de tratamento (e suas interações), bem como efeitos de bloco experimental de tempo replicar, frasco de ensaio e tubo de ensaio ensaio de replicar. Nós achamos que as fêmeas exercitadas subiram significativamente maior (p < 0.005) quando criados na dieta de alta gordura do que qualquer um dos outros tratamentos femininos (Figura 2D). Para os machos, verificou-se que exercício só melhorou a subir quando os machos foram levantados sobre a dieta normal, e aqueles levantou na dieta de alta gordura, não mostrou nenhuma mudança significativa(Figura 2). Também encontramos importantes efeitos sexualmente dimórficos (p < 0,0001) na escalada com machos subir mais alto do que as fêmeas. O resultado surpreendente de uma diminuição no desempenho após o exercício para as fêmeas da linha DGRP 153 (Figura 2D) para as mulheres que consomem uma dieta normal de escalada (p < 0,0001) é um exemplo de como este tipo de exercício pode não ser um intervenção uniformemente positiva para todos os genótipos e poderia ser dependente de outros fatores ambientais. Em Mendez et al . 11, as fêmeas de quatro outras linhagens genéticas testadas para seu desempenho escalado após ter sido criado com um normal dieta todos mostrou maior capacidade de escalada com exercício. Isso sugere que a resposta observada em DGRP 153 é genótipo específico e não uma propriedade geral do tratamento exercício TW. A variabilidade da resposta através de grupos de tratamento do exercício, dieta e sexo indica que existem interações significativas do sexo-por-dieta-por-exercício que afeta a capacidade de escalar da linha (p < 0,0001).

Tomados em conjunto, os resultados indicam que o impacto do exercício na saúde metabólica de uma mosca adulta pode ser uma função de seu sexo, genótipo e dieta larval. A variação fenotípica observada em resposta ao genótipo, variáveis de ambiente (por exemplo, dieta e exercício) e o sexo também tem sido observado em outros estudos11,12,14,15. Assim, a TW e Drosophila podem ser uma poderosa estratégia para elucidar os fatores genéticos e ambientais, moldar a saúde metabólica.

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Figura 1 : Máquina de exercício a TreadWheel. (A), a máquina possui 48 frascos e tem uma característica de velocidade ajustável. Aqui foram realizados experimentos a 4 rpm. (B) alimentares individuais frascos contendo as moscas experimentais foram agarrados nos suportes anexados a um eixo de rotação. Comida e (C) a distância entre o frasco plug foi 6 cm para frascos de exercício e 1 cm para frascos de controle. Os frascos foram então colocados na máquina para exercício. Regime de (D) o exercício de pirâmide inversa do dia 5 foi usado para exercer moscas adultas. Cada dia, um adicional cinco minutos foi adicionado para um dos combates exercício para aumentar a intensidade do exercício incrementalmente, que modela a resistência, o treinamento do intervalo. Esta figura foi modificada de Mendez et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2 : Métodos visuais e resultados representativos. (A) métodos para testar a dieta larval e adulto exercício efeitos de interação. As larvas foram levantadas na dieta de alta gordura ou normal laboratório e mudou para comida normal após a eclosão. Moscas adultas foram separadas por sexo, colocadas em grupos experimentais e exercidas durante cinco dias consecutivos. Depois, um geotaxis negativo anel escalar o ensaio foi realizado, e moscas foram congeladas para medições de triglicéridos. Dados representativos dos triglicéridos são mostrados para duas linhagens genéticas, Oregon R e y1w1 para (B) as fêmeas e os machos (C). Todas as moscas foram criadas em uma dieta normal e exercidas na idade adulta. Níveis com letras diferentes são significativamente diferentes (p < 0,05) usando um post hoc Student t-teste. Esta figura contém um subconjunto dos dados relatados em Mendez et al . 11. dados representativos de escalada são mostrados para linha DGRP 153 para (D) as fêmeas e os machos (E). Cada ponto representa o desempenho de escalada em média de 232 ou mais indivíduos em três pontos de tempo independentes. Barras de erro indicam um erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Suplementar Figura 1: um esquema detalhado da TreadWheel. (A) diagrama da estrutura de grampo duplo frasco usado para anexar os frascos para a máquina. (B) Vista Interior do sistema de movimentação rotacional da máquina. (C) projeção paralela da face frontal da máquina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de código complementar: TreadWheel.skp Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

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O protocolo de exercício detalhado aqui foi mostrado para estimular com sucesso exercícios suaves em Drosophila e pode ser usado para simular exercícios de resistência em um laboratório controlado configuração11. Deve-se notar que, quando inicialmente desenvolvendo o conceito de TreadWheel, consideramos produtos comerciais que podem ser modificados para executar da mesma forma (por exemplo, um espeto de laboratório). No entanto, em última análise, rejeitamos esta abordagem, escolher um projeto sob medido, porque o equipamento comercial não teve suficientemente baixa velocidade rotacional (rpm 4) e carecia de suficiente capacidade de frasco para geração de amostra do elevado-throughput.

O protocolo TW em si pode ser ajustado para abranger uma vasta gama de tópicos de pesquisa. Por exemplo, ajustando a frequência e duração dos regimes de exercício dos moscas pode alterar as intensidades das trabalho-outs que recebem. Estendendo o protocolo mais do que uma semana ou para outros grupos de idade, seria possível estudar os efeitos do exercício sobre o envelhecimento e várias doenças relacionadas com a idade. Recomendamos que se for implementada uma abordagem de exercício prolongado, então dia de descanso de pelo menos um por semana deve ser adicionado para permitir a recuperação. Desempenho e melhoria foi mostrado para ser maior em regimes que incluía um dia de recuperação do que os regimes que usado consecutivos de exercício diário12. Além disso, nós advertiria contra estendendo comprimentos de tal exercício passado 30 min desde habituação ao movimento rotacional pode ocorrer depois de longos períodos de contínuo exercem11. Também observamos variações genéticas na motivação dos moscas para manter seus níveis de atividade no TW11. Assim, se mais lutas são desejadas, considere monitorando os níveis de atividade das moscas, tal como apresentado por Watanabe e enigma15,21 descrevendo sua modificação do conceito TW. Outros fatores que poderiam ser variados incluem temperatura e padrões, que são mostrados para afetar também voar movimentos26,27de vigília-sono.

Há uma infinidade de análises disponíveis durante e após a conclusão do protocolo de abordar os efeitos do exercício no nível molecular, fisiológico e comportamental, bem como o potencial para desvendar efeitos epigenéticos do exercício. Ensaios metabólicos adicionais (por exemplo, glicose, glicogênio e proteína), desempenho cardíaco e resposta inflamatória medidas podem ser usadas para explorar o exercício efeito tem na mosca fisiologia e corpo composição12,14 ,24,28. Várias alterações comportamentais associadas com exercício de indução, tais como mudanças no comportamento alimentar, atividade locomotora e sono, também podem ser medidas usando ferramentas como o CAFE ensaio29 ou a atividade de monitoramento de dispositivos12,15 ,30. Alterações na expressão gênica e atribuído para o exercício de respiração celular também podem ser quantificadas usando métodos como qRT-PCR11 e respirometria31. Finalmente, a drosófila tem valiosos recursos genéticos disponíveis, como o painel de referência de genética de drosófila 2 e o recurso de população sintética drosófila que fornecem os pesquisadores a plataforma para realizar estudos de genética quantitativa de25,32. Essas ferramentas permitem experimentos de mapeamento, como mapeamento de estudos de associação de genoma-largo e quantitativos Loci de traço, para identificar o locus candidato associados com dieta e exercício.

Estudos concluídos usando o TreadWheel demonstraram que, em média, exercício diminui o peso do corpo, armazenamento de triglicérides total e glicogênio, enquanto aumenta o conteúdo de proteína e desempenho11de escalada. Além disso, houve respostas variáveis exercer entre os sexos e genótipos para o peso corporal, bem como triglicerídeos, proteína, glicogênio, glicose e níveis de atividade11,15. Enquanto a variabilidade da resposta ao exercício e dieta entre genótipos e sexo pode ser difíceis de interpretar e, às vezes, sem explicação, ela reflete as fontes de variação biológica real observada em populações naturais. Como nós nos esforçamos para entender a diversidade de factores subjacentes que contribuem para as altas taxas de MetS, ferramentas que facilitam a destrinçar o papel relativo dos vários fatores que contribuem testando esses fatores em organismos-modelo será fundamentais para nossa capacidade desenvolver intervenções de prevenção e tratamento personalizadas. Para avaliar plenamente a eficácia do exercício, cada um desses fatores e como eles interagem deve ser considerado quando a realização de experiências e formulação de conclusões.

O TW, como mais outras máquinas de voar do exercício, é limitado em sua capacidade de quantificar o movimento de voar. Recentemente, Watanabe e enigma desenvolveram o giro exercício quantificação sistema (REQS), um backbone TW modificado com uma atividade de monitoramento unidade (LAM25H), o sistema de monitoramento de Drosophila série15,21. Como o TW, este sistema utiliza o movimento rotativo para induzir suavemente exercício enquanto estiver usando o braço de LAM25H para controlar e quantificar a atividade de voar, mas ele mantém um número menor de frascos (32 frascos) que a TW15. Para estudos de exercício de alta produtividade, se a quantificação da atividade não é necessário ou desejado, o TW permite um maior número de amostra. O projeto da TW também poderia ser modificado da sua atual forma para acomodar um maior número de frascos. Este sistema, juntamente com outros métodos existentes de exercício, ajudado a estabelecer que o exercício não só é realizável em Drosophila mas também pode ser estudado para determinar o efeito da atividade física em uma variedade de respostas fisiológicas e moleculares 11,12,15. Assim, o TW, como um método comprovado de induzir exercícios suaves em moscas, pode ser usado para sondar uma grande variedade de questões biológicas.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer a Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish e o resto do laboratório de Reed por sua ajuda com mosca criação e processamento de imagem. Sean Mendez construído a TreadWheel original com assistência da loja de máquina da UAB. Financiamento para este estudo foi fornecido pela NIH-R01 GM 098856 para LKR graduação criatividade e a Academia de investigação na Universidade do Alabama, KEL e BJW.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiais para Construção de Roda de Rodagem:
Montagem de nivelamento de Amortecimento de Vibração de Serviço PesadoMcMaster-Carr60855K71Quantidade: 4
Rolamento de Esferas de Aço InoxidávelMcMaster-Carr57155K306Quantidade: 8
Transformador de Tensão Plug-in (500MA, entrada 120VAC, saída 24 VAC)McMaster-Carr70235K16Quantidade: 1
Motor de engrenagem DC de face quadrada compactaMcMaster-Carr6409K23Quantidade: 1
Suporte de ferramenta (grampos)McMaster-Carr1723A22Quantidade: 5 (10x)
12L14 Haste de tolerância apertada de aço carbonoMcMaster-Carr5227T24Quantidade: 1
Colar de eixo de parafuso de fixaçãoMcMaster-Carr6432K13Quantidade: 8
Poliade correia redondaMcMaster-Carr6284K51Quantidade: 5
Controles de Dardo - 25 RPM Máx., Motor Elétrico AC DCMcMaster-Carr13DV 1AQuantidade: 1
Materiais para Manutenção de Moscas e Criação
6 oz Garrafas de Fundo Quadrado (polipropileno)Genesee Scientific32-130Quantidade: 1
Placas de Petri 35x10mmVWR82050-536Quantidade: 1
Frascos estreitos de DrosophilaGenesee Scientific32-116Quantidade: 1
FlypadFlypad Genesee Scientific59-114Quantidade: 1
Zarabatana, MiniGenesee Scientific54-104Quantidade: 1
Materiais para ensaio em forma de anel:
ImageJ softwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/Quantidade: 1
1 cM papel milimetrado ou grade desenhada (pelo menos 20 cM por 30 cM)váriosQuantidade: 1
câmera digital com temporizador ou smartphone com câmera temporizador aplicativováriosQuantidade: 1
Materiais para Triglicerídeos Ensaio:
Dewar FlaskVWR14200-960Quantidade: 1
Kit de determinação de triglicéridos séricosSigma AldrichTRO100Quantidade: 1
Motor de pilão sem fioVWR47747-370Quantidade: 1
pilãoVWR47747-358Quantidade: 1

References

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