Uma abordagem de mutagénese romance saturação: Caracterização de única etapa de proteína reguladora vinculação Sites no RNA usando fosforotioatos

Resumo

Proteínas que se ligam a sequências específicas de RNA desempenham um papel crítico na expressão do gene. Caracterização detalhada destes sítios de ligação é fundamental para nossa compreensão da regulação genética. Aqui, uma abordagem passo a passo para mutagénese saturação de proteína ligadora de sites no RNA é descrita. Esta abordagem é relevante para todos os sites de proteína ligadora de RNA.

Resumo

Regulação genética desempenha um papel importante no desenvolvimento. Inúmeras proteínas do DNA e RNA-vinculação vincular suas sequências alvo com alta especificidade para controlar a expressão gênica. Estas proteínas reguladoras controlam a expressão gênica a nível de DNA (transcrição) ou no nível do RNA (pre-mRNA emendar, poliadenilação, transporte do mRNA, decadência e tradução). Identificação de sequências reguladoras ajuda a entender não só como um gene é ligado ou desligado, mas também que a jusante genes são regulados por uma determinada proteína reguladora. Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.

Introdução

Regulação genética desempenha um papel importante na biologia. Os genes podem ser regulados ao nível da transcrição de emenda pre-mRNA, 3' final formação, exportação de RNA, tradução, localização de mRNA, decadência, modificação borne-translational/estabilidade, etc. ambos DNA e RNA-proteínas desempenham um papel chave no gene Regulamento. Enquanto as análises de genéticas moleculares identificaram inúmeras proteínas reguladoras, apenas um pequeno subconjunto deles foram caracterizados inteiramente para suas funções celulares ou vinculação sites em vivo. Mutagênese e análise filogenética sequência oferecem abordagens complementares para caracterizar as interações de DNA ou RNA-proteína.

RNA-proteínas são importantes em processos de desenvolvimento, incluindo a diferenciação sexual. A proteína de Drosophila sexo-letal (SXL) ou a proteína do sexo-interruptor geral está ausente em machos, mas presente nas fêmeas. Ele reconhece sequências de uridina-rico ou pirimidina-terras adjacentes aos locais específicos da tala em alvos a jusante pre-mRNA (transformador, sexo-letale lethal2 macho-específico) em células somáticas^{1,2 ,3,4}. Além disso, regula o sítio de poliadenilação comutação por ligação a sequências de potenciador uridina-ricos poliadenilação na transcrição potenciador de rudimentar (e(r))^5,6. SXL provável regula alvos adicionais no germline feminino continuam a ser identificado^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

Normalmente, a caracterização de um sítio de ligação envolve mutagênese, por exemplo, por exclusão ou substituição de um ou vários nucleotídeos. Cada sítio de ligação de mutantes, em relação a sequência de RNA do tipo selvagem, então é analisado usando uma série de concentrações de proteína para determinar sua afinidade de ligação (dissociaçãoK_d ou equilíbrio constante) da proteína de interesse; K_d é a concentração de proteína necessária para obter a ligação de RNA de 50%. Este processo trabalhoso de mutagénese detalhada envolve geração e análise de mutantes numerosos — três nucleotídeos de tipo não-selvagem para cada posição no sítio de ligação. Assim, há uma necessidade de uma abordagem alternativa para mutagénese mais rápido, mais simples e barato de saturação dos sítios de ligação da proteína no ARN.

Aqui, descrevemos uma abordagem de uma etapa que permite mutagênese de saturação de um sítio de ligação da proteína no ARN. Trata-se modelo de DNA com não-selvagem-tipo nucleotídeos dentro do site de ligação, síntese de RNAs separados com cada nucleotídeo phosphorothioate e isolamento da fração ligada após incubação com proteína de doping. Interferência de nucleotídeos do selvagem-tipo não resulta em sua exclusão preferencial da fracção ligados a proteína. Isto é monitorado por eletroforese em gel de clivagem química seletiva com iodo de ligações fosfodiéster contendo fosforotioatos (phosphorothioate mutagênese ou PTM) a seguir. Esta abordagem de mutagênese de etapa única de saturação é aplicável para a caracterização de qualquer sítio de ligação da proteína no ARN.

Protocolo

Nota: Figura 1 fornece uma visão geral de phosphorothioate mutagênese e resume as principais etapas do processo.

1. geração de uma biblioteca de mutantes — modelo de DNA com não-selvagem tipo nucleotídeos de Doping

1. Sintetizar T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') por síntese química em um sintetizador de DNA.
2. Sintetiza um dopado do oligonucleotide (cadeia complementar) por síntese química em um sintetizador de DNA correspondente para o sítio de ligação da proteína. Use uma mistura adequada de phosphoramidites durante a síntese química para cada site de dopagem (X abaixo) com uma proporção de 90% A como o nucleotídeo do selvagem-tipo e 10% T como o nucleotídeo do tipo não-selvagem (veja resultados representativos para mais pormenores sobre esta relação).
   Nota: Aqui, a sequência do dopado do oligonucleotide é 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. A sequência de sublinhado é o complemento reverso do sítio de ligação de proteínas SXL, além de nucleotídeos adicionais fora do sítio de ligação que fornecem controles úteis confirmando que nem toda mudança no ARN afeta vinculativas, bem como sendo controles de carregamento para comparação e normalização de nucleotídeos dentro do sítio de ligação. A sequência do local SXL-ligação UUUUUGUUGUUUUUUUU, que está presente no transformador pre-mRNA^14,15,16,17, foi usada para elaborar a metodologia proposta. A sequência em itálico é complementar à sequência da primeira demão de T7 e o promotor T7 para transcrição em vitro .

2. síntese de RNA

1. Sintetiza RNA em uma reação de transcrição de 20 µ l, como descrito anteriormente,¹⁸.
   1. Buffer de transcrição Mix T7 e oligonucleotide de T7 1 µM, 1 µM dopado do oligonucleotide, 10mm ditiotreitol (DTT), 2mm GTP, 1mm cada ATP, CTP e UTP (guanosina, adenosina, citidina e uridina trifosfato) e 2 U / µ l T7 ARN-polimerase.
   2. Adicionar, em dois tubos separados microcentrifuga, 0,167 mM α-thio ATP ou 0,05 mM α-thio UTP para incorporar RNAs fosforotioatos (ver esquema na Figura 2).
      Nota: Para protocolos alternativos, adicione 0,2 mM α-thio CTP ou 0,2 mM α-thio GTP para uma reação apropriada transcrição contendo um dopado do oligonucleotide para testar os dois restantes substituições de nucleotídeos.
   3. Incubar a mistura de reação de síntese de RNA durante 2 h a 37 ° C.
2. Adicione 2,5 µ l calor-labile da fosfatase alcalina e buffer de 10xphosphatase 2,5 µ l da amostra de RNA. Incube a esta reação µ l 25 por 10 a 30 min a 37 ° C para remover 5' fosfatos.
3. Inativar a enzima fosfatase alcalina por aquecimento a 80 ° C, durante 2-5 min.
4. Radiolabel a extremidade 5' do RNA dephosphorylated (pmole 5) usando 1 quinase de polinucleotido µ l T4 e 1 µ l γ -³²P ATP em um volume de reação de 10 µ l. Incubar a mistura de reação para 30 a 60 min a 37 ° C.
5. Inativar a enzima de quinase de polinucleotido T4 por aquecimento a 65 ° C, durante 20 a 30 min.
6. Gel de purificar o RNA por eletroforese em um gel de poliacrilamida de desnaturação de 10%. Localize o RNA em gel por autoradiografia. Impostos especiais de consumo a fatia de gel contendo RNA radiolabeled, esmagar em um tubo de microcentrifuga pressionando contra as paredes com uma ponta de pipeta e mergulhe no buffer de proteinase K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 12,5 mM EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de sódio Dodecil sulfato). Gire o tubo à temperatura de 2 h durante a noite.
7. Centrifugue o gel de chorume, descartar o gel e recolher a solução-tampão.
8. Extrair a solução duas vezes com igual volume de fenol-clorofórmio e uma vez com clorofórmio e recolher a fase aquosa.
9. Adicionar o volume da fase aquosa 0,1 de 3M de acetato de sódio, pH 5.2, transportadora tRNA ou glicogênio e 2.5 volume de etanol. Manter a amostra a-80 ° C durante 1 h.
10. Centrifugar a amostra para 5 a 10 min em alta velocidade microcentrifuga a 16.873 x g. Remova cuidadosamente a solução tampão/etanol sem perturbar a pelota do RNA.
11. Lave o pellet com 70% de etanol e centrifugar para etanol de 2 – 5 min. Retire com cuidado. Seque a pelota no ar.
12. Resuspenda o pellet em 20 – 50 µ l pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-água tratada. Armazenar a-20 ° C até o uso.
    Nota: Execute todas as etapas com RNA radiolabeled usando as precauções apropriadas e um escudo de acrílico para proteger de radioatividade. Atualmente, colunas de rotação são mais comumente usada e mais conveniente para remover radioatividade sem personalidade jurídica, como uma alternativa ao gel de purificação do RNA.

3. proteína de ligação de reação e separação do RNA ligado

1. Expressar a proteína recombinante em e purificar de e. coli.
2. Estimar a concentração de proteína recombinante por espectrofotometria ou separando-se em um gel de SDS-poliacrilamida ao lado de uma proteína conhecida padrão, bovina albumina (BSA). Visualize a proteína de interesse e a BSA padrão manchando o gel com azul de Coomassie brilhante R-250. Dose as proteínas em comparação com quantidades conhecidas de diluições de BSA no mesmo gel.
   Nota: Guarde a proteína recombinante no - 80 ° C até o uso e a diluir em 20 mM 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-ácido etanesulfónico (HEPES), pH 8.0, 1mm ditiotreitol (DTT), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,05% de 0.2 mM NP-40, 20% de glicerol. Uso de 0,5 m a 1,0 fluoreto de sulfonila de phenylmethane para inibidor de protease mM (PMSF) é opcional.
3. Realizar a reação de RNA-obrigatórias (20 – 100 µ l) em 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 milímetro DTT, 50 mM KCl, inibidor de RNase 0,5 unidades / µ l, 0,09 µ g / µ l acetilado albumina de soro bovino, 1 mM EDTA, 0,15 µ g / µ l tRNA, 5'-final radiolabeled RNA e 6 µ l de concentração adequada (uma concentração na qual ~ 50% do RNA liga-se à proteína) da proteína.
   Nota: Este tampão de ligação funciona para três proteínas RNA-obrigatórias (SXL, U2AF,⁶⁵e PTB), mas deve ser padronizado para uma proteína de interesse. Estimar a concentração de proteína empiricamente, utilizando várias diluições para uma preparação de determinada proteína, que é necessário para obter cerca de 50% a ligação de RNA. Esta condição ou K_d representa a parte mais sensível da curva de RNA-obrigatórias.
4. Incube a reação de ligação de proteínas por 20 a 30 min a 25 ° C (ou no gelo).
5. Separe a fração de RNA proteínas da fracção não acoplada usando uma das duas abordagens:
   1. Ligação do filtro de nitrocelulose
      1. Aplicam-se a reação de ligação (20 – 100 µ l) em um filtro de nitrocelulose, conectado a um distribuidor de vácuo à temperatura ambiente.
         Nota: Apenas o complexo RNA-proteína é retido no filtro e desacoplado RNA flui através do filtro. A abordagem de ligação do filtro permite maior recuperação do RNA ligado e é mais rápido e mais simples, comparado com o ensaio de turno de mobilidade de gel. Também é possível coletar a fração de RNA não acoplada ou livre de RNA para comparação com a fração ligada pela colocação de uma membrana DEAE debaixo do filtro de nitrocelulose.
      2. Cortar a parte do filtro de nitrocelulose contendo o retido RNA radioativo em pedaços menores para caber em um tubo de microcentrifugadora, mergulhe no buffer suficiente de PK (300-500 µ l contendo 10 – 20 µ g PK) imergir as peças do filtro e eluir RNA do filtro para 2-3 h ou durante a noite.
      3. Extraia com fenol-clorofórmio, clorofórmio e recolher a fase aquosa. Adicionar etanol e acetato de sódio e, após incubação no freezer, centrífuga, lavar, secar e resuspenda o RNA em água tratada DEPC. Siga estas etapas conforme detalhado nas etapas 2.10 para 2.14 acima.
   2. Turno de mobilidade de gel
      1. Preparar e polimerizar-se um gel de polyacrylamide nativo de 5% (60:1 Acrylamide:bis-acrilamida) em 0,5 x TBE (tampão Tris-borato-EDTA-padrão) antes de iniciar a reação de ligação, como uma alternativa para o método de ligação do filtro.
      2. Pre-funcione o gel durante 15 min em 250 V em um quarto frio (4 ° C).
      3. Carrega cada reação de ligação (acima) em poços separados do gel pré-execução acima.
         Nota: O buffer de armazenamento de proteínas fornece glicerol suficiente para carregamento de amostra em poços.
      4. Separe o proteínas RNA por eletroforese em gel em uma sala fria a 250 V para 1 a 2 h, dependendo do tamanho de RNA e proteínas específicas.
      5. Localize a posição do complexo RNA-proteína em gel por autoradiografia. Impostos especiais de consumo a fatia de gel contendo o complexo RNA-proteína. Eluir o RNA da fatia gel esmagando a fatia de gel e imersão no buffer de PK.
      6. Extraia com fenol-clorofórmio, clorofórmio e recolher a fase aquosa. adicionar etanol e acetato de sódio e, após incubação no freezer, centrífuga, lavar, ar seco e ressuspender o RNA em água tratada DEPC. Siga estas etapas conforme detalhado nas etapas 2.10 para 2.14 acima.

4. análise de iodo-clivada Phosphorothioate produtos para detecção de posições do Nucleotide mutante

1. Adicionar iodo de 1 mM em um 20 µ l água tratada com DEPC contendo até 10 µ g transportadora tRNA para clivar RNAs (RNAs acoplados e totais) aos sítios de phosphorothioate incorporação. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
   Nota: Maiores detalhes no decote de iodo com condições ligeiramente diferentes — iodoethanol de 7% (v/v), aquecimento a 95 ° C por 3 min — podem ser encontradas em Gish & Eckstein 1988¹⁹.
2. Precipitar o RNA clivado pela adição de acetato de sódio (etanol), conforme descrito acima. Resuspenda em uma tintura de carregamento para géis de desnaturação. Aqueça e carregar a amostra para separar fragmentos de RNA por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturação 15 – 20%.
3. Expor o gel de poliacrilamida, para um filme de raio-x.
4. Detecta bandas na fração vinculada versus pool total usando autoradiografia.
   Nota: Execute todas as etapas com iodo no aspirante. Para a separação de RNA mostrada aqui, é empregado um gel em forma de cunha, que é conseguida dobrando a espessura dos dois espaçadores na parte inferior das placas de gel, inserindo um espaçador extra polegadas de comprimento na parte inferior do gel. Esta forma permite mais espaçamento uniforme ou mais estreita entre fragmentos de RNA mais curtos. Alternativamente, um phosphorimager pode ser usado em vez de filmes de raio-x para detecção e quantificação de radioactividade.

Resultados

Princípio de mutagénese saturação utilizando dopagem:

Para uma adequada relação molar do selvagem-tipo e outros nucleotídeos, use uma mistura igual de todos os quatro nucleotídeos se houver apenas uma posição para ser analisado. No entanto, se várias posições são analisadas simultaneamente, a relação de não-selvagem tipo de nucleotídeos do selvagem-tipo deve ser ajustada, ou seja, reduzido. Caso contrário, além de simples ...

Discussão

Mutagênese tem sido muito utilizado para caracterizar os locais obrigatórios de proteína. Em primeiro lugar, uma série de mutantes pode ser construída e testada individualmente em ensaios para analisar seus efeitos sobre a vinculação afinidade de ligação. Enquanto uma abordagem padrão mutagênese oferece uma forma de analisar várias sequências, várias etapas envolvidas na abordagem padrão, tais como construção de mutantes e realizando uma série de reações para cada mutante de binding, é trabalhoso e demorado e não podem p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Uridina 5' a-tiotrifosfato	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosina 5' a-tiotrifosfato	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Coletor de vácuo	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  25  mm Filtro de vácuo de microanálise de vidro
Coletor de vácuo	Millipore	XX2702552	1225 Coletor de vácuo de amostragem
Nitrocelulose	Millipore	HAWP
Nitrocelulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
Kit de Desfosforilação	NEB	M0508
T4 Polinucleotídeo Quinase	NEB	M0201S
Proteinase K	NEB	P8107S
T7 RNA Polimerase	NEB	M0251S
RNasin	Promega		Inibidor de RNase
Placas	de	Padrão Padrão
Equipamento de eletroforese	em gel Padrão Padrão
Filmes de raios-X	Padrão	Padrão
Soluções de gel de poliacrilamida	Padrão	Padrão