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Artigo de método

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

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DOI:

10.3791/57832

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2 de agosto de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, School of Medicine and Dentistry

Neste artigo

Resumo

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Resumo

O genoma humano codifica quatro paralogs de bestrophin, nomeadamente BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificada pelo gene BEST1 , é um Ca2 +-ativado Cl– canal (CaCC) predominantemente expressado no epitélio pigmentar da retina (RPE). O significado fisiológico e patológico de BEST1 é realçado pelo fato de que mais de 200 mutações diferentes no gene BEST1 foram geneticamente ligadas a um espectro de pelo menos cinco doenças degenerativas da retina, como a melhor vitelliform Distrofia macular (doença melhor). Portanto, compreendendo a biofísica dos canais bestrophin no nível do único-molécula tem enorme significado. No entanto, obtenção de canais iônicos de mamíferos purificada é muitas vezes uma tarefa desafiadora. Aqui, nós relatamos um protocolo para a expressão de proteínas de mamíferos bestrophin com o sistema de transferência do gene de baculovirus BacMam e sua purificação por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purified têm o potencial para ser utilizado em posteriores análises funcionais e estruturais, tais como gravação eletrofisiológica no bilayers do lipid e Cristalografia. Importante, este gasoduto pode ser adaptado para estudar as funções e estruturas de outros canais iônicos.

Introdução

Bestrophins é uma família de canais iônicos conservada através da espécie, variando de bactérias a seres humanos1. Em humanos, o gene BEST1 , localizado no cromossoma 11q12.3, codifica a proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expressa predominantemente na membrana basolateral das células do epitélio (RPE) pigmento da retina dos olhos2,3 ,4. Composto de 585 aminoácidos, o primeiro ~ 350 dos quais são altamente conservadas entre as espécies e conter sua região transmembrana, BEST1 atua como um CaCC em seres humanos1,5,6. Além disso, os BEST1 homologs em galinhas Klebsiella pneumoniae ambos funcionam como homopentamers7,8, sugerindo um alto nível de conservação ao longo da evolução.

Nos seres humanos, mais de 200 mutações no gene BEST1 clinicamente têm sido associadas a um grupo de doenças de degeneração da retina chamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicos têm sido relatados, incluindo doença melhor, distrofia vitelliform adulto-início, autossômica dominante vitreoretinochoroidopathy, autossômica recessiva bestrophinopathy e retinite pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Estas doenças, que levam a diminuição da acuidade visual e até mesmo cegueira, são atualmente incurável. A fim de desenvolver tratamentos terapêuticos e medicina potencialmente personalizada, é de fundamental importância compreender como essas mutações causam doenças de BEST1 influenciam a função e a estrutura do BEST1 canal15. Para estes fins, os pesquisadores precisam obter canais bestrophin purificado (tipo selvagem e/ou mutante) e conduta em vitro análises5,8.

O primeiro passo fundamental é a expressão de canais de bestrophin de espécies superiores em células de mamíferos. Como transdução de baculovirus de células HEK293-F (sistema BacMam) é um método poderoso para heterologously express de16,de proteínas de membrana17, este protocolo utiliza um vetor de BacMam (pEG BacMam) otimizado para expressão robusta do alvo da proteína18, que neste caso é um homólogo de mamíferos bestrophin. Este vetor tem sido usado para a expressão de várias proteínas de membrana, incluindo G-receptores, receptores nucleares e outros canais de íon18. Há também evidências de que as proteínas produzidas são apropriadas para cristalografia18. Com altos níveis de expressão em células HEK293-F, as proteínas podem então ser purificadas usando cromatografia; especificamente, no caso de bestrophins, tanto a afinidade e a cromatografia de exclusão de tamanho podem ser usados.

Uma vez que este protocolo é aperfeiçoá-lo para um canal de bestrophin, a proteína purificada pode ser analisada para sua função e estrutura através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8. No total, essas técnicas fornecem um poderoso pipeline para investigações funcionais e estruturais de bestrophins e outros canais de íon.

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Protocolo

1. produzindo BacMam expressão Baculoviruses

  1. Inserir a sequência de codificação de uma proteína desejada bestrophin mamíferos no pEG BacMam vector18 com uma sequência de reconhecimento de protease tabaco Etch vírus (TEV), seguida por um GFP-10 x sua marca no C-terminal da proteína.
  2. Transitoriamente, transfect o plasmídeo de expressão em adesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Verifique se a expressão da proteína GFP-fusão sob um microscópio fluorescente com 10 X ou 20 X de ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm (figura 1A).
    Nota: Baseado em polímero de transfeccao é realizado rotineiramente com 1 μg de DNA de plasmídeo por um prato de 35 milímetros de células HEK293.
  3. Produzi o baculoviruses em células de inseto Sf9 como descrito anteriormente,16,17.
    Nota: A passagem 3 (P3) vírus, que serão usado para infectar as células HEK293-F para a produção de proteína, podem ser armazenadas a 4 ° C por 1 mês.
  4. Determine o título (unidades infecciosas) do vírus P3 pela placa formação ensaio16,17.
    Nota: Como a proteína de interesse é marcada com as boas práticas agrícolas, um método mais rápido para verificar unidades infecciosas é infectar células Sf9 com diluições em série do vírus e contar o número de células fluorescentes após 48 h.

2. expressão da proteína

  1. Manter as células HEK293-F em uma cultura de suspensão com o meio de expressão HEK293-F numa incubadora umidificado de 37 ° C, com 8% de CO2. Use frascos de cultura descartável que são 2 - 2,5 vezes maior do que o volume de cultura e giram a cultura em uma plataforma orbital a 135 rpm.
    Nota: É recomendável para infectar as células quando elas são entre 5 e 30 passagens e para realizar essas ações sob um capuz de cultura de células.
  2. 24 h antes da infecção viral, adicionar 15 μL de Trypan azul para uma alíquota de 15 µ l de cultura de células e verificar a densidade celular e a viabilidade usando um hemocytometer sob um microscópio. Diluir as células de 0,6 x 106 células/mL em frascos de 2 x 2 L cada, com 500 mL de meio de pré aquecida a 37 ° C.
    Nota: As células mortas são manchadas de azul de Trypan azuis. A viabilidade da célula desejada é > 95%.
  3. No dia de infecção, verificar a densidade celular e a viabilidade (passo 2.2).
    Nota: Uma alta viabilidade celular de > 95% é essencial para a expressão eficiente de infecção e proteína. A densidade celular esperado é ~1.0 x 106 células/mL (adulta durante a noite de 2 x 500 mL da 0,6 x cultura de pilha 106 células/mL). O esperado número total de células é ~1.0 x 109.
  4. Adicione o baculoviruses P3 para as células em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Para determinar a quantidade de vírus para inocular, use a seguinte equação:
    figure-protocol-1
  5. Agite as células na plataforma orbital a 135 rpm numa incubadora umidificado 37 ° C, com 8% de CO2 por 24 h.
  6. Adicionar 10 mM de butirato de sódio à cultura de pilha e continuar incubando por 48 h.
    Nota: Para algumas proteínas, reduzindo a temperatura de cultura celular para 30 ° C após adição de butirato de sódio pode melhorar a expressão e estabilidade.
  7. Sob um microscópio de fluorescência com 10x ou 20x ampliação, uma fonte de excitação 488 nm e um filtro de emissão 510 nm, verificar a percentagem e o brilho das células verdes, que representam diretamente o rendimento de proteína (10xHis-bestrophin-GFP) (figura 1B).
    Nota: A percentagem de células verdes é calculada por: 100 x (células células verdes/Total). Nível de proteína boa expressão é indicada pela forte fluorescência verde sob o microscópio.
  8. Recolher as células por centrifugação a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. remover o sobrenadante e ressuspender as pelotas de célula com tampão fosfato salino (PBS) até um volume final de ~ 80 mL. Split a suspensão de células nos tubos cônicos de 2 x 50 mL e centrifugar a 1.000 x g em 4 ° C por 20 min. Guarde as pelotas de célula a-80 ° C.

3. purificação de proteínas

  1. Incube os tubos cónicos contendo as pelotas de células em um banho de água a agitação à temperatura ambiente por 10-15 min, para que eles descongelar. Ressuspender as células em 2 x volume (p/v) reserva um (tabela 1) (por exemplo, 10 g de pellets de célula em 20 mL de tampão) suplementado com inibidores da protease (fluoreto de aprotinina, Leupeptin, Pepstatin A e phenylmethylsulfonyl) em 0.1-1.0 mM. Pipeta sobem e descem extensivamente para obter uma suspensão homogênea.
  2. Lise as células usando um homogeneizador de alta pressão. Executar a suspensão de células através do homogenizador em 7-10 MPa para um total de 3 - 4 vezes para alcançar a completa homogeneização. Deixe o celular lisado no gelo durante 2-3 minutos entre os rounds.
  3. Adicione detergente [por exemplo, 2% w/v sol grau n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)] para o lisado celular. Incube com agitação durante 1 h a 20 ° C, para extrair as proteínas de membrana.
    Nota: O tipo de detergente deve ser otimizado para cada proteína alvo18,24.
  4. Centrifugar a 150.000 x g em um se a 4 ° C, durante 1 h.
    Nota: Todas as seguintes etapas são executadas a 4 ° C.
  5. Recolha o lisado de células claras e fluxo passar uma 5ml sua armadilha Ni2 +- NTA coluna de afinidade previamente incubado com buffer um (tabela 1).
    Nota: Após centrifugação, a lisado de células claras irão ser imprensada entre um sedimento no fundo e uma camada de nublado em cima. Use uma pipeta de transferência de 10 mL para recolher cuidadosamente a clara lisado e alterne para uma pipeta de 1 mL para o último poucos mililitros de lisado. Evitar a pelota, que pode obstruir a coluna do Ni2 + ; no entanto, uma pequena quantidade de camada superior é fina ou pode ser filtrada com um filtro de 1,5 μm.
  6. Lavar a coluna com 25 mL de tampão B e, em seguida, 40 mL de tampão C (tabelas 2 e 3, respectivamente).
    Nota: Este é um bom lugar para fazer uma pausa, como a purificação total pode levar até 12 h e a proteína pode permanecer estável enquanto anexado à coluna durante a noite.
  7. Unir a coluna para um sistema de cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida e eluir a proteína da coluna com 13 mL de tampão D (tabela 3) com fracionamento. Recolha as frações enriquecidos com proteína de acordo com a leitura de absorbância UV.
    Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 1,0 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido de 0,3 MPa e uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.
  8. Medir a concentração de produto de proteína eluted no espectrofotómetro microvolume. Ler a absorbância em 280 nm.
  9. (Opcional) Para remover a marca de GFP-10xHis, adicione a protease do PEV na proporção 1:1 em massa e incubar a 4 ° C por 30 min.
    Nota: A tag pode ou não pode afetar a função ou estrutura do canal purificado. Calcule a quantidade TEV de volume e concentração da proteína coletada de passos 3.7-3.8. Por exemplo, se 10 mL de produto de eluição é coletado e medido em 0,1 mg/mL, a proteína total massa é 10 x 0,1 = 1 mg e 1 mg de TEV será usado para a digestão.
  10. Concentrar a proteína com uma centrífuga de 15 mL (50 ou 100 kDa) unidade de filtro por fiação a 4.000 x g em 4 ° C, até um volume final de 400-500 μL (para um loop de carregamento de amostra de 2 mL em FPLC).
    Nota: O tempo de centrifugação para concentração varia de acordo com a concentração e o tamanho da proteína. Para evitar excesso de concentração, que pode causar precipitação de proteínas, girar por 10 min em primeiro lugar, em seguida, observar o volume restante e estimar o tempo para uma rodada subsequente (por exemplo, 2-5 min), e assim por diante, para obter o volume final. Pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro.
  11. Transferi a proteína concentrada para uma nova 1,5 mL tubo e remover qualquer precipitado ou bolhas do produto concentrado. Rotação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante em um novo tubo de 1,5 mL.
  12. Carrega o produto final com uma seringa de 1 mL e uma agulha de ponta redonda em um sistema FPLC para cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna de tamanho-exclusão previamente incubada com buffer E (tabela 5).
    Nota: o FPLC condições são como segue: um tamanho de fração de 0,5 mL, um alarme de pressão de pré-coluna definido para 2,50 MPa, um volume de fluxo definido para 30 mL de tampão E (tabela 5), e uma taxa de fluxo definido como 0,5 mL/min.
  13. Observe que proteínas bem-comportado executar como um único pico (Figura 2A) e recolher a fraction(s) proteína correspondente a esse pico (Figura 2A).
  14. Concentre a proteína com uma unidade de filtro centrífugo 4 mL ou 0,5 mL (de mesmo peso molecular recorte como na etapa 3.10) e girar a 4.000 x g a 4 ° C, a uma concentração final de 5-10 μg/μL. Use o espectrofotômetro para verificar a concentração do produto final (etapa 3.8).
    Nota: O tempo de centrifugação varia, conforme o volume de produto final pode ser diferente entre ensaios de purificação. Normalmente, a centrifugação leva 10-20 min. Recomenda-se a pipeta entre spins para dispersar a proteína, que é puxada para o fundo do filtro.
  15. Transferi a proteína concentrada para um novo tubo de 1,5 mL. Remover qualquer precipitado por centrifugação em > 12.000 x g por 5-10 min a 4 ° C. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Faça 10 alíquotas μL para armazenamento a-80 ° C e salve um 2-5 μL pequena parte alíquota para executar em um gel de SDS-PAGE 4-15% gradiente em 9 V/cm (Figura 2B).
  16. Confirme a identidade da proteína purificada por espectrometria de massa8.
    Nota: Análise In vitro da função e estrutura da proteína purificada podem ser realizadas através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8.

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Resultados

A intensidade de fluorescência em transitoriamente transfectadas adesivas células HEK293 (figura 1A) é um bom indicador para o nível de expressão de proteínas projetadas em células HEK293-F de suspensão (figura 1B). Se a proteína do alvo não for bem expressa ou mis está localizada em células HEK293 depois de transfecção transiente, é aconselhável considerar modificando o conceito de expressão (EG., mudando a posição da m...

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Discussão

Este protocolo descreve um pipeline útil para expressão e purificação dos canais de íon bestrophin mamíferos deve ser usado para análises futuras em vitro . Enquanto o dispositivo FPLC é necessário para a cromatografia de exclusão de tamanho, uma bomba de seringa é suficiente para todas as etapas da cromatografia de afinidade, incluindo vinculação, lavagem e eluição. Ao usar uma bomba de seringa para soluções de impulso (em uma seringa) através de uma coluna, é essencial a subjacência de lado para evitar empurra...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HEPESFisher ScientificAC327265000 
NaClFisher ScientificAC446212500
GlicerolFisher ScientificG33-500
ImidazolFisher ScientificAC301870010
MgCl2Fisher ScientificAC197530010 
TCEPFisher ScientificAA4058704 
AprotininaFisher ScientificAAJ63039MA
LeupeptinaFisher ScientificAAJ61188MB 
Pepstatina AFisher ScientificAAJ20037MB
fluoreto de fenilmetilsulfonilFisher ScientificAC215740050
DDM sol-grauAnatraceD310S
DDM anagradeAnatraceD310
Sf-900 II SFMThermoFisher10902179
FreeStyle médioThermoFisher12338018
NanoDrop espectrofotômetroThermoFisherND-2000
Homogeneizador de alta pressãoAvestinEmulsiflex-C5
Coluna HisTrapGE17-5248-01
Coluna Superdex-200GE28990944
AKTA PureGE29018224
Ultra-15 unidades de filtro centrífugasMilliporeUFC910024
Ultra-4 unidades de filtro centrífugasMilliporeUFC810024
Ultra-0.5 unidades de filtro centrífugoMilliporeUFC505024
Optima XE-90 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004
Gel pré-fabricado Mini-PROTEANBio-Rad4561084
T100 TermocicladorBio-Rad1861096
Reagente de transfecção PolyJetSignaGen
vetor pEG BacMamObtido no laboratório Gouaux do Instituto Vollum
SL100688

Referências

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540(2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079(2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).

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