Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Resumo

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Resumo

As fêmeas de mamíferos ovulam periodicamente um número quase constante de oócitos durante cada ciclo de cio. Para sustentar tal regularidade e periodicidade, regulamento ocorre no nível do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e no desenvolvimento de folículos nos ovários. Apesar dos estudos ativos, mecanismos de desenvolvimento do folículo não são claros, devido as diversas etapas envolvidas desde a ativação do folículo primordial dormente a ovulação e devido a complexidade de regulamento que difere em cada fase folicular. Para investigar os mecanismos do desenvolvimento folicular e a dinâmica dos folículos durante todo o ciclo do estro, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido ovariano de mouse que pode ser usado para observar o desenvolvimento folicular usando um microscópio. Desenvolvimento sistemático folicular, ovulação periódica e atresia do folículo podem ser reproduzidos no modelo do culto do ovário, e as condições de cultura podem ser moduladas experimentalmente. Aqui, vamos demonstrar a utilidade desse método no estudo dos mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular e outros fenômenos no ovário.

Introdução

Ovários de rato fêmea contenham vários milhares de folículos¹e ovulação periódica amadurece aproximadamente dez ovócitos em cada ciclo de cio. Os folículos são classificados em vários estádios de desenvolvimento: primordial, primária, secundária, antral e folículos de Graaf, dependendo da forma da camada granulosa celular ao redor de cada oócito. A maioria dos folículos primordiais são dormentes, e alguns deles são ativados e crescem em folículos primários em cada ciclo de cio². Após a fase folicular secundária, desenvolvimento folicular é principalmente regulado por gonadotrofinas, foliculares estimulante hormônio (FSH) e hormônio luteinizante (LH). No entanto, desenvolvimento do folículo primário e primordial é independente de gonadotrofinas, e os mecanismos de regulação que regem esses estágios permanecem mal inderstood^3,4,5. Além de hormônios e fatores de crescimento, o folículo primário e primordial é regulado pelas interações entre folículos^6,7. Portanto, realizamos análises de dinâmica de folículo nos tecidos do ovário de rato e investigou os mecanismos de regulação associados usando culturas de tecido ovariano^8,9,10.

Neste documento, apresentamos dois métodos de modelo de cultura de tecido ovariano. O primeiro é usado para analisar o desenvolvimento do folículo por medição de superfícies foliculares, e a segunda é usada para estudar o mecanismo regulatório durante o início do desenvolvimento folicular de primordial para a fase de folículo secundário com ratos transgénicos. Para análise do desenvolvimento do folículo, utilizado principalmente ovários de camundongos fêmeas 4 semana de idade porque permitem fácil visualização dos folículos. Para induzir a ovulação periódica e o desenvolvimento de modelos em vivo do folículo, nós reproduzido o aumento de LH e ovulação observada, atresia do folículo e secreção de estradiol em condições de cultura de tecidos. Imagens dos ovários cultivadas foram capturadas, e os processos de desenvolvimento do folículo foram analisados por mudanças de rastreamento na área folicular. No entanto, nas análises de microscopia de campo claro, a distinção entre folículos primários primordiais e no início era clara. Assim, desenvolvemos um método para detectar pequenos folículos e distinguir entre o primordial, primário, e culta de folículo secundário em tecidos ovarianos usando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovários de camundongos transgênicos R26-H2B-mCherry nos dias 0 e 4 após nascimento¹¹. Oog1 expressão é detectável em oócitos após a entrada em meiose e aumenta gradualmente com o desenvolvimento do folículo, permitindo a observação da transição do primordial de folículos primários usando imagens de lapso de tempo do tecido do ovário culta^{11 ,12}. Embora métodos morfológicos foram usados para estudar os fatores que ativam dormente folículos primordiais^13,14,15,16, desenvolvimento do folículo fisiológicas nos ovários é difícil de observar, e os efeitos dos vários fatores permanecem descaracterizados. Os métodos de cultura presente foram projetados para resolver esta escassez nas análises em tempo real dos fatores de alvo.

No presente estudo, nós controladas desenvolvimento folicular usando um método de imagem de lapso de tempo e caracteriza-se o processo de desenvolvimento do folículo. Nossos novos métodos para oferecer uma ferramenta sem precedentes para investigar a fisiologia dos ovários.

Protocolo

Ratos foram alojados em um quarto do ambiente controlado a 23 ± 1 ° C, com um ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Protocolos de cuidados com animais e experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para a experimentação Animal da universidade médica de Aichi e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal incumbente.

1. preparação do meio de cultura e pratos

1. Para preparar o meio de cultura básico, adicionar soro fetal bovino (FBS, 5% v/v), FSH (100 MUI/mL), LH (10 mU/mL) e a penicilina-estreptomicina (penicilina, 100 U/mL; estreptomicina, 100 mg/mL) para alfa média essencial mínima (MEM-alfa) e mistura em tubos de 50 mL.
   Nota: Volumes totais dos necessários meios de cultura variam entre experiências, mas 1 mL de meio de cultura é geralmente suficiente para pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm.
2. Despeje a alíquotas de 1 mL de meio de cultura mista em pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm e definir lugar 30 mm celular cultura inserções em pratos. Pré-aquecer pratos em uma incubadora (5% de CO₂ e 37 ° C) e mídia.

2. preparação do tecido ovariano

1. Tampão de pre-quente fosfato salino (PBS) (−) e alfa-MEM contendo 5% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL em uma incubadora (5% de CO₂ e 37 ° C).
   Nota: Cerca de 3 mL de PBS (−) de alíquotas por ovário são suficientes para uso durante as dissecções de ovário, e alíquotas de 1 mL de MEM-Alfa são suficientes para armazenamento temporário de um único ovário em pratos de 3,5 cm.
2. Impostos especiais de consumo ovários dos 4 semana de idade ratos fêmeas do ICR (nomeado após o Instituto de pesquisa do câncer) e aparar os tecidos ao redor do ovário usando uma tesoura e pinça sob um microscópio estereoscópico. Reservar os ovários removidos em meio de cultura (ver passo 2.1) até o uso.
   1. Lugar único ovários em papel de filtro umedecidos com pré aquecido PBS (−) (consulte a etapa 2.1) e fatia em 4 pedaços, usando uma lâmina de micrótomo sob um microscópio estereoscópico.
      Nota: Os ovários de camundongos 4 semana de idade do ICR são cerca de 2 mm de diâmetro. O número de peças depende do tamanho do ovário; no entanto, cerca de 500 µm e espessura peças permitem observações de folículo adequada (em pedaços mais grossos do que 500 mm, a transparência do tecido é diminuída; em pedaços mais finos do que 500 mm, muitos folículos antrais são quebrados e perdidos).
   2. Após a dissecação, coloque os espécimes de ovário fatiado no meio de cultura previamente aquecido em pratos de 3,5 cm (consulte a etapa 2.1).

3. ovário cultura de tecidos

1. Deixar aproximadamente 0,5 µ l de meio de cultura por fatias finas de tecido ovariano na inserção da cultura de pilha onde o tecido será definida usando uma micropipeta.
2. Coloque cada espécime fatiado em uma gota de meio de cultura sobre as inserções de cultura de células usando uma pinça.
3. Cultura de tecidos de ovário em 5% CO₂ a 37 ° C.
4. Substitua o meio de cultura fresco médio pré-aquecido em 2 dias.
   Nota: A agenda de mudanças médias para a cultura de seções de ovário de ratos 4 semana de idade do ICR é apresentada na Figura 1.
   1. Para reproduzir o aumento de LH, trate culturas ovários de camundongos ICR 4 semana de idade, com o meio contendo 100 mU/mL FSH e LH por 12 h a cada 4 dias (Figura 1).

4. microscópio imagens de ovários culturas

1. Iniciar os ovários culturas de imagem após o dia 1, quando os tecidos tenham aderido sobre as inserções de cultura de células e realizar análises de microscópio confocal ou invertido em intervalos de 24 h para permitir o crescimento de folículos suficientes entre os pontos de tempo.
   Nota: A microscopia Confocal é superior à microscopia invertida para a observação de folículos nos ovários toda cultos.

5. imagem Time-Lapse de ovários culturas

1. Otimize as condições de imagem lapso de tempo, incluindo a intensidade do laser e tempos de exposição, para o sistema da imagem latente (tabela 1).
   1. Selecione amostras emparelhadas ovário de ratos único para uso como grupos tratamento e controle. Varie a intensidade do laser e tempo de exposição para conseguir as melhores imagens (tabela 1).
   2. Compare o crescimento do folículo sob cada condição de cultura medindo áreas folículo em imagens de amostras de controle em intervalos de 24 h e em Time-Lapse amostras de imagem (consulte a etapa 6). Simultaneamente, contar o número de oócitos ovulados em cada conjunto de ovário e escolher as condições óptimas de lapso de tempo da imagem latente.
2. Capture imagens em intervalos de 30 min, usando o sistema de imagens lapso de tempo, sob determinadas condições (tabela 1).

6. análise de crescimento do folículo

1. Para analisar o desenvolvimento do folículo, medir as áreas do folículo em imagens capturadas utilizando software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
   1. Inicialmente, defina a escala da imagem clicando em "Como definir a escala" sob "Analisar" na barra de ferramentas. Insira os comprimentos do lado da imagem capturada e os números correspondentes de pixels nos campos em branco de "Distância conhecida" e "Distância em pixels", respectivamente.
   2. Clique em "Mão livre" na barra de ferramenta e delinear os folículos nas imagens capturadas de campo brilhante.
   3. Clique em "Medida" em "Analisar" na barra de ferramentas.
      Nota: Se outros dados de medição são desejados, clique em "Definir medição" sob "Analisar" na barra de ferramenta e marque as caixas apropriadas na lista.

7. análise do desenvolvimento folicular usando ratos transgénicos

1. Colete os ovários de fatia pós-natal dias 0 e 4 (P0 e P4) feminino de ratos transgênicos contendo os transgenes Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherre cultura em inserções conforme descrito em etapas 1.1 – 3.2, exceto não o P0 e ovários P4.
2. Substitua o meio de cultura com meio fresco, previamente aquecido em pratos de 3,5 cm na incubadora, contendo 5% CO₂ a 37 ° C a cada 2 dias.
   Nota: A concentração de LH no meio de cultura de ovários P0 e P4 pode permanecer constante porque não ocorrem picos de LH em camundongos P0 e P4.
3. Defina o microscópio para visualizar apenas folículos primários AcGFP1 positivo em culta P4 ovários (tabela 1).
   Nota: Apenas primordiais e primários folículos estão presentes em ovários de fêmeas de rato de P4.
4. Capturar imagens de culto P0 Oog1pro3.9/ ovários de camundongos transgênicosR26-H2B-mCherry em intervalos de 30 min usando as configurações usadas para ovários P4 (ver passo 5.2).
5. Rastrear e analisar o desenvolvimento folicular usando sinais AcGFP1 e H2B-mCHerry.

Resultados

A Figura 1 mostra o protocolo para mudanças nos meios de comunicação durante a cultura de tecido ovariana. Seguir este programa, os ovários de camundongos ICR 4 semanas de idade foram cultivadas e fotografada em intervalos de 24 horas usando microscopia confocal (Figura 2). Durante a cultura de tecidos de ovário durante 3 semanas, mais folículos antrais e secundários foram degenerou por atresia do folículo e alguns eram ovularam ...

Discussão

Neste estudo, desenvolvemos dois novos métodos para o estudo do desenvolvimento folicular em ovários de rato. O primeiro método envolve a cultura de tecidos de ratos adultos ovário fatiado seguido por análises do desenvolvimento folicular, e o segundo envolve o uso de time-lapse de imagem para visualizar o início do desenvolvimento folicular durante a fase independente de gonadotrofinas. Anteriormente, usamos o presente método de cultura de tecido do ovário para avaliar o efeito de fator inibitório de leucemia e progeste...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hormônio folículo estimulante da hipófise humana	SIGMA	F4021
Hormônio lutenizante da hipófise equina	SIGMA	L9773
Solução de penicilina-estreptomicina	Wako Pure Chemical Industries	168-23191
MEM a, GlutaMax, sem nucleotídeos	Thermo Fisher	32561037
prato de fundo de vidro	MatTek	P35G-0-10-C	Prato de 35 mm, lamínula nº 0, diâmetro de vidro de 10 mm
Inserção de cultura de células Millicell	Merck Millipore	PICM0RG50	Diâmetro: 315 mm, tamanho do poro: 0,4 mm, material: placas de cultura de células PTTE hidrofílicas
3,5 cm	greiner bio-one	627160
50ml / tubo de centrífuga com tampa de vedação tripla	IWAKI	2345-050
Lâminas descartáveis de baixo perfil 819	Leica	14035838925
LSM 710	Microscópio confocal	Carl Zeiss
CellVoyager, CV1000	Yokogawa Electric Corporation		Aquisição de imagens com lapso de tempo
BZ-X700	KEYENCE		Aquisição de imagens com lapso de tempo

de