Explorando o potencial das células-tronco mesenquimais folha sobre o desenvolvimento do Carcinoma hepatocelular na Vivo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver um modelo câncer in vivo usando a tecnologia de célula de folha. Tal modelo poderia ser muito útil para a avaliação da terapêutica antineoplásica.

Resumo

Em vivo modelo animal que imita o câncer humano poderia ter vários aplicativos que oferecem informação clínica significativa. As técnicas atualmente utilizadas para o desenvolvimento de modelos de câncer na vivo tem limitações consideráveis. Portanto, neste estudo, pretendemos implementar tecnologia de folha de célula para desenvolver um modelo de câncer na vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) é desenvolvido com sucesso em ratos nus usando folhas de célula criadas a partir de células de linha celular HCC. Os lençóis de células de câncer são gerados através de adesão intracelular e a formação de uma estrutura estratificada, controlada pela matriz extracelular. Isto permite o transplante de folha do HCC para o fígado e a criação de um modelo animal de tumor-rolamento dentro de um mês. Além disso, o papel das células-tronco mesenquimais (MSC) no desenvolvimento deste modelo de câncer é investigado. Além da folha de linha celular HCC, outro folhas de duas células são criadas: uma folha de células HCC e medula óssea MSCs (BMMSCs) e uma folha de células HCC e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). Folhas com uma combinação de células HCC e MSCs também são capazes de produzir um animal de tumor-rolamento. No entanto, a adição de MSCs reduz o tamanho do tumor formado, e esse efeito adverso sobre o desenvolvimento do tumor varia de acordo com fonte do MSCs usados. Isto indica que uma folha de células de determinados subtipos MSC poderia ser utilizada no controle e gerenciamento do tumor.

Introdução

HCC é um câncer primário do fígado que está significativamente associado um mau prognóstico. Anualmente, quase meio milhão novos pacientes são diagnosticados com HCC, representando 85% dos pacientes de câncer de fígado em todo o mundo¹. Hepatocarcinogenesis não é uma doença de forma única; pelo contrário, é uma coleção de doenças que têm diferentes características histopatológicas e variabilidade genética e genômica, além de variados prognóstico resultados¹. Portanto, os principais desafios no desenvolvimento de uma estratégia terapêutica eficaz para HCC são o limitado conhecimento da biologia HCC e a falta de um modelo animal experimental apropriado que pode ajudar a entender esta doença complexa. Em vivo modelo animal que imita o câncer humano é necessário para seleção de genes candidatos e identificar marcadores prognóstico/preditivo implicados na indução de câncer, bem como para a investigação de diferentes fatores que podem afetar respostas de câncer de agentes terapêuticos.

Estudos in vitro do câncer estão ainda associados com maiores limitações. Isto é devido ao fato de que as células cancerosas perdem muitas das suas características na vivo , quando mantidas em cultura. As mudanças que ocorrem em células em vitro resultado da ausência de fisiologia do tecido inteiro num cenário ex vivo . Interação de célula para célula de câncer (do estroma, imune, vascularização, epitelial, etc.) dentro do microambiente do tumor reflete muito sobre câncer célula características². O microambiente do tumor pode alterar a expressão de gene/proteína de células de câncer e características fenotípicas, além de angiogenetic e potencial metastático. O sistema de cultura bidimensional (2D) em vitro também carece de uma matriz de tecido apropriado, o que é necessária regulamentar a progressão do tumor. Assim, devido a essas limitações, modelos em vivo devem sempre ser utilizados para apoiar as conclusões preliminares dos modelos em vitro . Neste estudo, nós usamos a tecnologia de folha de célula para desenvolver no vivo modelo animal que elucida o completo processo biológico subjacente HCC.

Mais de uma década atrás, laboratório do Okano estabeleceu um novo método de engenharia de tecidos, com base na célula folha tecnologia³. Esta técnica utiliza um plástico de cultura thermo-responsivo para permitir a aderência de célula reversível/destacamento controlando a hidrofobicidade de superfície. Este método permite uma suave colheita de culturas de células de formato um intacto tridimensional (3D) (folha i.e.,cell), com uma cuidada da matriz extracelular (ECM) e interações de célula para célula. A técnica de folha célula requer o precoating de pratos de cultura com uma temperatura-responsivo polímero poly(N-isopropylacrylamide) (sou de PIPA), que é comercialmente disponível e pronto para uso. A uma temperatura abaixo de 20 ° C, polímeros PIPA estou tornam-se hidratado e dissolve-se em soluções aquosas, Considerando que, a uma temperatura mais elevada (37 ° C), os polímeros tornar-se desidratado e transformam em um precipitado turvo. O polímero contém cadeias hidrofílicas de Amida e cadeias laterais hidrofóbicas (grupos de isopropil). Em altas temperaturas, o movimento browniano das moléculas de água se intensifica, Considerando que, em uma baixa temperatura, as moléculas de água circundantes isopropílico grupos do colapso da estrutura hidratado e os grupos hidrofóbico isopropílico agregar por causa de interações hidrofóbicas. Portanto, toda a cadeia do polímero agrega e precipita-se⁴.

No estudo apresentado, esta técnica é empregada para desenvolver um modelo animal de HCC, usando três folhas de célula diferente. A primeira folha de empregados é composto HCC célula linha células apenas, enquanto as outras duas folhas consistem em uma combinação de células de linha celular HCC e MSCs de duas fontes diferentes: MSCs da medula óssea (BMMSCs) e cordão umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs são células do estroma não-hematopoiéticas que são capazes de diferenciar intocell derivados da linhagem mesenquimal, incluindo adipócitos, osteócitos, condrócitos e miócitos⁵. A razão pela qual que empregamos essas células, ao criar a camada de células de câncer é o relatórios inconsistentes sobre o efeito do MSCs em cânceres. Tem sido sugerido que o MSCs podem ter dois fenótipos distintos: "MSC1", um fenótipo de proinflammatory e "MSC2", um fenótipo imunossupressoras⁶. MSCs expressam receptores toll-like (TLRs). TLR4 escorva do MSCs aumenta sua secreção de fatores de proinflammatory, Considerando que o TLR3 escorva aumenta sua secreção de fatores imunossupressores⁶. Um estudo em vitro destes dois fenótipos relatou que uma cultura co de MSC1 com linhas de células de câncer atenuado o crescimento de células de câncer, enquanto MSC2 co-cultura teve o efeito oposto⁷. Isto implica que MSCs podem ser pro-câncer ou anticâncer, dependendo de seu fenótipo. Assim, além de desenvolver o modelo animal de HCC, usando a tecnologia de célula de folha, queremos explorar o efeito da MSC transplantes no desenvolvimento do tumor, e se usar essas células irão aumentar ou reduzir o desenvolvimento deste modelo.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comité de ética da Universidade Rei Saud. Procedimentos cirúrgicos, anestésicos e outros medicamentos utilizados em animais são aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Rei Saud. Todo o trabalho experimental é executado por pessoal adequadamente treinado.

1. célula folha construção

1. Revestir os pratos de cultura (pratos de cultura responsiva a temperatura de 3,5 cm) com soro bovino fetal não diluído (FBS) e certifique-se de cobrir toda a superfície do prato.
   Nota: Este passo é importante para o destacamento da camada de células, uma vez que suporta o crescimento das células em uma monocamada e impede a agregação de célula.
2. Incube os pratos por 24 h a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO₂ e 95% ar umidificada.
3. Retire o excesso FBS os pratos revestidos e permitir que os pratos secar à temperatura ambiente (RT) pelo menos 1 h.
4. Preparar as suspensões de três celulares: 1 x 10⁶ HepG2 células, 1 x 10⁶ HepG2 células com BMMSCs e 1 x 10⁶ HepG2 células com UCMSCs (em uma proporção de 4:1 para BMMSCs e UCMSCs).
5. A suspensão de célula apropriada para cada prato rotulado de semente.
6. Suspenda todas as células em cultura DMEM suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina.
7. Incube as células a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO₂ e 95% ar umidificada.

2. célula folha de desprendimento

1. Na confluência de célula de 100%, se os pratos da incubadora a 37 ° C.
2. Incube o prato de folha de célula HepG2 por 1h no RT, ao mesmo tempo incubando o HepG2/BMMSC e pratos de folha de célula HepG2/UCMSC por 30-40 min, a 20 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO₂ e 95% ar umidificada.
   Nota: A camada de células feita a partir apenas de HepG2 é frágil; reduzindo a temperatura a 20 ° C provoca danos à estrutura da folha.

3. desempenho do procedimento cirúrgico

Nota: Durante o tempo de incubação para o destacamento de folha do celular, inicie o tratamento de animais.

1. Instruções para a preparação da área de cirurgia
   1. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos em uma área estéril separada dentro do laboratório, como um capuz, fluxo laminar ou uma sala de cirurgia asséptica. Certifique-se de que todas as superfícies da área de cirurgia são não-poroso, selado, durável e sanitizable.
   2. Use equipamento de proteção adequado, incluindo avental, luvas, máscaras e cabeça e sapato cobre.
   3. Uso cirúrgico ferramentas que são limpo e esterilizado (através de autoclavagem; haste saturada sob alta pressão) no início da cirurgia.
   4. Mudar as luvas entre ratos.
2. Preparação do animal para a cirurgia
   1. Use ratos nus de 8 a 12 semanas de idade.
   2. Crie a anestesia injetável para ratos.
      1. Para preparar a solução de anestesia, xilazina-cetamina, misture 2 mL de cetamina, 1 mL de xilazina (em uma concentração de 20 mg/mL) e 1 mL de salina fisiológica estéril (por exemplo, 0,9% de cloreto de sódio) em um frasco de coleta estéril 10 mL de soro e agite bem antes de Use.
      2. Para aplicar anestesia, injete intraperitonealmente 0,2 mL da solução de xilazina-cetamina por 100 gramas de peso do corpo do rato.
         Nota: A dose total da solução é de 100 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg de xilazina.
   3. Remova sujeira/sujidade visível do local cirúrgico.
   4. Verifique a profundidade da anestesia por testar o reflexo de retirada de pedal (pitada de almofada de pé sobre as duas patas traseiras).
      Nota: A pitada de almofada do pé provoca uma resposta, repetir na dose de 0,05 mL/100 g (aproximadamente a cada 30 min), se volte a verificar a profundidade anestésica.
   5. Desinfete a área de cirurgia com uma esfoliação de dois estágios por povidone-iodo/isopropanol.
   6. Cobrir o rato com um pano estéril para evitar a contaminação da incisão.
   7. Injetar os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg)⁸ antes de fazer a incisão.
   8. Usando um bisturi estéril, fazer um 7 para 10-cm corte entre a pele e os músculos subjacentes para expor o fígado.
      1. Separe o músculo abdominal da pele com a parte traseira lisa borda do bisturi.
      2. Cuidadosamente a esfaquear o linea alba usando um bisturi e estender o corte com tesoura afiada.

4. célula folha transplante

Nota: O transplante de células folha é realizado no fígado.

1. Recolha a camada de células da placa de cultura.
   1. Bata levemente o prato de cultura sobre o banco para retirar a folha de sua superfície.
   2. Separe a camada de células da superfície do prato raspando a borda da folha em um meio círculo, usando a ponta da pipeta estéril.
   3. Suavemente retire o meio inteiro o prato de cultura.
   4. Garantir que a folha está intacta, sem nenhum dano; caso contrário, não pode ser usado (Figura 1).
      Nota: As folhas resultantes podem ser detectadas diretamente pelo olho.
2. Prepare uma membrana esterilizada (papel de filtro) para colher a folha célula do prato.
   1. Primeiro, embeba a membrana com solução salina normal. Em seguida, retire o soro em excesso com uma almofada de algodão estéril.
   2. Coloque a membrana molhada sobre a camada de células, evitando dobras e bolhas de ar entre a membrana e a camada de células.
   3. Adicione algumas gotas de solução salina sobre a membrana e a camada de células para coletá-los mais fácil.
      Nota: Para evitar quebrar a camada de células, não utilize soro fisiológico frio e levantar a membrana e a camada de células com fórceps.
   4. Embora a membrana por alguns segundos garantir que a camada de células é bem presas à membrana e depois cobrá-lo.
3. Prepare o fígado para transplante de células folha.
   1. Certifique-se que a superfície do fígado é seca tocando-o suavemente com uma almofada de algodão estéril.
   2. Usando a pinça estéril, coloque a membrana com a camada de células sobre um único lóbulo do fígado do rato.
   3. Adicione algumas gotas de solução salina estéril e aplique uma ligeira pressão à membrana para separar a camada de células dele.
   4. Espere 5 minutos antes de remover cuidadosamente a membrana.
      Nota: Isto é feito para garantir que a camada de células está bem colocada para o fígado.
   5. Finalmente, fechar os músculos subjacentes e a pele incisões com suturas de nylon 5-0.
   6. Desinfete a área de cirurgia com iodo-povidona.
      Nota: A Figura 2 mostra um diagrama do processo de transplante de células folha no fígado de rato nude.

5. cuidados pós-operatório de

1. Imediatamente após a cirurgia, o rato individualmente para evitar canibalismo ou asfixia de casa e monitorá-lo regularmente (pelo menos a cada 15 min) até que seja consciente e totalmente ambulant.
2. Em seguida, avalie os ratos diariamente por 5-14 d, pelo menos 5 d no período pós-operatório, para garantir que não há nenhuma complicação. Durante a avaliação diária, certifique-se do seguir.
   1. A ferida é fechada, e as suturas estão intactas, sem ser excessivamente apertado.
   2. Não há sinais de infecção no local da incisão, tais como calor, excessiva descarga purulenta ou inchaço.
   3. Não há sinais associados com dor, tais como o reduzido consumo de comida e água, perda de peso, desidratação, pele acampar ou respiração rápida e aberto. Para controle de moderada a severa dor depois da cirurgia, se for o caso, injete os ratos por via subcutânea com buprenorfina (0,01 - 0,05 mg/kg) cada 6-8 h⁹ por um período mínimo de 48 a 72 h no pós-operatório.

6. análise da área transplantada

1. Um mês após o transplante, scarifice o rato e recolher a área transplantada para histológica e análise imuno-histoquímica.

Resultados

Tumorigenicidade de lençóis de células transplantadas em ratos:

Um mês após o transplante, todas as folhas de célula transplantado em fígados de ratos desenvolveram tumores (Figura 3). O tamanho médio dos tumores desenvolvidos de HepG2, HepG2/BMMSC e folhas de célula HepG2/UCMSC foram 4,5 cm, 4 cm e 2,5 cm, respectivamente,¹⁰.

Discussão

Uma extensa quantidade de pesquisa é dedicada ao desenvolvimento de um adequada na vivo pré-clínicos modelo animal que se assemelha a cânceres humanos. Atualmente, as principais abordagens usadas para criar modelos animais câncer envolvem engenharia genética e células de transplantação¹¹. Modelos de animais geneticamente modificados são boas ferramentas para a identificação e validação de genes-alvo, bem como compreender os mecanismos moleculares subjacentes a toxicidade induzida por drog...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
FBS	Gibco/Invitrogen	10270106
DMEM glicose alta	Sigma	D5671-500ML
	Life Technology	15070063
Solução salina fisiológica estéril	Sigma	S0817-1GA
Linha celular HepG2 humana	ATCC, EUA	HB-8065
Linha celular MSCs de medula óssea humana	PromoCell, EUA	C-12974
MSCs de tecido do cordão umbilical humano	PromoCell, EUA	C-12971
Cetamina 50%	Rompun, Bayer
Xylazine 2%	Rompun	23076-35-9
Alphadine®   solução.	Riyadh Pharma	LBL0816
Descartáveis:
15mL Polipropileno Alta Clareza PP Tubo de Centrífuga	Falcon
placas de cultura UpCell estéreis de 3,5 cm com o papel de filtro (membrana)	Sigma	174904-1CS
100-1000 µ l   Ponteiras de pipeta	Sigma	CLS4868-1000EA
Campo de Procedimento Básico	Thermofisher	PMD5293.0
Equipment  Pipeta
Plus, volume variável	Eppendorf®   Pesquisa®	Z683779-1EA
Incubadora de cultura de tecidos 37 ° C, 5% CO2	Qualquer marca
Armário de segurança biológica	Qualquer marca
Incubadora de cultura de tecidos 20 ° C, 5% CO2	Qualquer marca
Ferramentas cirúrgicas estéreis e ratos nus:
Pinça
Tesoura
bisturi
Sutura de Nylon  5-0	Accutome	AB-3854S	Monofilamento, Lanceta
1 ml Seringas de Tuberculina	Fisher Scientific	14-826-88
Ratos nus	Rio