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Artigo de método

Comparação de alta resolução de frequências de conjugação bacteriana

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DOI:

10.3791/57812

⸱

10 de janeiro de 2019

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

Neste artigo

Resumo

Com o objetivo de entender os comportamentos dos vários elementos de conjugativo bacterianos DNA sob diferentes condições, descrevemos um protocolo para a detecção de diferenças na frequência de conjugação, com alta resolução, para estimar quanto à eficácia da bactéria doadora inicia a conjugação.

Resumo

Conjugação bacteriana é um passo importante na transferência horizontal de genes de resistência aos antibióticos através de um elemento conjugativo de DNA. Comparações em profundidade da frequência de conjugação em diferentes condições são necessárias para entender como o elemento conjugativo se espalha na natureza. No entanto, os métodos convencionais para comparar a frequência de conjugação não são apropriados para comparações em profundidade devido o fundo elevado causado pela ocorrência de eventos adicionais conjugação na placa seletiva. Com sucesso, nós reduzimos o fundo através da introdução de um método de (MPN) número mais provável e uma maior concentração de antibióticos para evitar a conjugação em meio líquido seletivo. Além disso, desenvolvemos um protocolo para estimar a probabilidade de como muitas vezes doador células iniciadas conjugação, classificando as células único doador em pools destinatários por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação. Usando dois plasmídeos, pBP136 e pCAR1, as diferenças na frequência de conjugação em células de Pseudomonas putida poderiam ser detectados em meio líquido em diferentes taxas de agitação. As frequências de início conjugação foram maiores para pBP136 do que para pCAR1. Usando estes resultados, podemos entender melhor as características de conjugação nestes dois plasmídeos.

Introdução

Conjugação bacteriana de elementos genéticos móveis, plasmídeo conjugativo e elementos integrativo e conjugativo (CIEM) é importante para a propagação horizontal de informação genética. Pode promover a adaptação e a rápida evolução bacteriana e transmitir genes de resistência multidrogas1,2. A frequência de conjugação pode ser afetada por proteínas codificadas nos elementos conjugativo para mobilização de DNA (MOB) e formação de par acasalamento (MPF), incluindo pili sexual, que é classificados de acordo com a máfia e MPF tipo3,4, 5. Ele também pode ser afetado pelo dador e o receptor par6 e as condições de crescimento das células7,8,9,10,11,(12 taxa de crescimento, densidade celular, superfície sólida ou meio líquido, temperatura, disponibilidade de nutrientes e a presença de cátions). Para entender como os elementos conjugativo se espalhou entre as bactérias, é necessário comparar a frequência de conjugação em detalhe.

A frequência de conjugação entre o dador e o receptor pares após o acasalamento normalmente são estimados por métodos convencionais como segue. (i) em primeiro lugar, o número de colônias de dador e o receptor é contado; (ii) em seguida, as destinatários colônias, que recebeu os elementos conjugativo (= transconjugants) são contadas; (iii) e, finalmente, a frequência de conjugação é calculada dividindo-se a unidades (CFU) formadoras do transconjugants por aqueles do doador e/ou destinatário13. No entanto, ao usar esse método, o fundo é alto devido a eventos de conjugação adicionais que também podem ocorrer nas placas seletivas usadas para obter o transconjugants, quando a densidade celular é alto10. Portanto, é difícil de detectar pequenas diferenças na frequência (abaixo de uma diferença de 10 vezes). Nós recentemente introduziu um método de (MPN) de número mais provável usando meio líquido contendo uma concentração maior de antibióticos. Esse método reduziu o fundo inibindo mais conjugação em meio seletivo; assim, a frequência de conjugação pode ser estimada com maior resolução.

Conjugação pode ser dividida em três etapas: (1) acessório do doador-beneficiário par (2) início de transferência conjugativo e (3) dissociação do par14. Durante as etapas de (1) e (3), não há interação física entre o doador e receptor células; assim, a densidade celular e as condições ambientais podem influenciar estas etapas, embora as características de pili do sexo também são importantes. Passo (2) provavelmente é regulado pela expressão de vários genes envolvidos na conjugação em resposta às mudanças externas, o que poderia ser afetado por várias características do plasmídeo, doador e receptor. Embora a ligação física ou desprendimento dos pares doador-receptor pode ser matematicamente simulado usando uma estimativa de células como partículas, a frequência do passo (2) deve ser medida experimentalmente. Tem havido alguns relatórios sobre observações diretas de como muitas vezes os doadores podem iniciar a conjugação [passo (2)] usando fluorescência microscopia15,16; no entanto, esses métodos não são elevado-throughput porque um grande número de células deve ser monitorado. Portanto, nós desenvolvemos um novo método para estimar a probabilidade da ocorrência de passo (2) usando célula de fluorescência ativada classificação (FACS). Nosso método pode ser aplicado a qualquer plasmídeo, sem identificação dos genes essenciais para conjugação.

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Protocolo

1. preparação de um doador com proteína verde fluorescente (GFP)- e canamicina resistência Gene-tag plasmídeos

  1. Introdução de genes de marcador para o destino do plasmídeo pBP136
    Nota: O objetivo do presente protocolo é gerar pBP136::gfp. As estirpes bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo são listados na tabela 1.
    1. Cultivar culturas de Escherichia coli DH10B abrigando pBP13617 em 5 mL de caldo estéril de Luria (LB) e Escherichia coli S17-1λpir18 abrigando pJBA2819 [contendo uma canamicina (Km)-resistência genética e gfp mut3 * gene com seu promotor e terminador em um mini-Tn5] em 5 mL de LB esterilizado contendo 50 μg/mL Km a 37 ° C durante a noite (O/N, 16 – 24 h) com agitação em 200 rotações por minuto (rpm).
    2. Colheita e lavagem
      1. Colher 1 mL de cada cultura, colocá-lo em um microtubo de 2 mL e centrífuga (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min). Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
      2. Centrífuga novamente (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min) e ressuspender em 500 µ l de PBS estéril.
    3. Filtro de acasalamento
      1. Preparar estéril placas LB (com ágar 1,6%) e colocar um filtro de membrana de tamanho de poro estéril 0,22 μm nele. Mix de 500 μL de Escherichia coli S17-1λpir pJBA28 abrigando com Escherichia coli DH10B abrigar pBP136 e mancha a mistura sobre o filtro sobre a placa LB. Incubar a placa O/N a 30 ° C. Remova o filtro da placa de LB, colocá-lo em um tubo de plástico estéril 50 mL e adicionar 1 mL de PBS estéril.
        Nota: pJBA28 pode replicar na presença de proteínas Π, codificada pelo pir gene18e podem ser transferidos de S17-1λpir para DH10B. pBP136 carrega nenhum marcador gene17 e pode ser transferido de DH10B para S17-1λpir. Portanto, não conseguia distinguir S17-1λpir abrigando pBP136 e pJBA28 de pBP136 de abrigar DH10B e o mini-Tn5 (transposto para o cromossomo ou pBP136) nesta fase. Então, usamos as misturas deles como doadores em etapas subsequentes (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Crescer uma cultura O/N da mistura acima em LB esterilizado contendo 50 μg/mL Km a 37 ° C, com agitação a 200 rpm e uma cultura de Pseudomonas putida KT2440 acasalamento [Km-sensíveis (Kms), sensíveis à rifampicina (Rifs), sensíveis à gentamicina (Gms) e resistente a tetraciclina (Tcr)] em meio contendo 12,5 μg/mL Tc a 30 ° C, com agitação a 200 rpm.
    5. Após a colheita e lavagem das células como na etapa 1.1.2, usá-las (o acasalamento mistura e KT2440) filtro de acasalamento (O/N, 30 ° C) como na etapa 1.1.3.
    6. Prepare-se estéril LB placas contendo 50 μg/mL Km e 12,5 μg/mL Tc (LB + Km + Tc placas).
    7. Dilua a mistura ressuspensa do filtro de membrana com PBS estéril (101– 105-Dobre) e então propagação cada diluição em LB + Km + Tc as placas e incubar as placas a 30 ° C, durante 2-3 d.
    8. Escolha colônias das placas, crescer uma cultura O/N em LB esterilizado contendo Km e Tc, bem como P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr e Gmr)6 em LB esterilizado contendo Rif (25 μg/mL) e Gm (30 μg/mL) a 30 ° C e 200 rpm.
      Nota: Conforme descrito na Nota anterior, as colônias no LB + Km + Tc placas (1.1.7.) pode estar abrigando pBP136 KT2440 carregando um mini-Tn5 e KT2440 com um mini-Tn5, porque pJBA28 pode ser transferido diretamente do S17-1λpir abrigando a pBP136 e pJBA28 para KT2440. Eis porque outro acasalamento com p. resinovorans CA10RG é necessário para obter o pBP136 de alvo com um mini-Tn5 nas etapas a seguir.
    9. Após a colheita e lavagem das células como na etapa 1.1.2, usá-los para filtro de acasalamento (O/N, 30 ° C) como na etapa 1.1.3.
    10. Prepare-se estéril LB placas contendo Rif, Gm e Km (LB + Km + Rif, Gm placas).
    11. Resuspenda a mistura sobre o filtro e em seguida diluir 101– 105-dobre, espalhe-o sobre LB Rif + Km + Gm as placas e incubar as placas por 2 – 3 d a 30 ° C.
    12. Escolha as colônias e verificar se eles abrigam pBP136 por PCR utilizando primers específicos para o plasmídeo.
  2. Introdução de um gene marcador seletivo o alvo do plasmídeo pCAR1
    Nota: O objetivo do presente protocolo é gerar pCAR1::gfp
    1. Crescer uma cultura O/N de p. putida KT2440 abrigando pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 a 200 rpm e 30 ° C e e. coli S17-1λpir18 abrigando pJBA28 em 5 mL de LB estéril contendo 50 μg/mL Km a 200 rpm e 37 ° C.
    2. Após a colheita e lavagem das células como na etapa 1.1.2, usá-los para filtro de acasalamento (O/N, 30 ° C) como na etapa 1.1.3.
    3. Remova o filtro da placa de LB, colocá-lo em um tubo de plástico estéril 50 mL e adicionar 1 mL de PBS estéril.
    4. Dilua a mistura ressuspensa com PBS estéril (101– 105-Dobre) e espalhe a mistura diluída em estéril seletiva LB + Tc + Km placas.
      Nota: pCAR1 não Replica em Escherichia coli; assim, p. putida KT2440 abrigando pCAR1 com um mini-Tn5 podem ser selecionados na LB + Tc + Km placas.
    5. Escolher uma colônia da placa e crescer uma cultura O/N em LB esterilizado contendo Km e Tc e uma cultura de P. resinovorans CA10dm4RG em LB esterilizado contendo Rif e Gm (200 rpm, 30 ° C).
    6. Após a colheita e lavagem como na etapa 1.1.2, use as células para filtro (O/N, 30 ° C) de acasalamento como etapa 1.1.3.
    7. Ressuspender a mistura sobre o filtro e então diluí-lo, espalhar sobre LB + Km + Rif, Gm, placas e incubar as placas por 2 – 3 d a 30 ° C.
    8. Escolha as colônias e verificar se eles abrigam pCAR1 por PCR com primers específicos para o plasmídeo.
  3. Confirmar a transferabilidade dos Plasmideos marcados e preparar os doadores para as próximas etapas
    Nota: O objetivo do presente protocolo é confirmar a possibilidade de transferência dos Plasmideos construídos acima e preparar os doadores para as próximas etapas.
    1. Crescer uma cultura O/N de resinovorans p. CA10dm4RG, abrigando pBP136::gfp ou pCAR1::gfp em LB esterilizado contendo Km e uma cultura de p. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, Laureano q, no qual PA1/O4/O3-gfpmut3* não é expresso por causa de seu cromossômica Laureanoq gene]21 em 3 mL de LB contendo Tc (200 rpm, 30 ° C).
    2. Após a colheita e lavagem das células como na etapa 1.1.2, usá-los para filtro de acasalamento (O/N, 30 ° C) como na etapa 1.1.3.
    3. Coloque o filtro em um tubo de plástico estéril 50 mL e ressuspender com 1 mL de PBS estéril. Dilua a mistura ressuspensa com PBS estéril (101– 105-Dobre), espalhe a mistura diluída em estéril seletiva LB + Tc + Km placas.
    4. Escolha as colônias e verificar se eles abrigam cada um dos Plasmideos por PCR com primers específicos.
      Nota: Confirmação da posição de inserção do mini-Tn5 por sequenciamento direto após a extração do plasmídeo é opcional, para confirmar que a inserção não afeta a função de transferência dos Plasmideos.

2. cálculo da frequência de conjugação pelo método MPN

  1. Prepare-se estéril LB Km LB + e Gm placas.
  2. Crescer uma cultura O/N, de p. putida SMDBS abrigando pBP136::gfp ou pCAR1::gfp em 3 mL de LB esterilizado contendo Km e uma cultura de p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) em 3 mL de LB contendo Gm (140 rpm, 30 ° C).
  3. Após a colheita e lavagem das células como na etapa 1.1.2, usá-los para filtro de acasalamento a 30 ° C, durante 45 min como na etapa 1.1.3.
  4. Serialmente diluída o dador e o receptor acima da cultura (1 – 10 107) e espalhá-lo em LB + Km (doador) ou LB + Gm (destinatário) placas (cada um em triplicado) para contar as unidades (CFU) formadoras. Incube as placas a 30 ° C para d 2.
  5. Ressuspender a mistura sobre o filtro em LB esterilizado contendo Km e Gm e diluir em série (de 2 a1 a 224– 107.2) usando uma placa de cultura de células 96 poços (em quadriplicado).
  6. Incube a placa de 96 poços para o momento adequado (2 d a 30 ° C).
  7. Contar o CFU do doador e do destinatário nas placas (passo 2.4.) e contar o número de poços em que o transconjugants crescer.
  8. Calcule o MPN e o seu desvio usando o MPN programa de cálculo desenvolvido por Jarvis et al. 22, que está disponível em http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Digite o nome do experimento (ex., 'teste'), a data do experimento (ex., 2018/4/9), o número de série de testes e o max. Não. de diluições (digite '24') na folha de linha #7 do 'Programa' do Excel arquivo ('MPN_ver5.xls').
    2. Digite ' 2-1 (= 0,5) para 2-24 (= 5,96 × 10-8)' na coluna 'factor de diluição d', '0,01' na coluna 'volume em ml ou g w'e 4' em ' n. de tubos n' nas tabelas automaticamente produzidas 'dados de entrada'.
    3. Digite o número de poços em que o transconjugants crescer a cada diluição da amostra (0-4).
    4. O botão superior direito 'Calcular resultados' e em seguida, obter os resultados (MPN/μL) e seus limites de confiança de 95% (superiores e inferiores).
  9. Calcule a frequência de conjugação das plasmídeos dividindo o número de transconjugants (NMP/mL) pelos números de doador e receptor células (UFC/mL).

3. preparação para a estimativa da probabilidade da conjugação iniciadas pelo doador

  1. Crescer uma cultura O/N, de p. putida SMDBS abrigando pBP136::gfp ou pCAR1::gfp em 3 mL de LB esterilizado contendo Km e uma cultura de p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) em 3 mL de LB esterilizado contendo Gm usando 300 mL garrafas térmicas (140 rpm, 30 ° C) como precultures.
  2. Transferir 200 μL do preculture em 200 mL de fresco LB esterilizado contendo Km ou Gm em frascos de 500 mL e incubar a 30 ° C, com agitação a 140 rpm.
  3. Medir a turbidez em 600 nm (OD600) da cultura usando um espectrofotômetro UV-VIS e o local da cultura, diluído em LB (de1– 10 108-dobre diluições), para um prato LB contendo Km ou GM. incubar estes LB placas a 30 ° C, durante 1-2 d e determinar o UFC.
  4. Plote os valores de600 OD e o UFC com o tempo de crescimento para gerar as curvas de crescimento do doador e receptor.
  5. Cresce culturas da cepa dador e do receptor para log de meio da fase, com base na curva de crescimento.
  6. Após a colheita e lavagem das células, prepare 101– 103 UFC do doador em 10 μL de LB e 105– 107 UFC do destinatário em 100 μL de LB.
  7. Mix 10 μL do dador e 100 μL das culturas em diferentes densidades em placas de 96 poços (em triplicado) destinatários. Por exemplo, misturar 101 CFU do dador e 105 CFU do destinatário e adicioná-lo para cada um dos 96 poços e misturar 101 CFU do dador e 106 CFU do destinatário em outra placa de 96 poços, e assim por diante.
  8. Incubar a mistura a 30 ° C, durante 45 min e em seguida, adicione a cada poço para inibir ainda mais a conjugação altas concentrações de antibióticos (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm).
  9. Incube a placa a 30 ° C para d 2.
  10. Conte o número de poços em que transconjugants crescer.
  11. Escolha a destinatário densidade adequada para a estimativa da probabilidade da conjugação iniciada pelo doador, baseada nos dados acima (transconjugants deve ser encontrado pelo menos 1 bem de uma placa de 96 poços).
    Nota: Transconjugants irá crescer em todos os poços, quando as densidades das células do dador e do receptor são elevadas e mais do que uma conjugação ocorre em um poço. Em contraste, sem transconjugants se encontrarão em qualquer poços quando a densidade celular é muito baixa. Na seção a seguir, uma célula único doador é classificada em um poço. Portanto, a densidade de destinatário deve ser no máximo.

4. estimativa da probabilidade da conjugação iniciadas pelo doador

  1. Preparar 200 mL de uma cultura de fase log de meados de doador p. putida SMDBS abrigando pBP136::gfp ou pCAR1::gfp e a do destinatário p. putida KT2440RGD, conforme descrito em 3.6 – 3.7.
  2. 10 lugar6 CFU do destinatário em 100 μL de LB em cada poço de uma placa de 96 poços.
  3. Configure o sistema de FACS (fluxo cytometry e célula classificador com um braço robótico, um laser de argônio 488 nm e um orifício do bocal de 70 μm). Conjunto de dispersão para a frente (FSC), com um limite de 1% como o gatilho de aquisição. Ajustar o ganho de H e um ganho de FSC e dispersão lateral (SSC) em sensibilidade máxima, que pode excluir sinais falsos positivos, usando o PBS como controlo negativo. Defina a porta tipo baseada no modo de classificação de queda de 0,5 para pureza máxima classificação e SSC e FSC.
  4. Tipo um celular único doador por FACS sobre uma placa LB (384 pontos diferentes), incubar a placa a 30 ° C por 2 d e, depois, contar quantas colônias aparecem na placa das células classificadas.
    Nota: Este procedimento é para validação do conjunto portão. Se existem 384 colônias na placa, isso significa que 100% das células classificadas poderia formar colônias. A validade média da classificação sempre é 90 a 95%.
  5. Tipo um celular único doador por FACS em cada poço de uma placa de 96 poços com o destinatário (4.2).
  6. Incubar a placa por 45 min a 30 ° C e em seguida, adicione a cada poço de evitar a conjugação altas concentrações de antibióticos (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm).
  7. Incube a placa a 30 ° C para d 2.
  8. Contar o número de poços em que transconjugants cresceu como determinado pela inspeção visual a olho nu.
  9. Calcule a probabilidade de conjugação iniciada pelo doador, dividindo o número de poços com transconjugants pelo número total de poços em que o doador foi classificado.

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Resultados

Comparação da frequência de conjugação pelo método MPN

No nosso relatório anterior, comparamos as frequências de conjugação de pBP136::gfp e pCAR1::gfp em diluído meio LB (1/3 LB) de líquido de triplo com diferentes taxas de agitação após um acasalamento de 45 min usando girador de 125 mL frascos10. Comparamos as frequências de conjugação de pBP136::gfp e pCAR1::gfp com 10...

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Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo de alta resolução para detectar diferenças na frequência de conjugação em condições diferentes, usando um método do MPN para estimar o número de transconjugants. Um passo importante no protocolo é diluir a mistura do doador e do receptor após o acasalamento até crescer sem transconjugants. Outro passo é adicionar altas concentrações de antibióticos para o meio líquido seletivo para evitar a conjugação. Estes procedimentos podem reduzir o fundo causado por conjugação mais no meio seletivo. ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos o Dr. K. Kamachi do Instituto Nacional de doenças infecciosas (Japão) para fornecer pBP136 e Prof. Dr. H. Nojiri, da Universidade de Tóquio (Japão) para a prestação de pCAR1. Nós também estamos gratos ao Professor Dr. Molin Sølen da Universidade Técnica da Dinamarca para a prestação de pJBA28. Este trabalho foi apoiado pela JSPS KAKENHI (Grant Numbers 15H 05618 e 15KK0278) para MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600Solução de bainha
Fluorospheres (10 μ m)Beckman-Coulter6605359grânulos para montar a
incubadoraYamato Scientific Co. Ltd211197-IC802
UV-VIS Espectrofotômetro UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
placas de 96 poçosNIPPON Genetics Co, LtdTR5003
placa de Petri tipomicroplaca AXEL1-9668-01para validação de classificação
filtro de membranaADVANTECC045A025Ade acoplamento de filtro
Nichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0,5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ L
pipetas multicanalNichiryo CO. Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5-10 μ L, 20-200 μ L
TriptonaBD Difco211705
Extrato de leveduraBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
ÁgarNakarai tesque01162-15
rifampicinaWako185-01003
gentamicinaWako077-02974
canamicinaWako115-00342
placa de PetriAXEL3-1491-51JPND90-15
microtubosFukaekasei131-815C
500 mL frasco giratório descartávelCorningCLS3578
FACS para pipetas

Referências

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