Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.
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Artigo de método
Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.
Introdução
Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteraç....
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Protocolo
1. sincronizada cultura de c. elegans
- Antes da semeadura, cultura de Escherichia coli (e. coli) estirpe OP50 durante a noite a 37 ° C em 300 mL de meio líquido de caldo de Luria-Bertani (LB). Armazenar o OP50 cultivadas a-4 ° C.
- Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave.
Nota: OP50 e c. elegans cepas estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis (Universidade de Minnesota, St. Paul, MN, EUA).
- Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave.
- Para tornar o ágar de nematoides crescimento mé....
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Resultados
Usando os ensaios colorimétricos para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato, mostramos a precisão destes ensaios em comparação com os relatórios anteriores em c. elegans7,8. Aqui, o processo de precipitação de proteínas durante a extração da amostra foi a etapa mais crucial para gerar valores precisos. Para a precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., TCA, PCA, ou ácido metaf.......
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Discussão
Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes. Nós não detectar ce.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Ensaio Colorimétrico/Fluorimétrico de Lactato | BioVision | #K607-100 | ensaios colorimétricos/fluorimétricos 100; Armazene a -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit | Systems | #EPYR-100 | colorimetric/fluorometric 100 ensaios; Armazene a -20oC |
| Kit de Ensaio de Proteína BCA | Thermo Scientific | #23225 | ensaio colorimétrico; armazene em |
| Ácido Tricloroacético Wako | Pure Chemical | #207-04955 | à temperatura ambiente |
| Homogeneizador de Teflon | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Em vez de Iwaki/Pyrex, disponível por Wheaton |
Referências
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N.
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Reimpressões e permissões
