A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .
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Artigo de método
Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O genoma humano codifica quatro paralogs de bestrophin, nomeadamente BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificada pelo gene BEST1 , é um Ca2 +-ativado Cl– canal (CaCC) predominantemente expressado no epitélio pigmentar da retina (RPE). O significado fisiológico e patológico de BEST1 é realçado pelo fato de que mais de 200 mutações diferentes no gene BEST1 foram geneticamente ligadas a um espectro de pelo menos cinco doenças degenerativas da retina, como a melhor vitelliform Distrofia macular (doença melhor). Portanto, compreendendo a biofísica dos canais bestrophin no nível do único-molécula tem enorme significado. No entanto, obtenção de canais iônicos de mamíferos purificada é muitas vezes uma tarefa desafiadora. Aqui, nós relatamos um protocolo para a expressão de proteínas de mamíferos bestrophin com o sistema de transferência do gene de baculovirus BacMam e sua purificação por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purified têm o potencial para ser utilizado em posteriores análises funcionais e estruturais, tais como gravação eletrofisiológica no bilayers do lipid e Cristalografia. Importante, este gasoduto pode ser adaptado para estudar as funções e estruturas de outros canais iônicos.
Introdução
Bestrophins é uma família de canais iônicos conservada através da espécie, variando de bactérias a seres humanos1. Em humanos, o gene BEST1 , localizado no cromossoma 11q12.3, codifica a proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expressa predominantemente na membrana basolateral das células do epitélio (RPE) pigmento da retina dos olhos2,3 ,4. Composto de 585 aminoácidos, o primeiro ~ 350 dos quais são altamente conservadas entre as espécies e conter sua região transmembrana, BEST1 atua como um CaCC em seres humanos1<....
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Protocolo
1. produzindo BacMam expressão Baculoviruses
- Inserir a sequência de codificação de uma proteína desejada bestrophin mamíferos no pEG BacMam vector18 com uma sequência de reconhecimento de protease tabaco Etch vírus (TEV), seguida por um GFP-10 x sua marca no C-terminal da proteína.
- Transitoriamente, transfect o plasmídeo de expressão em adesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Verifique se a expressão da proteína GFP-fusão sob um microscópio fluorescente com 10 X ou ....
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Resultados
A intensidade de fluorescência em transitoriamente transfectadas adesivas células HEK293 (figura 1A) é um bom indicador para o nível de expressão de proteínas projetadas em células HEK293-F de suspensão (figura 1B). Se a proteína do alvo não for bem expressa ou mis está localizada em células HEK293 depois de transfecção transiente, é aconselhável considerar modificando o conceito de expressão (EG., mudando a posição da m.......
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Discussão
Este protocolo descreve um pipeline útil para expressão e purificação dos canais de íon bestrophin mamíferos deve ser usado para análises futuras em vitro . Enquanto o dispositivo FPLC é necessário para a cromatografia de exclusão de tamanho, uma bomba de seringa é suficiente para todas as etapas da cromatografia de afinidade, incluindo vinculação, lavagem e eluição. Ao usar uma bomba de seringa para soluções de impulso (em uma seringa) através de uma coluna, é essencial a subjacência de lado para evitar empurra.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazol | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinina | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptina | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatina A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| fluoreto de fenilmetilsulfonil | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grau | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle médio | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop espectrofotômetro | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Homogeneizador de alta pressão | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| Coluna HisTrap | GE | 17-5248-01 | |
| Coluna Superdex-200 | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 unidades de filtro centrífugas | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 unidades de filtro centrífugas | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 unidades de filtro centrífugo | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Gel pré-fabricado Mini-PROTEAN | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Termociclador | Bio-Rad | 1861096 | |
| Reagente de transfecção PolyJet | SignaGen | ||
| vetor pEG BacMam | Obtido no laboratório Gouaux do Instituto Vollum |
Referências
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
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Reimpressões e permissões
