Artigo de método

O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

DOI:

10.3791/57819

⸱

29 de junho de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui descrevemos o método conjunto de réplicas, uma abordagem quantitativamente medida de expectativa de vida/sobrevivência de c. elegans e healthspan de forma robusta e de alta produtividade, permitindo assim a seleção de muitas condições sem sacrificar a qualidade dos dados. Este protocolo detalha a estratégia e fornece uma ferramenta de software para análise de dados do conjunto de réplicas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método de conjunto de réplicas é uma abordagem para medir quantitativamente a expectativa de vida ou sobrevivência de nemátodos Caenorhabditis elegans em uma maneira de alta produtividade, permitindo assim um único investigador para a tela mais tratamentos ou condições sobre a mesma quantidade de tempo sem perda de qualidade de dados. O método requer equipamento comum encontrado na maioria dos laboratórios que trabalham com c. elegans e, portanto, é simples para adotar. A abordagem centra-se na análise de amostras independentes de uma população em cada ponto de observação, em vez de uma única amostra ao longo do tempo como com métodos tradicionais longitudinais. Marcando implica a adição de líquido para os poços de uma placa multi bem, que estimula a c. elegans para mover e facilita a quantificação de alterações em healthspan. Outros benefícios principais do conjunto de réplicas método incluem menor exposição das superfícies de ágar de contaminantes no ar (por exemplo, mofo ou fungos), mínimo de manipulação dos animais e robustez para mis marcando esporádicas (como chamar um animal morto, quando ainda é vivo). Apropriadamente, analisar e visualizar os dados de uma experiência de estilo de conjunto de réplicas, uma ferramenta de software personalizado também foi desenvolvida. Recursos atuais do software incluem plotagem de curvas de sobrevivência para tanto conjunto de réplicas e tradicional (Kaplan-Meier) experiências, bem como a análise estatística para o conjunto de réplicas. Os protocolos fornecidos aqui descrevem a tradicional abordagem experimental e o método de conjunto de réplicas, bem como uma visão geral da análise de dados correspondente.

Introdução

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Um dos avanços tecnológicos mais transformadoras para a compreensão da base genética do envelhecimento foi o desenvolvimento de RNAi alimentação baseada em c. elegans1; antes da utilização experimental de RNAi, muitos fenótipos de envelhecimento não eram geneticamente tractable. RNAi baseada em alimentação é conseguida através da produção de dsRNA dentro Escherichia coli que corresponde a um endógeno mRNA de c. elegans : IPTG induz transcrição bidirecional através de uma inserção do cDNA de c. elegans ou ou uma porção de um frame de leitura aberto dentro de um plasmídeo2. Quando c. elegans alimentam-se intacta dsRNA Escherichia coli, produzido por bactérias é transportado do lúmen intestinal células através de de proteínas transmembranares o SID-23e então distribuído pelo resto do animal através de de SID-14. Dentro de cada célula, dsRNA exógeno é processado pelo complexo a Dicer em siRNA, que interagem com um mRNA maduro através do emparelhamento base complementar para criar um novo duplex siRNA-mRNA. Este duplex é reconhecido pelo complexo RISC e clivada, desse modo degradante o mRNA endógeno5. Assim, alterando apenas a inserção do plasmídeo, um pode desativar a função de quase qualquer gene dentro do genoma de c. elegans . Esta descoberta levada à criação de vários grandes baseada em alimentação RNAi bibliotecas-coleções de transformaram ações de Escherichia coli que podem ser combinadas para atingir a cobertura de aproximadamente 86% do conhecido c. elegans genes6, 7.

Desde o avanço de RNAi baseada em alimentação, telas abrangentes em c. elegans conduziram à descoberta de mais de 900 genes que alteram a expectativa de vida quando inativado (como evidenciado pelas associações de RNAi-fenótipo curadas em WormBase), que se referem a como gerogenes. Um papel para a maioria dos gerogenes no controle da longevidade foi descoberto através de RNAi alimentação baseada em poucos relatórios seminais (veja figura 1A e suplementar 1 arquivo para detalhes). Em alguns casos, estes gerogenes foram identificadas com base em medir a viabilidade em um único ou alguns pontos de tempo, que não constituiu uma medida quantificável da mudança de expectativa de vida com o tratamento de RNAi. Em outros casos, estes genes foram avaliados quantitativamente para mudanças na expectativa de vida, bem como adicionais fenótipos associados a idade. Por exemplo, identificamos anteriormente 159 genes que eram necessários para o normal e maior expectativa de vida dos animais, com a diminuição da sinalização da insulina/IGF-1 e quantificar alterações em healthspan. Destes, 103 inactivations gene resultam em um fenótipo de nanismo, como perda resultou em um ou mais sinais de envelhecimento prematuro8.

Enquanto alguns gerogenes têm sido associados com 100 ou mais estudos (por exemplo, o daf-16, daf-2, senhor-2.1), mais de 400 gerogenes tem citações de 10 ou menos (figura 1Be 2 de arquivo suplementar). Assim, enquanto abrangente baseado em alimentação RNAi telas têm descoberto e caracterizado superficialmente centenas de gerogenes putativo, como estes função de genes no controle de longevidade e as inter-relações genéticas entre estes produtos de genes permanecem mal estudou. Análise completa longitudinal para fenótipos associados a idade é um pré-requisito para a identificação genéticas interações entre gerogenes (por exemplo, as interações epistatic, asynthetic interações, etc.). Ganhar mais profundo insight sobre as genética das inter-relações entre gerogenes requer um método quantitativo de alto rendimento, que também aproveita as vantagens de RNAi baseada em alimentação.

A medida mais comum de substituto do envelhecimento é a expectativa de vida. A abordagem tradicional para medir a mortalidade de c. elegans rastreia as mortes de animais individuais ao longo do tempo dentro de uma amostra pequena da população. Um número relativamente pequeno de animais é seguido ao longo do tempo e periodicamente é estimulado suavemente com um fio de platina ou Pestana, com o movimento como um indicador de viabilidade (Figura 2A). Este método foi amplamente utilizado, pois fornece medições simples, diretas da média e a longevidade máxima. No entanto, esse método tradicional é demorado e relativamente baixa taxa de transferência, que limita o número de animais e as condições que podem ser medidas simultaneamente de forma controlada. Um recente estudo de simulação encontrou que muitos estudos de vida útil de c. elegans não ensaiar um número grande o suficiente de animais para ser capaz de detectar confiavelmente pequenas alterações entre as condições9. Além disso, esse método tradicional envolve manipulação repetidamente a mesma coorte de animais ao longo do tempo, que por sua vez pode apresentar contaminação e pode danificar ou matar animais cada vez mais frágil, envelhecidos.

Nós desenvolvemos uma metodologia alternativa "conjunto de réplicas" para medir o tempo de vida de c. elegans . Para este efeito, uma grande população de animais de idade-sincronizado, isogénicas são divididas em um número de pequenas populações (ou réplicas). Suficiente amostras de réplica são geradas para cobrir cada ponto de tempo no experimento planejado. Em cada ponto de tempo de observação, uma das réplicas é marcou para o número de mortos vivos e animais censurados e, em seguida, os animais dentro que replicar são descartados. Assim, acabou a vida útil esperada da população como um todo, uma série de subpopulações independentes são periodicamente amostrados (Figura 2B). Usando conjuntos de réplica não há nenhum estímulo repetidas de animais e não há exposição repetida a potencial contaminação ambiental. A viabilidade observada no único ponto é completamente independente de todas as outra observação, o que minimiza o manuseio e aumenta a taxa de transferência pelo menos uma ordem de magnitude. Isto permitiu-nos dosar alterações na expectativa de vida para centenas de RNAi clones simultaneamente8,10.

Aqui nós apresentamos protocolos detalhados para a realização de expectativa de vida de c. elegans via tanto o conjunto de réplicas e métodos tradicionais para pontuar a longevidade de c. elegans . Vamos demonstrar que resultados semelhantes são obtidos entre os métodos. Nós temos o software desenvolvido para auxiliar na análise gráfica dos dados de expectativa de vida gerados através de qualquer abordagem, que fornecemos gratuitamente sob a licença GPL V3 (ver tabela de materiais). "WormLife" escrito em R11e inclui uma interface de usuário gráfica (GUI) para plotagem de dados, que foi testados no Mac OS e Linux. Por último, podemos comparar e contrastar as limitações de cada método e destacar outras considerações ao escolher entre abordagens para medir as mudanças quantitativas na expectativa de vida de c. elegans .

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Protocolo

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1. tradicional método para a longevidade de c. elegans de Pontuação

  1. Preparação dos reagentes
    1. Identifica genes para ser inativado via RNAi baseada em alimentação. Existências de compra transformada de HT115 Escherichia coli2 contendo o RNAi clonagem de interesse. Alternativamente, subclone do cDNA do gene de interesse no site multicloning do L4440 do plasmídeo.
      Nota: HT115 é uma cepa de RNase III-deficientes Escherichia coli com atividade do polymerase T7 IPTG-inducible, que é usada para prevenir a degradação do dsRNA dentro as bactérias. Para estudos de vida útil que não usam RNAi baseada em alimentação, HT115 ou OP50 Escherichia coli em placas NGM padrão pode ser usado.
    2. Prepare-se cm 6 3 – 6 (ou mais) placas de RNAi por condição de teste (suplementar 3 arquivo para receita). Armazene as placas de RNAi a 4 ° C antes da semeadura com bactérias por até diversos meses.
    3. Cresce transformado Escherichia coli durante a noite (16 – 20 h, 37 ° C, agitando a incubadora a 180 – 220 RPM).
      Nota: HT115 e. coli é cultivada em LB com ampicilina (50 mg/mL). Padrão OP50 Escherichia coli não é resistente aos antibióticos e é cultivado sem a ampicilina. Volume de cultura varia de acordo com o n º de placas, mas normalmente entre 8 e 100 mL de LB, dependendo do projeto experimental.
      1. Concentre-se bactérias por centrifugação a 3.000 x g durante 15 – 20 min em uma centrífuga de bancada. Aspire o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1/10 o volume inicial (ou seja, 10 x) em LB com ampicilina para HT115 (ou sem ampicilina para OP50 padrão).
      2. Alíquota 200 µ l de concentrado 10 bactérias x para cada placa de 6 cm. Prepare-se 3-4 repetições por condição de teste, com 2 placas backup extra, para ser usado em caso de contaminação. Ao preparar pratos, classificá-los assim que o experimentador marcando o ensaio é cego para as condições experimentais, usando um código de cores ou esquema de codificação de semelhante. Certifique-se de que o código é gravado.
      3. Deixe abertas chapas secar em um ambiente limpo, como um banco do fluxo laminar até todo o líquido foi absorvido ou permitir placas cobertas secar no banco durante a noite. Placas de monitor durante a secagem, para garantir que o agar é seco, sem ressecamento.
        Nota: Ressecamento as placas conduz à fissuração do que fará com que o c. elegans que escavam o agar agar. Molhado que as superfícies de ágar também promovem a escoar-se.
    4. Armazene as placas secas dentro de uma caixa de worm durante a noite (até 24 h) à temperatura ambiente para permitir que a indução da produção de dsRNA. Depois de 1 dia de RT, armazene placas a 4 ° C por até 2 semanas em um saco zip-lock selado (para evitar que as placas de secar). Antes do uso, entregue chapas à temperatura dentro do saco zip-lock para impedir a condensação de introduzir contaminantes de fungos no ar.
  2. Sincronização de c. elegans com tratamento de hipoclorito
    Nota: Consulte suplementar 3 arquivo para receitas de solução M9 e hipoclorito.
    1. Recolha animais adultos gravid com M9. Use uma pipeta de vidro conectado para mover para tubos de 2 x 15 mL.
    2. Gire os tubos para 30"~ 2.000 rpm. Verifique se há uma piscina de nematoides na parte inferior do tubo. Aspire o sobrenadante. Lave duas vezes com solução M9, repetindo a rotação e aspiração.
    3. Re-suspender c. elegans em 4 mL de M9. Adicione 2 mL de solução de hipoclorito. Imediatamente o vórtice para ~ 3 min, com agitação vigorosa periódica. Depois de 3 min, procure por uma nuvem de ovos sob um microscópio de dissecação. Vórtice, um adicional de 10 – 20 s se ovos não foram liberados após 3 min.
      Nota: Timing do tratamento de hipoclorito é essencial. Ovos dentro os gravid adultos são o que sobreviver tratamento. Depois de ~ 3 min abrir os adultos gravid e derramam os ovos. No entanto, se os ovos estão em solução de hipoclorito muito tempo após o lançamento eles morrerão. Por outro lado, se gravid adultos não são deixados em solução de hipoclorito tempo suficiente, sem ovos serão lançados.
    4. Rapidamente lave com solução de M9 duas vezes como na etapa 2.1.2.
    5. Ressuspender o pellet de ovo c. elegans em 3ml M9 e transferência para um novo tubo de 15 mL. Permitir que os embriões eclodir a noite em 3 mL de solução de M9 com rotação a 20 ° C.
    6. Calcular a densidade de animais de L1 (ou embriões) por µ l por cair 10 µ l de solução de L1 3 x em uma placa de 6 cm e contar o número de animais de L1 para calcular o número médio de L1s / µ l.
      Nota: L1 animais vão resolver ao longo do tempo. Portanto, soluções de L1 devem ser periodicamente misturadas.
    7. Sementes de 50 animais de L1 por placa. Inverter as placas e lacre com um elástico. Coloque as placas em uma caixa de plástico worm. Selar a caixa em um saco zip-lock grande. Mover para uma incubadora de 20 ° C.
  3. Impedindo a produção de descendência pela adição de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
    1. Crescer os animais até a fase de L4 a 20 ° C. Verificar para ver se sincronizado animais desenvolveram a L4 aproximadamente 40 h após a semeadura (etapa 2.1.7).
      Nota: O tempo do desenvolvimento dec. elegans variarão em temperaturas diferentes taxas de crescimento e12 de animais mutantes para os quais não foram caracterizadas taxas devem ser testadas empiricamente.
      1. Adicione 160 µ l de 50 x FUdR para cada placa de 6 cm com animais de L4.
        Nota: É fundamental para adicionar FUdR na fase de L4. Para sua conveniência, fazer 1.000 ações x de FUdR dissolvendo 1 g FUdR em 10ml ultrapura H2O. Filter-esterilizar estoque FUdR com um filtro de 0,2 µm e uma seringa de 10 cc. Alíquota ~ 1 mL de estoque em tubos estéreis 1,5 mL. Congelar e armazenar a-20 ° C.
    2. Inspecione as placas para a presença de macho c. elegans. Remova todos os homens.
      Nota: vida útil normalmente é medido por hermafroditas e não machos. Hermafroditas que companheiro vivem mais curto do que animais unmated, mesmo na presença de FUdR13. Os machos menor e mais fino, então são hermafroditas e podem ser facilmente identificados por um distintivo cauda enganchadas14.
    3. Caixa para colocar o saco zip-lock. Retornar para incubadora de 20 ° C.
  4. Marcando a viabilidade
    1. Marcar a viabilidade diariamente tocando suavemente o animal na cabeça com um fio de platina ou cílios. Marcar os animais que não como mortos e removê-los da placa (Figura 2A). Registre o número observado morto para cada condição para cada ponto de tempo de observação.
      Nota: Para reduzir o risco de viés de pontuação, o experimentador deve permanecer cego para condições experimentais e da mesma forma não deve fazer referência os resultados de pontos de tempo anterior durante a pontuação.
    2. Animais de censor que rompem-se, morrer de outros defeitos de desenvolvimento óbvio, ou rastreamento em cima do lado do prato: remover estes animais e o número em cada observado o tempo de registro apontam para a consideração na análise estatística. Além disso, se os machos são encontrados, removê-los e gravar o número observado.
    3. Repita da etapa 1.4.1 diariamente até que os animais não permanecem vivos.
      Nota: Deve o gramado de e. coli diminuir significativamente ou fungo começa a crescer em cima da placa, transferir todos os restantes animais para um prato fresco com o apropriado RNAi e FUdR.
  5. Análise - plotagem de dados e estatísticas
    1. Entrada ou dados de observação gravada aberto no software que suporta a análise de sobrevivência com os não-paramétricos de estimador de Kaplan-Meier15 e log-rank test16 (ver arquivo suplementar 3). Não se esqueça de incluir animais censurados. Não incluem os machos que foram observados, se houver.
      Nota: formatos de dados podem variar entre o software, mas é de um formato comum para gravar cada animal observado em uma linha separada. O Commit experimental em que observou-se um animal morto é o tempo de "evento". Se censurado, o tempo de "evento" é o Commit em que o animal foi censurado. Geralmente há um campo ou a caixa de seleção para indicar observações censuradas.
    2. Traça as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier. Selecione menos de seis condições para uma única trama se muitas condições foram doseadas para melhorar a legibilidade.
      1. Verificar se há problemas de dados que são visualmente aparente - falta observações, os resultados do controlo inesperado, etc. — e abordar estas antes da análise estatística.
    3. Usar a função de teste log-rank no seu software para executar pairwise comparações estatísticas. Certifique-se de que quaisquer opções disponíveis para o tratamento de resultados censored estão definidas adequadamente para dados direito-censurado.

2. replica Set método para a longevidade de c. elegans de Pontuação

Nota: enquanto o método tradicional requer placas de 3 – 6 por condição (ver 1.1.2. acima), o método de conjunto de réplicas requer muito mais (consulte a etapa 2.2.2 abaixo). O método tradicional segue os animais no mesmo prato ao longo de um experimento (Figura 2A). Em contraste, com conjunto de réplicas animais são só marcou uma vez: muitas réplicas idênticas são definidas no início do experimento para que um replicar é marcado em cada ponto de tempo (por julgamento) (Figura 2B).

  1. Instalação de biblioteca.
    Nota: Detalhes adicionais sobre entrega de clones de RNAi é abordado aqui, como o conjunto de réplicas protocolo é passível do marcador simultânea de muitos clones de RNAi, e podem ser dimensionada para mais de 100 clones de cada vez. Coleções de clones de RNAi são preservadas como glicerol estoques mantidos em uma placa de 96 poços formato. Experimentos de conjunto de réplica usam placas de 24 poços. Bem, cada um é uma condição de teste diferentes, que pode corresponder a uma coleção de clones de RNAi, diferentes tratamentos químicos, estirpes animais e assim por diante.
    1. Monte o layout do sublibrary para coleções de clones de RNAi, tal que as seguintes condições:
      1. Certifique-se de que, dentro de uma coleção de 96 poços, poço A1 é um controle negativo do vetor vazio.
      2. Inserir um controle adicional vetor vazio aleatoriamente dentro de cada 24 poços.
      3. Dividi a placa de 96 poços em blocos de 24 poços, tal que cada placa de 24 em um aleatoriamente inseriu o controlo negativo (Figura 2).
      4. Inserir um controle positivo aleatoriamente dentro de cada grupo de 24-wells (Figura 2).
        Nota: O controle positivo é dependente a questão experimental. Por exemplo, quando olhar para uma coleção de RNAi clones esse aumento de vida útil, daf-2(RNAi) é frequentemente incluído. Por outro lado, quando se olha para a vida útil encurtada, daf-16(RNAi) é usado frequentemente.
  2. Preparação dos conjuntos de réplica
    Nota: o número de repetições necessárias é igual ao número mínimo de pontos de tempo (Figura 2B). É preciso conhecer a posteriori quanto para medir a vida útil antes do início do experimento, bem como marcando a frequência (por exemplo, um experimento de conjunto de réplica executando 40 dias com todos os outros marcar dia exige a preparação de um mínimo de 20 réplica de moda para cada condição no início do experimento). É aconselhável fazer ~ 5 conjuntos de backup extra (ver 2.2.2 e 2.2.2.3 abaixo).
    1. Para criar um selo fresco de sublibrary o RNAi, inocule 200 µ l LB + Amp por alvéolo em um formato de 96 poços (placas de 600 µ l) usando um replicador de 96-pino placa pelas seguintes etapas:
      1. Esterilize 96 replicador de placa do pino imergindo-se sequencialmente os pinos em 50% de alvejante, ultrapura H2O e etanol. Manter os pinos imergidos pelo menos 30 s para as etapas de lixívia e etanol.  Após imersão em etanol, as dicas da flama brevemente. Repita.
        Nota: não se esqueça de enxaguar todas lixívia e não deixe os pinos expostos para branquear por períodos prolongados, como água sanitária pode corroer os pinos de aço inoxidável.
      2. Retire cuidadosamente a tampa do adesivo da folha da placa de biblioteca conservada em estoque de glicerol de 96 poços congelados e suavemente, mas firmemente, moer dicas do replicador placa esterilizado nos poços das populações de glicerol ainda congelado. Inocular 200 µ l LB + culturas de Amp e selar a placa inoculada com uma membrana permeável. Permitir que as culturas a crescer durante a noite sobre a bancada.
      3. Esterilizar o replicador de placa como na etapa 2.1.1, cuidadosamente remova o selo da placa de cultura líquida após crescimento durante a noite e mergulhe as pontas dos pinos dos replicadores. Aplicam-se as pontas com pressão para um Retangular LB amp + placa de ágar de tet e bactérias de transferência dos pinos para a placa suavemente com um pequeno movimento circular, garantindo que o espaço adequado é deixado entre pontos adjacentes. Permitir colônias a crescer durante a noite na placa de ágar a 37 ° C. Ver 3 de arquivo suplementar para preparação de LB + Amp/Tet placas.
      4. Antes da utilização, guarde a placa de ágar a 4 ° C invertido (lado da tampa para baixo), envolvido na película de parafina.
        Nota: Armazenar lado tampa de colônias até permitirá condensação Cruz-contaminar RNAi clones! Colônias de e. coli podem ser armazenadas por 2-8 semanas a 4 ° C, dependendo da particular RNAi clones, como clones de RNAi retêm eficácia na indução de dsRNA após indução de IPTG para comprimentos variáveis de tempo. Para pequenas coleções de clones de RNAi, RNAi eficiência deve ser empiricamente determinada por RT-qPCR para confirmar o nocaute.
    2. Calcular o número mínimo de placas 24-bem necessários para um julgamento do experimento: (chapas # por conjunto de réplicas) x (pontos de tempo esperado #). Certifique-se de que alguns conjuntos de réplica extra estão incluídos para lidar com questões como contaminação (Figura 2B).
      Nota: O número total de clones de RNAi determina o número de placas de 24 poços tornar-se um conjunto de réplicas para cada ponto do tempo (Figura 2).
      1. Prepare-se placas de 24 poços, como passo 1.1.2 (suplementar 3 arquivo para receita). Rotular as placas quando preparando-os para que o experimentador marcando o ensaio será cego para as condições experimentais, usando um código de cores ou esquema de codificação de semelhante.
      2. Inocule um conjunto de 1,5 mL LB + culturas Amp para cada 10 réplicas (ver 2.2.2). Inocule culturas em 96 placas bem profundo-bem, usando o replicador de placa (como em 2.1.3) e colônias bacterianas de 2.1.4 (Figura 2, esquerda). Selo com membrana respirável, crescer 20 h (37 ° C) com agitação.
      3. Sementes de 120 µ l de uma cultura durante a noite para cada placa usando uma pipeta multicanal 6-poços com ponta ajustável espaçamento (Figura 2, direita). Descoberto em uma capa de fluxo laminar até todo o líquido foi absorvido de chapas secas. Não seque em demasiado. Armazenar as placas durante a noite em temperatura ambiente.
  3. Sincronização de c. elegans usando tratamento de hipoclorito
    1. Calcular o número mínimo de animais necessário para o experimento: # mínimo de L1s necessária = (15-20 animais/poço) (24 poços/placa) (X placas/réplica conjunto)(Y replica sets).
      Nota: o método de conjunto de réplicas requer mais animais do que o método tradicional. Uma placa de 10 cm cheia de minhocas gravid pode fornecer 20.000-50.000 L1 animais dependendo da densidade de adultos gravid. Da mesma forma, vinte placas de 6cm rendem em torno de ~ 30.000 L1 animais. Plano de preparar uma preparação de ovo que dobra o número mínimo de animais necessário. Se a população em preparação tem fome, re-alimentar ou pedaço de um prato novo e permitir pelo menos três gerações na comida antes prosseguirá17,18. Certifique-se de congelar L1s volta de sobra.
    2. Siga os passos como no método tradicional para obter 1.2 para 1.2.6 sincronizado L1 animais. Sementes de 15 – 20 L1 animais em cada poço usando um 6-poços ajustável-espaçamento pipeta e reagente reservatório, semelhante ao 1.2.7. Periodicamente misture L1 solução evitar a sedimentação de animais.
  4. Prevenção da produção de descendência pela adição de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
    1. Siga o passo 1.3.1.  Preparar estéril 50 x estoque FUdR (consulte a etapa 1.3.1.1).
    2. Quando alcance animais L4, adicione 25 µ l de 50 x FUDR a cada poço de um 24-poço da placa usando uma pipeta de espaçamento ajustável de 6 canais.
  5. Viabilidade de Pontuação
    1. Remover um conjunto de placas de replicar e inundar poços com a solução do M9, registros animais totais por bem e então suavemente tocar animais sem movimento na cabeça com uma picareta de worm (Figura 2B). Animais não conseguir mover são marcados como mortos. Descarte as placas marcou. Viabilidade de registro diariamente.
      Nota: Os animais que ruptura, mostrar defeitos morfológicos bruto, não conseguiu desenvolver, ou se arrastou até ao lado do poço são para ser censurado por excluindo-os de ambos os valores mortos e totais.
      1. Registre o número de animais que são censurados dentro de cada poço em cada ponto de tempo separada de outros valores.
      2. Não marcam poços que não tem comida ou estão contaminados (por exemplo, o fungo ou lodo); Esses poços são considerados censurado. Além disso, censura um bem se todos os animais exibir defeitos morfológicos ou do desenvolvimento. Registre o evento censurando para este RNAi clone/bem a este ponto do tempo.
      3. Depois de marcar um prato replicar, descartá-lo. Continue marcar um novo replicar definir cada dia até que todos os animais em todos os poços estão mortos. Para reduzir o risco de viés de pontuação, o experimentador deve permanecer cego para condições experimentais e da mesma forma não deve fazer referência os resultados de pontos de tempo anterior durante a pontuação.
      4. Se todos os animais dentro de um poço foi morto em um ponto determinado do tempo, em seguida, depois de marcar esse dia, analisar se todos os animais têm sido marcados como morto por dois pontos consecutivos tempo para um dado bem. Em caso afirmativo, marcando a viabilidade não é mais necessário para tão bem nos pontos de tempo subsequente.
      5. Realizar ensaios adicionais experimento independente. Rastrear os resultados dos ensaios sucessivos separadamente daqueles em ensaios anteriores, com o número de julgamento observado.

3. dados do gráfico

Nota: Com o conjunto de réplicas método uma curva de ajuste é aplicado para aproximar a média e a longevidade máxima. Os parâmetros para avaliar a mortalidade de c. elegans cabem um logit curva19.  Como a maioria das ferramentas de sobrevivência não suporta logit do encaixe de curva, um novo programa foi desenvolvido para plotagem logit curvas (para o conjunto de réplicas); Curvas de Kaplan-Meier (para o método tradicional) também são suportadas.

  1. Começar a trabalhar com o software. Baixe arquivo zip da versão para a versão atual (consulte a Seção de materiais). Extraia o arquivo zip para uma pasta. Consulte o arquivo "readme" na pasta extraída para obter instruções de instalação adicionais.
  1. Inicie a interface de plotagem. Encontrar o local do diretório "código" na pasta extraída do arquivo zip (por exemplo,  "/ Usuários/nome de usuário /Desktop/WormLife/code").
    1. Digite os seguintes comandos no console do R, substituindo o caminho da pasta apenas identificado. Pressione entrar ou retornar cada um entrou na linha: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), openMain() 3).
    2. Prazo para a interface carregar em uma nova janela, trazendo a tela padrão, como mostrado na Figura 3A. Deixe o R executar em segundo plano.
  2. Formatar dados como valores separados por vírgula (CSV) ou arquivos de valores separados por tabulações (TSV). Especifica colunas e nomes, dependentes do tipo de análise. Consulte suplementar arquivo 4 (conjunto de réplicas) e 5 de arquivo suplementar (tradicional/Kaplan-Meier) de dados de exemplo pré-formatados.
    Nota: dados devem ser especificados em um formato "longo", ou seja, uma linha por estirpe de tratamento por tempo ponto por julgamento. Arquivos CSV são recomendados para melhor compatibilidade entre plataformas.
    1. Remova linhas correspondentes às observações que foram ignoradas ou censuradas. Verificar a ausência de valores não-numéricos ou ausentes, como pode resultar em um erro quando os dados são importados.
    2. Para análise de estilo tradicional Kaplan-Meier, piscina não dados de ensaios independente-trama-los separadamente. Para a análise do conjunto de réplicas, dados de experimentos múltiplos da piscina e então investigar usando a funcionalidade de "TrialView" (ver 6.3.3.4).
  3. Usando a interface de plotagem
    1. Carregar um arquivo de dados ("importação" no menu "File") usando a caixa de diálogo. Para abrir arquivos ". csv", altere o tipo de arquivo no drop-para baixo "CSV" (o padrão é ".txt/.tsv"), navegue até a pasta com o arquivo de dados. Eis o arquivo os dados do exemplo de conjunto de réplicas (4 de arquivo suplementar).
      Nota: Importação de um arquivo quando um conjunto de dados já estiver aberto vai substituir o atual dataset.
    2. Selecione um arquivo para importar para iniciar o assistente de importação, que percorre identificando as colunas do arquivo selecionado (Figura S1A para conjunto de réplicas). Se os dados de entrada correspondem a um conjunto de réplicas de experimento, escolha "Logit" para o tipo de estudo.
      Nota: O importação de fluxo de trabalho é diferente entre o conjunto de réplicas (S1 FiguraA) e tradicional (Kaplan-Meier) (S1 FiguraB).
    3. "Plotar dados". Selecione "Adicionar a linha" para começar a plotar dados. (Uma linha corresponde a um conjunto de condições. Existem recursos para ajudar com experiências onde muitas condições foram testadas).
      1. Sinopse o controle condições-no caso dos dados de exemplo N2 (WT) com L4440 (vetor vazio) RNAi são apropriadas. Selecione "Adicionar a linha" no menu "Gráficos" para iniciar o assistente para adicionar linha: selecione a condição de enredo e os parâmetros de gráficos para representar a linha.
        1. Para adicionar uma curva para uma condição diferente manualmente, repita as etapas em 3.3.3.1
        2. Para alterar a cor ou símbolo para uma linha de plotagem, selecione "Modificar a linha" no menu"gráfico".
        3. Para remover uma linha sem limpar todas as linhas, selecione "Excluir linha" no menu"gráfico".
        4. Para limpar todas as linhas no enredo atual, selecione "Linha clara" no menu"gráfico".
        5. Para substituir o valor automaticamente selecionado máxima do eixo x (tempo), use "Set X escala" no menu"gráfico".
          Nota: o eixo y (fração sobrevivente) exibe sempre 100% (em cima) para 0% (inferior) em incrementos de 20%. O eixo x é sempre exibido em incrementos de 5. Rótulos de eixo não são plotados para permitir flexibilidade na rotulagem depois de salvar imagens da trama.
      2. Para salvar imagens JPEG-formato da trama atualmente exibida, use a opção "Salvar enredo" no "menu arquivo"; apenas a trama atual é salvo.
      3. Para a criação de lotes individuais para diversas condições em um experimento, o software permite definir e traçar uma "série".
        Nota: A implementação do conceito série melhora a eficiência ao trabalhar com grandes experiências.
        1. Se começando com um espaço de trabalho do enredo em branco, adicione linhas correspondentes a controlar as condições que devem ser consistentes em todas as parcelas da série (ver 3.3.3.1).
        2. Defina a série com a série"definir" no menu gráficos. Selecione uma condição correspondente à linha para exibir primeiro na série; Só pode ser selecionado. Escolha gráficos parâmetros (símbolo de linha cor e trama) para a linha, como em 3.3.3.1.
        3. Rever as parcelas para as condições de teste diferentes. Alterne a exibição de "a linha da série" entre condições usando os botões de seta para a esquerda/direita encontrados nos lados da janela do enredo principal, bem como no menu superior da barra (Figura 3A-C).
          Nota: Se a linha da série selecionada é a mesma condição como uma das linhas de referência/controle adicionado anteriormente, a nova linha pode aparecer sobreposta.
        4. Defina a série para fazer certas outras funções disponíveis (salvar série parcelas e Trialview-Veja 3.3.3.4 por último). Depois de definir uma série, use a opção "Salvar lotes de série" do menu "Arquivo" para salvar arquivos de imagem trama individual para cada parcela da série em uma nova pasta.
      4. Trialview — visualização de resultados de ensaios independentes de um experimento do conjunto de réplicas. Se vários ensaios foram executados por um ou mais dos grupos de amostra, plote os dados a partir de ensaios individuais e os dados em pool de todos os ensaios separadamente para avaliar a consistência entre ensaios independentes (ver Figura 3D).
        1. Configure uma série, conforme descrito em 3.3.3.3. Os diferentes ensaios serão plotados sobre os respectivos julgamentos para as amostras de referência/controle especificado para cada um dos grupos de amostra "diferentes" em uma imagem diferente.
        2. Para salvar as imagens TrialView, vá para "TrialViews de impressão" no menu de dados; uma imagem JPEG será a saída para cada parcela da série.
          Nota: Os resultados de exemplo na Figura 3D é para um caso com dois ensaios.
    4. Quadro-resumo vida útil mediana para dados do conjunto de réplicas. Visualmente inspecionar curvas para garantir ajuste razoável dos dados, em seguida, selecione o quadro-resumo do "" opção no menu de dados para salvar uma tabela de valores de vida útil mediana (tempo em 50% de sobrevivência na curva logit) para cada tipo de amostra.
  4. Avaliação estatística dos dados gerados através do método de conjunto de réplicas
    1. Para análise estatística entre os dois grupos de uma experiência de conjunto de réplicas, modificar e executar um script de R, fornecido no arquivo zip da versão (ver "WormLife script de modelo de análise estatística. R").
      Nota: Proficiência em R não é necessário para executar o script. Documentação adicional é nos comentários no arquivo. O script está pronto para análise do conjunto de réplica de dados de exemplo. Dados gerados pelo usuário no formato apropriado também (veja suplementar 4 arquivo) podem ser analisados.
      1. Abra o arquivo de script em R (R GUI ou RStudio).
        Nota: Isto irá mostrar o script sem executá-lo.
      2. Modifica os locais dos arquivos necessários para coincidir com o local no seu computador.
        Nota: Estes caminhos de arquivo devem ser "totalmente qualificados" (ou seja, deve incluir o local do arquivo completo, incluindo pastas).
        1. Modificar os caminhos (locais de arquivo/pasta) para "wlDir" (local do diretório), "dataFile" (réplica definir arquivo de dados para analisar), "compFile" (especificação de comparações para correr, se for o caso) e "outputPath" (local onde serão gravados os arquivos de resultado a).
      3. Defina os nomes de coluna na seção "Especificar colunas no arquivo de dados" se os nomes de coluna no arquivo a ser analisado são diferentes do arquivo de exemplo. Especifica uma coluna para cada parâmetro. Se um estudo tem múltiplas variedades, mas sem RNAi (ou outro tratamento) incluem uma coluna no arquivo de dados com entradas em branco ou o mesmo para todas as linhas (por exemplo, "no_treatment", etc.).
      4. Defina o parâmetro "compFile". Se o parâmetro "compFile" é definido como at, então todas as comparações emparelhadas possíveis dos grupos serão executadas.
        Nota: Um grupo é definido pela combinação de tensão/genótipo e tratamento, que são concatenadas e exibido como "strain_treatment". Para maiores estudos com muitos grupos, pode ser fornecido um arquivo CSV, especificando as comparações. Consulte o arquivo de exemplo "comps_rsm_example.csv".
      5. Definir o número de iterações para reamostragem de Monte Carlo ("k.resamp", o padrão é 1.000).
        Nota: P-valores de 0 podem ser retornados quando muito poucas iterações são realizadas; em tais casos, convém relatório "p < 0,01" (se k.resamp = 100), ou "p < 0,001" (se k.resamp = 1.000), etc.
      6. Execute o script: botão "fonte" em RStudio (superior direito da janela de edição) ou "documento fonte" no menu "Editar" no GUI R. (Execução pode levar algum tempo).
      7. Quando o indicador de R "ocupado" é exibido, abra a saída de diretório-haverá uma tabela com os resultados de cada comparação (sobrevida mediana, p-valores, mudança de vida útil mediana %).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No desenvolvimento de qualquer nova metodologia, é imperativo que o novo método recapitula os resultados aceitos de abordagens anteriores e cumpre a norma dentro de um campo. Nós anteriormente mostraram empiricamente que o conjunto de réplicas e métodos tradicionais para análise do tempo de vida de c. elegans produzem semelhantes resultados20. Selvagem-tipo c. elegans (N2) mantida a 20 ° C, normalmente vivem entre 20 e 25 dias, o que observamos co...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ambos os métodos conjunto tradicionais e réplica requerem a sincronização dos animais cronologicamente envelhecidos. Nós incluímos um método que sincroniza usando tratamento hipoclorito de gravid adultos, onde só os ovos fertilizados com o adulto gravid sobrevivem tratamento de animais. Estes embriões eclodem em suspensão líquida e desenvolvente prendam a primeira fase larval (L1). Após a semeadura L1 animais para alimento (por exemplo, Escherichia coli expressando dsRNA a um gene de interesse), animais...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiamento para este trabalho descrito neste manuscrito foi fornecido por: o escritório da Universidade de Rochester de The Provost e da escola de medicina e odontologia Dean do escritório através do centro de Ciências da saúde para a inovação computacional (HSCCI); Ellison Medical Foundation estudiosos novo no envelhecimento Fellowship (AG-NS-0681-10) os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IPTG (isopropil beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-desoxiuridina)Alfa AesarL16497
Placas de Cultura de 24 PoçosGreiner Bio-One#662102
Placa retangular de poço único não tratada, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 µ L Placas de 96 poçosGreiner Bio-One#786261
Placas de 96 poços de 2mLGreiner Bio-One#780286
Vedação de placa permeável ao arVWR60941-086
Replicador de placas de 96 pinosNunc250520
bactopeptonaVWR90000-368
ágar bacteriológicoAffymetrix/USB10906
Biblioteca de clones de RNAi de C. elegans em bactérias HT115 - AhringerSource BioscienceColeção de RNAi de C. elegans (Ahringer)Veja também Kamath et. al, Nature 2003.
Biblioteca de clones de RNAi de C. elegans em bactérias HT115 - VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Veja também Rual et. al, Genome Research 2004. Esta biblioteca também está disponível na Dharmacon.
WormLife- Software para Análise de Sobrevivência de Conjunto de RéplicasSamuelson LabN / Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Plasmídeo de Vetor VazioAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OÁSIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prismhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

Referências

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