Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.
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Artigo de método
Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse
Neste artigo
Resumo
Resumo
As fêmeas de mamíferos ovulam periodicamente um número quase constante de oócitos durante cada ciclo de cio. Para sustentar tal regularidade e periodicidade, regulamento ocorre no nível do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e no desenvolvimento de folículos nos ovários. Apesar dos estudos ativos, mecanismos de desenvolvimento do folículo não são claros, devido as diversas etapas envolvidas desde a ativação do folículo primordial dormente a ovulação e devido a complexidade de regulamento que difere em cada fase folicular. Para investigar os mecanismos do desenvolvimento folicular e a dinâmica dos folículos durante todo o ciclo do estro, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido ovariano de mouse que pode ser usado para observar o desenvolvimento folicular usando um microscópio. Desenvolvimento sistemático folicular, ovulação periódica e atresia do folículo podem ser reproduzidos no modelo do culto do ovário, e as condições de cultura podem ser moduladas experimentalmente. Aqui, vamos demonstrar a utilidade desse método no estudo dos mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular e outros fenômenos no ovário.
Introdução
Ovários de rato fêmea contenham vários milhares de folículos1e ovulação periódica amadurece aproximadamente dez ovócitos em cada ciclo de cio. Os folículos são classificados em vários estádios de desenvolvimento: primordial, primária, secundária, antral e folículos de Graaf, dependendo da forma da camada granulosa celular ao redor de cada oócito. A maioria dos folículos primordiais são dormentes, e alguns deles são ativados e crescem em folículos primários em cada ciclo de cio2. Após a fase folicular secundária, desenvolvimento folicular é principalmente regulado por gonadotrofinas, foliculares estimulante hormônio (FSH)....
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Protocolo
Ratos foram alojados em um quarto do ambiente controlado a 23 ± 1 ° C, com um ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Protocolos de cuidados com animais e experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para a experimentação Animal da universidade médica de Aichi e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal incumbente.
1. preparação do meio de cultura e pratos
- Para preparar o meio de cultura básico, adicionar soro fetal bovino (FBS, 5% v/v), FSH (100 MUI/mL), LH (10 mU/mL) e a penicilina-estreptomicina (penicilina, 100 U/mL; estreptomicina, 100 mg/mL) para alfa média essencial mínima (MEM-alfa) e mistura em tubos ....
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Resultados
A Figura 1 mostra o protocolo para mudanças nos meios de comunicação durante a cultura de tecido ovariana. Seguir este programa, os ovários de camundongos ICR 4 semanas de idade foram cultivadas e fotografada em intervalos de 24 horas usando microscopia confocal (Figura 2). Durante a cultura de tecidos de ovário durante 3 semanas, mais folículos antrais e secundários foram degenerou por atresia do folículo e alguns eram ovularam .......
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Discussão
Neste estudo, desenvolvemos dois novos métodos para o estudo do desenvolvimento folicular em ovários de rato. O primeiro método envolve a cultura de tecidos de ratos adultos ovário fatiado seguido por análises do desenvolvimento folicular, e o segundo envolve o uso de time-lapse de imagem para visualizar o início do desenvolvimento folicular durante a fase independente de gonadotrofinas. Anteriormente, usamos o presente método de cultura de tecido do ovário para avaliar o efeito de fator inibitório de leucemia e progeste.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) para fornecer os ratos Oog1pro3.9 . Esta pesquisa foi apoiada pelos JSPS (KAKENHI # JP15H06275) e a Fundação Nitto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hormônio folículo estimulante da hipófise humana | SIGMA | F4021 | |
| Hormônio lutenizante da hipófise equina | SIGMA | L9773 | |
| Solução de penicilina-estreptomicina | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, sem nucleotídeos | Thermo Fisher | 32561037 | |
| prato de fundo de vidro | MatTek | P35G-0-10-C | Prato de 35 mm, lamínula nº 0, diâmetro de vidro de 10 mm |
| Inserção de cultura de células Millicell | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diâmetro: 315 mm, tamanho do poro: 0,4 mm, material: placas de cultura de células PTTE hidrofílicas |
| 3,5 cm | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / tubo de centrífuga com tampa de vedação tripla | IWAKI | 2345-050 | |
| Lâminas descartáveis de baixo perfil 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Microscópio confocal | Carl Zeiss | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Aquisição de imagens com lapso de tempo | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Aquisição de imagens com lapso de tempo |
Referências
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.<....
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Reimpressões e permissões
