O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.
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Artigo de método
Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.
Introdução
A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de ....
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Protocolo
Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.
1. preparação de soluções e instrumentos
Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamen....
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Resultados
Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de células inteiras........
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Discussão
Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente se o organismo em questão vi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Cola cirúrgica | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Adesivo de tecido |
| Lâminas de aço inoxidável | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| moldes de metal | SAKURA | 4122 | |
| harpa de aço | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipetas | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicato com filamento O.D.:1,5 mm, I.D.:1,10 mm |
| Microscópio Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | software digitalizador |
| Digidata 1550A1 | Amplificador Molecular Devices | DD1550 | |
| Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sal de trifluoroacetato |
| extrator de pipetas | Sutter Instrument | P-1000 | |
| anfotericina B | SIGMA | A9528 | antibiótico formador de poros |
| polietilenomina | SIGMA | P3143 | 50% PEI solução |
| microfiler seringa | WPI | MF28/g67-5 | |
| vidro para a ponte de ágar | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicato com filamento O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm |
| Micro-Manager | Software de Microscopia de Código Aberto | ||
| optiMOS sCMOS câmera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glicose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl< sub>2 | SiGMA | C8106 | |
| Sacarose | SiGMA | 84097 | |
| D-manitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-ácido | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
Referências
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trend....
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Reimpressões e permissões
