É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

7.5K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

16 de agosto de 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Resumo

Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.

Introdução

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca2 + suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio 2. Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células 3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca2 + de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência 7a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.

A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher 8,9,10 e melhorada pelo Hamill 11e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos 11; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total 12. No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução 13 (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez 14 desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina 15 e anfotericina B 16, ou surfactantes como o beta-escina de saponina 17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca2 + 15, 16.

O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (Rs) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o Rs será em paralelo com a resistência da membrana (Rm). Rm e Rs em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta Rs, a tensão vai cair o Rs dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at+ (para leituras detalhadas consulte referência 19). Além disso, Rs pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde Rs muda durante a aplicação da droga.

A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro 20Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al 21. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos 22. Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos 1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária 24,25,26,,27,28,29,30 .

No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação 22, que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.

Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, 31, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos 32. Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca2 + .

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.

1. preparação de soluções e instrumentos

Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamento aparelhos respectivamente.

  1. Fazer 500 mL de solução extracelular sem Ca2 + (Ca2 + livre CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, a resistividade de 18,2 MOhm) H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  2. Fazer 500 mL de solução extracelular (CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  3. Fazer 500 mL de solução extracelular com 0,1% albumina de soro bovino (CE com BSA): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
    1. Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.
    3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm. Adicione 50 mg de BSA.
  4. Fazer 250 mL de solução intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarose 20 mM.
    1. Dissolva 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES e 1,712 g de sacarose em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
    2. Ajuste o pH para 7.2 com (N-Morpholinos) etano (MES) sulfônico.
    3. Transferi a solução para um balão aferido de 250 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 250 mL.
    4. Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste a 280 – 290 mOsm (10 mOsm inferior CE) com sacarose. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.
  5. Fazer 100 mL de solução de agarose derretimento baixo de 2% de Ca2 + e BSA CE livre (livre de 2 g de agarose derretimento baixo em 100 mL de Ca2 + CE). Dissolver usando um microondas e coloque o agarose derretido em um banho de água a 40 ° C. Deixe arrefecer até atingir 40 ° C antes de usar sobre os tecidos.
    Nota: CE, Ca2 + CE livre pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas se estéril e soluções de IC a-20 ° C, durante vários meses. Agarose pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e pode ser reutilizado em 3 a 5 vezes por microondas brevemente. Reutilização excessiva conduzirá a evaporação e alteração de agarose e concentração de sal e de qualidade.
  6. Fazer a ponte de ágar:
    1. Capilares de vidro de borosilicato longa 7,5 mm com diâmetro externo (OD) 2mm de calor e dentro diâmetro (identificação) 1,16 mm, utilizando um bico de Bunsen em um focal ponto cerca de 1/3 de uma ponta até o vidro começa a dobrar. Retirar o vidro da chama e deixar o vidro dobrar com um ângulo de cerca de 120 graus(Figura 2).
    2. Derreta 2% de ágar na CE normal sem glicose usando um microondas, e enquanto a agarose é líquido preencher o capilar usando a capilaridade de vidro pré-fabricados forças, colocando uma das extremidades do vidro no líquido e, esperando por alguns minutos. Loja pontes até o uso em 4 ° C na CE sem glicose.
  7. Prepare-se vidro de borosilicato com pipetas de remendo de filamento usando um extrator de pipeta apropriada. Consulte o manual do extrator de pipeta para obter a resistência desejada do eletrodo.
    Nota: O cone da pipeta deve ser tão curto quanto possível. Atarraxamento curta pipeta é conseguida usando-se puxando passos 4-6. A resistência do eletrodo deve ser entre 2 e 6 MΩ dependendo do tamanho da célula.
  8. Para evitar o movimento do tecido durante os experimentos de remendo-braçadeira revestir a superfície da câmara de gravação com 0,1% do polyethylenimine (PEI) em tampão de borato.
    1. Prepare 500 mL de tampão de borato (25 mM):
      1. Dissolva 4,768 g de Na2B4O710 H2O em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.
      2. Ajuste o pH para 8,4 com HCl.
      3. Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL e 0,2 µm filtro esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água.
    2. Prepare uma solução de 1% das ações de PEI (1 mL 50% PEI para 49 mL de tampão de borato 25 mM) e uma diluição de PEI 0,1% diluição 10 µ l de solução 1% em 100 µ l de tampão de borato para utilização final.
    3. Adicione 2 mL de 0.1% PEI no vidro do titular da fatia e deixe o revestimento incubar durante 1 minuto. Então brevemente lavar o copo duas vezes com 5 mL de ultrapura H2O... e deixe o ar seco até o uso.
  9. Prepare soluções de anfotericina B.
    1. Faça 60 mg/mL de solução dissolvendo-se 3 mg de anfotericina B em pó em 50 µ l dimetil sulfóxido (DMSO), em um tubo de 1 mL, protegido da luz. Vórtice na velocidade máxima por 30 s e proceda à sonicação durante 15 min homogeneizar. Armazenar as alíquotas para tubos de 3 – 5 a-20 ° C e usar a alíquota de um por dia.
      Nota: Se a solução estoque de anfotericina B não é clara e amarela cor mas leitoso (amarelo ainda), depois de 15 – 20 min sonication tornar-se uma nova solução.
    2. Fazer solução de IC com anfotericina B por pipetagem 2ml do IC para um copo de vidro limpo com mais de 10 mL de capacidade. Adicionar 8 µ l de solução-mãe de anfotericina B para a solução da pipeta e misture por pipetagem. Envolva o copo com folha de alumínio e coloque no gelo até o uso e renová-lo a cada 3h.

2. dissecção e cortar com Vibratome

  1. Prepare as ferramentas de dissecação antes de dissecar, incluindo uma afiada e uma pinça forte com uma tesoura. Limpar as ferramentas (suporte do tecido, pincel, pinça) com etanol e certifique-se de que eles são usados apenas para fins de dissecação e nunca em contacto com tecidos fixos. Mantê-los em uma caixa separada para evitar contaminação.
  2. Eutanásia o peixe em água fria de gelo por 1 min.
  3. Siga as etapas subsequentes para dissecar rapidamente o medaka cérebro e hipófise com Pinças afiadas (usar não mais que 3 min).
    1. Enquanto segurando o peixe com a pinça forte grave os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma tesoura ou pinça em ponto.
    2. Abra a parte dorsal do crânio do posterior para o lado anterior por quebrar os ossos do crânio passo a passo com pinça forte.
    3. Retire o crânio de um lado com pinça forte.
    4. Grave da medula espinhal com tesoura ou pinça afiada.
    5. Suavemente, pegar a medula espinhal com a pinça, virar o cérebro de posterior para anterior e coloque-o em um prato com o gelado Ca2 + grátis CE.
  4. Encher um molde de metal3 1,5 a 2 cm com agarose líquido e coloque-o no gelo.
  5. Antes da agarose solidifica (em torno de 25 – 30 ° C), gentilmente agarrar o cérebro pela medula espinhal com o fórceps, secar a pinça com um pedaço de papel fino e coloque o tecido no agarose. Misture rapidamente o agarose para diluir os vestígios da CE o tecido parietal esquerdo e orientar o tecido e deixar o molde em gelo por alguns segundos até que a agarose endurece.
    Nota: É essencial para esta etapa ser rápido. A agarose solidifica rapidamente como o molde metálico é arrefecido pelo gelo.
  6. Corte um bloco quadrado de agarose contendo o tecido com uma lâmina de bisturi e cola-lo no porta-amostra vibratome usando cola de cirurgia (tóxicos).
  7. Encher a cubeta do vibratome receber o suporte de amostra (cérebro-pituitária) com gelado Ca2 + grátis CE.
  8. Introduza o suporte do espécime a vibratome e cortar o bloco de agarose para tornar parasagital seções de 150 µm, usando a alta frequência e a baixa velocidade para o corte. Recolher as seções selecionadas e colocá-los na câmara de gravação de remendo-braçadeira com 3ml da gelada Ca2 + grátis CE.
  9. Coloque a harpa de grade (Figura 2B) na seção de tecido.
    Nota: A harpa será junto com o revestimento estabilizar o tecido e impedir a movimentação durante as gravações de remendo-braçadeira.
  10. Depois a harpa está no lugar, mude o Ca2 + grátis CE médio para o CE normal com Ca2 + e BSA. Deixe o resto de tecido por 10 min.

3. perfurado Patch-clamp e eletrofisiológicas gravações

  1. Antes de iniciar o experimento, o cloreto de prata fio eletrodos pelas seguintes etapas: primeiro, use uma lixa fina (p180) para limpar os eletrodos de fio de prata. Em segundo lugar, enxague com 2 mL, de etanol a 70%. Em terceiro lugar, mergulhe os fios em 2 mL, 2 – 5% de cloro por 10 min. Finalmente, enxaguar com 2 mL, ultrapura H2O.
  2. Coloque a câmara de gravação com a fatia de cérebro-hipófise na fase de microscópio e localizar a área de alvo (hipófise) com objetivo de X 10 e inspecionar as células com o objectivo de X 40.
    Nota: Se a preparação for bem sucedida, muito poucas células redondas devem ser visíveis. Esses redondos são células geralmente danificadas que são desanexação do tecido.
  3. Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar de 2% para o banho do CE.
  4. Localize uma célula saudável usando o objectivo X 40.
    Nota: Uma célula saudável deve ser firmemente anexada para o pedaço de tecido e não arredondada e desanexada da fatia.
  5. Definir o amplificador em tensão-braçadeira (VC; Modo de Figura 4A ponto 1). Abrir o selo teste janela e pressione o banho configuração (Figura 4B os pontos 1 e 2. Use um pulso de 5-mV para monitorar a resistência de pipeta (Figura 4B ponto 3).
  6. A ponta da pipeta com a solução de IC antifúngica gratuita antes de adicionar a solução de IC com anfotericina B, utilizando uma seringa de enchimento microremendo de aterramento (ver Figura 3).
  7. Adicione uma pressão ligeiramente positiva de ar dentro da pipeta de remendo usando a seringa de 1 mL.
    Nota: Isto faz um pequeno fluxo líquido da pipeta remendo que evite a contaminação da ponta.
  8. Uma vez no banho, avaliar a resistência de uma pipeta de remendo e certifique-se de que nenhuma partícula é anexada a ponta da pipeta (Figura 4).
    Nota: Um pequeno pedaço de fita é anexado para o monitor exibindo a forma de gravação de vídeo, o campo de visão. Isso faz com que o posicionamento da pipeta remendo em relação à célula mais fácil quando o objetivo é não focando a célula.
  9. Guia da pipeta de remendo para baixo a célula usando Micromanipuladores.
    Nota: Certifique-se que a pipeta é limpa, procurando por pequenas partículas que podem ter ligado para a ponta da pipeta. Mudanças súbitas na resistência também podem ser um resultado de partículas preso na ponta da pipeta.
  10. Reajustar a pipeta quando alguns mícrons acima a célula para que a ponta da pipeta tocará a célula 1/3 do meio da célula, como mostrado na Figura 5. Quando tocar o celular, liberar a pressão e aplicar a sucção suave para fazer uma vedação.
    Nota: O tempo da pipeta remendo entra o banho para uma bem sucedida selo deve ser mantido tão curtos quanto possível. Não mais do que 1 – 1,5 min para evitar a anfotericina B, atingindo a ponta da pipeta e fuga para o banho.
  11. Imediatamente, alterne para a janela de remendo no software remendo-braçadeira (Figura 4 D ponto 1) e têm um potencial de exploração entre-50 e a-60 mV (ponto4 da figura 2). Zero fora a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro (ponto4 da figura 3).
  12. Alterne para a janela da cela no software remendo-braçadeira (Figura 4E os pontos 1 e 2) e iniciar o monitoramento de resistência de acesso, Ra, exibida na janela. Zerar a capacitância de membrana no software do amplificador (Figura 4E ponto 3) após acesso suficiente.
    Nota: Acesso suficiente pode demorar de 10 a 30 min (Figura 4E ponto 2). Um bom acesso para gravações de braçadeira atual deve estar abaixo de 20 M.
  13. Alternar para braçadeira atual, IC, na janela de software do amplificador (Figura 4F ponto 1). Ajuste as correntes rápido-capacitivo na janela - braçadeira do software para o mesmo valor 3.12 amplificador (Figura 4F ponto 2 e 3). Verifica o potencial de membrana (Figura 4F ponto 1).
    Nota: Importante, se o potencial de membrana é superficial (típico acima -35 mV) a célula pode estar danificada. Cancelar a gravação e encontrar uma nova célula.
  14. Depois de encontrar uma célula saudável (firmemente ligado ao tecido com membrana potencial abaixo de -40 mV), começam as gravações experimentais como detalhadas do fabricante protocolo 33,34.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).

Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de células inteiras....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente se o organismo em questão vi...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
VibratomeLeicaVT1000 S
Cola cirúrgicaWPIVETBOND3M Vetbond Adesivo de tecido
Lâminas de aço inoxidávelCampden Instruments752-1-SS
moldes de metalSAKURA4122
harpa de açoWarner instruments64-1417
PBSSIGMAD8537
Ultrapure LMP agaroseinvitrogen166520-100
patch pipetasSutter InstrumentBF150-110-10HPBorosilicato com filamento O.D.:1,5 mm, I.D.:1,10 mm
Microscópio SlicescopeScientificapro6000
P-Clamp10Molecular Devices#1-2500-0180software digitalizador
Digidata 1550A1Amplificador Molecular DevicesDD1550
Multiclap 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sal de trifluoroacetato 
extrator de pipetasSutter InstrumentP-1000
anfotericina BSIGMAA9528antibiótico formador de poros
polietilenomina SIGMAP314350% PEI solução
microfiler seringaWPIMF28/g67-5
vidro para a ponte de ágarSutter InstrumentBF200-116-15Borosilicato com filamento O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm
Micro-ManagerSoftware de Microscopia de Código Aberto
optiMOS sCMOS câmeraQimaging  01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicatorElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2SiGMAM8266
D-GlicoseSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2SiGMAC8106
SacaroseSiGMA84097
D-manitolSiGMA63565
MES-ácidoSIGMAM0895
BSASIGMAA2153
Software Polido a fogo

Referências

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Registros Eletrofisiol gicosPatch clamp PerfuradoPerfura o com Anfotericina BPituit ria de Peixes Tele steosMedaka Oryzias latipesSecionamento por Vibr tomoPatch clamp de C lula InteiraRegistro de Potencial de A oSolu o Livre de C lcio
Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.