Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co لدراسة البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. هذا الأسلوب مناسبة للمظاهرة للتفاعلات بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك في نقص.
Abstract
مستويات الأوكسجين المنخفضة (نقص) يؤدي إلى مجموعة متنوعة من استجابات التكيف مع عامل نقص إيندوسيبلي 1 (منطقياً-1) معقدة تعمل كمنظم رئيسي. منطقياً-1 تتألف من وحدة فرعية α تنظم الأكسجين هيتيروديميريك (كحلول'-1α) ومؤثراً أعرب عن الوحيدات بيتا (منطقياً-1β) يعرف أيضا باسم أريل هيدروكربون مستقبلات النووية ترانسلوكاتور (ارنت)، تنظيم الجينات المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية ، تكون الكريات الحمر وتحلل. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 مفتاح لفهم نقص إشارات الطريق. إلى جانب تنظيم الاستقرار 1α منطقياً، يؤدي نقص أيضا إزفاء النووية للعديد من عوامل النسخ بما في ذلك 1α سكانية وارنت. جدير بالذكر أن معظم الأساليب الحالية المستخدمة لدراسة هذه التفاعلات البروتين-بروتين (القياسية) تستند إلى نظم حيث يتم زيادة مستويات البروتين مصطنع من خلال أوفيريكسبريشن البروتين. بروتين أوفيريكسبريشن وكثيراً ما يؤدي إلى نتائج غير الفسيولوجية الناجمة عن التحف الزماني والمكاني. هنا يصف لنا co-إيمونوبريسيبيتيشن تعديل البروتوكول بعد علاج نقص استخدام البروتينات النووية الذاتية، و كدليل على المفهوم، لإظهار التفاعل بين 1α سكانية وارنت. في هذا البروتوكول، كانت تحصد الخلايا التاكسج تحت ظروف التاكسج ودولبيكو المخزن المؤقت ليغسل المالحة فوسفاتيبوفيريد (دببس) كان أيضا قبل متوازن لظروف التاكسج قبل الاستخدام للتخفيف من حدة تدهور البروتين أو بروتين معقد الانفصال من خلال ريوكسيجينيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، استخرجت الكسور النووية في وقت لاحق إلى التركيز واستقرار البروتينات النووية الذاتية وتجنب نتائج زائفة ممكن غالباً ما ينظر خلال overexpression البروتين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإظهار التفاعلات الذاتية وأصلي بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج.
Introduction
نقص يحدث عندما يتم تزويد عدم كفاية الأكسجين إلى الخلايا والأنسجة في الجسم. أنها تلعب دوراً حاسما في مختلف العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل تمايز الخلايا الجذعية، التهاب وسرطان1،2. بمثابة عوامل نقص إيندوسيبلي (التنظيم) heterodimers تتألف من وحدة فرعية α الأكسجين وينظم ووحدة فرعية β أعرب مؤثرا المعروف أيضا ارنت3. وقد حددت isoforms ثلاث مفارز منطقياً-α (منطقياً-1α، 2α سكانية ومنطقياً-3α) وثلاث مفارز منطقياً-β (ارنت/منطقياً-1β و ARNT2 و ARNT3) حتى الآن. هي أعربت 1α سكانية وارنت أوبيكويتوسلي، بينما 2α سكانية ومنطقياً-3α و ARNT2 و ARNT3 وقيدت أكثر أنماط التعبير4. البروتين 1 سكانية معقدة هي الجهة الرئيسية لنقص استجابة. تحت ظروف التاكسج، 1α سكانية يصبح استقرت، ثم translocates إلى النواة وديميريزيس مع ارنت5. في وقت لاحق، هذا المجمع بربط النيوكليوتيدات المحددة المعروفة بنقص استجابة عناصر (HREs) وينظم الجينات المستهدفة المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية، وتكون الكريات الحمر وتحلل6. وبالإضافة إلى هذا الرد "المتعارف عليه"، مسار مما يشير إلى نقص كما هو معروف للحديث المتبادل مع الاستجابة الخلوية متعددة مما يشير إلى مسارات مثل الشق والنووي كابا عامل ب (NF-κB)7،8،9.
تحديد البروتينات المتفاعلة رواية منطقياً-1 مهم لفهم أفضل لنقص إشارات الطريق. على عكس ارنت، وغير مبال بمستويات الأوكسجين وأعرب مؤثرا، محكم ينظم مستويات الأوكسجين الخلوية مستويات البروتين منطقياً-1α. في نورموكسيا (الأكسجين 21%)، البروتينات منطقياً-1α هي سرعة المتدهورة10،11. ويقدم نصف عمر قصيرة منطقياً--1α في نورموكسيا التحديات التقنية المحددة للكشف عن البروتين من مقتطفات الخلية، وكذلك للتعرف على البروتينات منطقياً-1α-التفاعل. وعلاوة على ذلك، ترانسلوكاتي عدة عوامل النسخ بما في ذلك مجمع منطقياً-1 إلى النواة تحت ظروف التاكسج12،،من1314. يتم تنفيذ معظم الأساليب الحالية المستخدمة للدراسات PPI استخدام overexpression غير الفسيولوجية للبروتينات. قد أبلغت هذه overexpression البروتين يسبب تشوهات الخلوية المختلفة من خلال آليات متعددة بما في ذلك الحمل الزائد للموارد واختلال المقايسة والتفاعلات منحل ومسار التعديل15،16. فيما يتعلق بالدراسات PPI، overexpression البروتين يمكن أن يؤدي إلى سلبية إيجابية، أو حتى كاذبة كاذبة، النتائج اعتماداً على خصائص البروتين ووظائف البروتينات أوفيريكسبريسيد. ولذلك، الأساليب الحالية للدراسات PPI تحتاج إلى تعديل كي تكشف القياسية ذات الصلة فسيولوجيا تحت ظروف التاكسج. قد أثبتنا سابقا بالتفاعل بين منطقياً-1 وعامل النسخ الأسرة Ets GA-ملزمة البروتين (جابب) في التاكسج P19 الخلايا، مما يسهم في رد المروج Hes1 على نقص17. هنا، يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co للدراسة القياسية بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. ويرد كدليل على مفهوم التفاعل بين 1α سكانية وارنت. هذا البروتوكول مناسبة لإثبات أوجه التفاعل بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا المقطع البروتوكول، الذي يستخدم الكلي الجنينية البشرية 293A الخلية (HEK293A)، s يتبع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية في جامعة نانيانغ التكنولوجية، وسنغافورة.
1-تنظيم دورات تعريفية لنقص في الخلايا HEK293A
- إعداد أربعة أطباق 10 سم والبذور 3 – 5 × 106 HEK293A الخلايا الواحدة وطبق في 10 مل دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم، الجلوكوز 4.5 غرام/لتر) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 110 مغ/لتر والبنسلين يو/مليلتر 100 100 مغ/ ستربتوميسين مل. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
ملاحظة: الخلية البذر ينبغي أن يتم في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية (BSC). يجب أن تزول أسطح جميع المواد لتوضع في بكالوريوس العلوم مع الإيثانول 70%. - 24 ساعة بعد البذر، عندما وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 80 – 90%، وضع الأطباق اثنين في سوبتشامبير نقص في الدرج الأمامي الحاضنة (انظر الجدول للمواد) مع % 1 س2 و 5% CO2 في 37 درجة مئوية، وتبقى أطباق أخرى اثنين في نورموكسيا (21% O 2، 5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 4 h. استخدام مجموعة واحدة من الخلايا التاكسج ونورموكسيك لتقييم علاج نقص به لطخة غربية والاستفادة من مجموعة أخرى من الخلايا للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن co.
ملاحظة: يمكن تعيين مستويات الأوكسجين في 0 – 5%، ومدة علاج نقص يمكن أن تختلف تبعاً لنوع الخلية ودراسة الهدف.
2-كل خلية واستخراج النووية
ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على معلومات حول المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول.
-
حصاد الخلايا التحكم نورموكسيا.
- قم بإزالة وسائط الثقافة بالطموح وشطف الخلايا مع 10 مل دببس (PH 7.0-7.2) باستخدام ماصة 10 مل.
ملاحظة: تجنب لمس المونولاير الخلية مع الماصة. أثناء الغسيل، بلطف "الماصة؛" دببس أسفل الجدار للوحة الثقافة الخلية لتجنب فقدان الخلية. - "الماصة؛" 5 مل دببس المثلج إلى اللوحة وكشط الخلايا خارج سطح اللوحة في برنامج تلفزيوني المثلج مع مكشطة خلية.
- نقل تعليق خلية في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والحفاظ على الجليد.
- قم بإزالة وسائط الثقافة بالطموح وشطف الخلايا مع 10 مل دببس (PH 7.0-7.2) باستخدام ماصة 10 مل.
-
حصاد الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج.
- قبل حجته دببس لشروط التاكسج بوضع كشف 1مل 00 تجربة كاشف زجاجة مليئة دببس في سوبتشامبير نقص (1% O2 و 5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 24 ساعة مقدما.
- مكان تقريبا 1 ح قبل الحصاد الخلايا، ونقص العلاج جليد مربع يحتوي على الجليد في تجهيز غرفة الدرج الأمامي، الذي قد تم اكويليبراتيد إلى % 1 س2 و 5% أول أكسيد الكربون2. نقل زجاجة تحتوي على دببس التاكسج متوازن مسبقاً من سوبتشامبير نقص إلى الدائرة تجهيز ووضعه على الجليد.
- 4 ح بعد نقص العلاج، نقل الخلايا من سوبتشامبير نقص إلى دائرة التجهيز الذي تم مسبقاً متوازن إلى % 1 س2 و 5% أول أكسيد الكربون2.
- قم بإزالة وسائط الثقافة بالطموح وشطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل المثلج دببس التاكسج متوازن مسبقاً مع 10 مل "الماصة؛".
- إضافة 5 مل المثلج دببس قبل متوازن مع 5 مل "الماصة؛" وإزاحة الخلايا بالقشط مع مكشطة خلية.
- إمالة لوحة الثقافة الخلية وجمع الخلايا المنفصلة باستخدام ماصة 10 مل. نقل تعليق خلية في دببس في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والحفاظ على الجليد.
- فتح الباب بين المخزن المؤقت لتجهيز دوائر الدرج الأمامي، سواء التي كانت قبل متوازن إلى 1% O2 و 5% CO2. نقل الأنابيب المخروطية 15 مل على الجليد التي تحتوي على خلايا نقص تعامل من تجهيز الدائرة إلى دائرة المخزن المؤقت. فتح باب الغرفة العازلة وإزالة الخلايا تماما من الدرج الأمامي.
- بيليه كلا من الخلايا نورموكسيك من 2.1 والخلايا التاكسج من 2.2 بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
-
تعد الخلية كلها مقتطفات.
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميليلتر من إذاعة المثلج إيمونوبريسيبيتيشن المقايسة (ريبا) تحلل مخزن يحتوي على 50 مم هيدروكلوريد تريسامينوميثاني (تريس-HCl) pH 8.0، كلوريد الصوديوم 150 مم (كلوريد الصوديوم)، تيرجيتول 1% من نوع NP-40 (NP-40)، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5%، و الصوديوم 0.1% دوديسيل كبريتات (SDS)، وتستكمل مع 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل (انظر الجدول للمواد) التي بيبيتينج الكريات خلية صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- نقل ليساتيس الخلية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة مع فورتيكسينج عرضية.
- الطرد المركزي ليساتيس خلية في س 13,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- جمع ميليلتر 50 طافية، اليكووت من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
-
إعداد المقتطفات النووية تستخدم استخراج نووية كيت (انظر الجدول للمواد).
- بلطف ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت NL تستكمل مع 1 x مثبط البروتياز كوكتيل و 0.1 M ديثيوثريتول (DTT) التي بيبيتينج الكريات خلية صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- إضافة 25 ميليلتر من المنظفات حل الحزب الوطني إلى تعليق خلية ودوامه 10 s بأقصى سرعة ممكنة.
- أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- جمع المادة طافية (مقتطفات هيولى)، الكوة ميليلتر 50 من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- ريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على نواة الخلية في 500 ميليلتر من تحلل العازلة NL تكملها مع 1 x مثبط البروتياز كوكتيل و 0.1 م DTT فورتيكسينج ل 5 ق بأقصى سرعة ممكنة.
- الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وحفظ بيليه النووية.
- ريسوسبيند بيليه النووية في 50 ميليلتر من NX1 المخزن المؤقت الاستخراج تكملها مع 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً عدة مرات.
- احتضان 30 دقيقة على الجليد، وفورتيكسينج لمدة 10 ثانية كل 5 دقائق بأقصى سرعة ممكنة.
- أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
-
تحلية مقتطفات النووية.
- جمع المادة طافية من الخطوة 2.5.9 ونقلها إلى أجهزة الغسيل الكلوي مصغرة بحجم الحد أقصى من 100 ميليلتر كل وحدة.
- أجهزة الغسيل الكلوي ميني كاب ووضعها في جهاز التعويم.
- وضع الجهاز التعويم في كوب يحتوي على 500 مل من المخزن المؤقت ليبرد قبل الغسيل الكلوي (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، والغليسيرول 20%، كلوريد البوتاسيوم 100 مم (بوكل)، 0.2 مم الإيثيلين أسيد (يدتا)، 0.2 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف) و 0.5 مم DTT) واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية مع إثارة لطيف.
تنبيه: بمسف من خطرة. تجنب الاتصال المباشر مع الجلد أو الاستنشاق. - جمع العينات من الزاوية لأجهزة الغسيل الكلوي مصغرة ونقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة.
- الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية، الكوة ميليلتر 25 لكل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
3-تقييم علاج نقص بالكشف عن التعبير البروتين وتوطين منطقياً-1α سوبسيلولار
- تحديد تركيز البروتين للخلية كله أو مقتطفات النووية/هيولى استخدام الفحص الميكروسكوبية بيسينتشونينيك الحمضية (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم مجموعة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة18.
- تمييع ليساتيس خلية في المخزن المؤقت عينة x Laemmli 1 التي تحتوي على 5% 2-Mercaptoethanol ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
تنبيه: لا تلمس سطح كتلة التدفئة، حيث أنها قد تسبب الحروق. -
فصل البروتينات بالصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة).
- تحميل كميات متساوية من البروتين (25 ميكروغرام) في كل بئر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجاهزة التدرج الجل (4 – 20%)، جنبا إلى جنب مع 3 ميليلتر علامة الوزن الجزيئي.
- تشغيل الهلام في تشغيل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.5 ملم تريس، 19.2 مم جليكاين، الحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪، PH8.3 لمدة 30 دقيقة في 200 V.
-
نقل البروتينات إلى من الهلام إلى الغشاء النيتروسليلوز.
- تجميع ساندويتش نقل (ورق الترشيح-جل-غشاء-تصفية الورق) مع الهلام على الجانب اﻷنود والغشاء إلى الجانب السالب من الكاسيت.
- ضع الكاسيت في خزان نقل مليئة بنقل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تريسامينوميثاني 2.5 ملم (تريس)، 19.2 مم جليكاين و 20% ميثانول.
تنبيه: الميثانول هو قابل للاشتعال ويجب تخزينها داخل تخزين السوائل القابلة للاشتعال مجلس الوزراء. - القيام بالنقل عن ح 1 في 100 الخامس في غرفة باردة.
- كتلة وصمة عار في 10 مل حظر مخزن يحتوي على 50 مم تريس Cl (درجة الحموضة 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم، والحليب غير الدسم توين 20 و 5% 0.1 ح 1 في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
- احتضان وصمة عار مع الأضداد المضادة-منطقياً-1α (تمييع 1/500) في المخزن المؤقت حظر نفسه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل وصمة عار 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع 50 مل تبس-ت.
- احتضان وصمة عار مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-الجسم المضاد الثانوي مترافق (تمييع 1/1,000) في 10 مل تي تبس التي تحتوي على 5 في المائة غير الدسم الحليب الجاف ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- غسل وصمة عار 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع 50 مل تبس-ت.
- ميكس 500 ميليلتر كل من تشيميلوميسسينت المحسنة (القامة) الكاشف A و B في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ودوامه بإيجاز.
- تطبيق الركيزة مسافنة لوصمة عار واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
-
التقاط إشارات تشيميلومينيسسينت استخدام جهاز اقتران (CCD) نظام التصوير القائم على الكاميرا.
- واستنزاف فائض مسافنة الركيزة لمس حافة الغشاء مع ورقة الأنسجة بوضع الغشاء في حامية ورقة.
- ضع الغشاء الموجود على علبة عينة من اتفاقية مكافحة التصحر نظام التصوير القائم على الكاميرا.
- إطلاق برامج معالجة الصورة (انظر الجدول للمواد)، والتقاط الصور مع الإعدادات التالية: ملف ← جديد بروتوكول ← قناة واحدة ← "إعداد بروتوكول" ← هلام التصوير (التطبيق: Chemi؛ مجال التصوير: الأحيائي راد جل جاهزة؛ التعرض التصوير: البرنامج سوف تحسين تلقائياً وقت التعرض لعصابات مكثفة) ← تشغيل البروتوكول
ملاحظة: وقت التعرض يمكن تعيين يدوياً تحقيق الصور الأمثل.
4-إيمونوبريسيبيتيشن والكشف عن البروتينات إيمونوبريسيبيتاتيد
- أغسل 50 ميليلتر من البروتين سيفاروسي A/G الخرز في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت TBS في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وبيليه الخرز بالطرد المركزي في س 3,000 ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت TBS.
- إضافة 2 ميليلتر من الماوس ارنت مكافحة [مونوكلونل] جسم (1.4 ملغ/مل) أو الماوس "ز الغلوبولين المناعي" (IgG) (1.4 ملغ/مل) الذي أعده تشكيل الماوس 0.7 ملغ مفتش في 500 ميليلتر تبس العازلة.
- وضع أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على الخرز في دوار أنبوب واحتضانها ح 2 10 لفة في الدقيقة في غرفة باردة.
ملاحظة: التعامل مع الأنابيب برفق والحفاظ على تعليق يحتوي على الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب. - بيليه الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل في سوبيرناتانتس.
- تمييع 200 ميكروغرام من البروتين النووي ليستي التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.6.5 في 800 ميليلتر من المخزن المؤقت الملكية الفكرية تتألف من 50 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4)، 180 ملم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 20%، 0.2% مثبط البروتياز NP-40 و 1 x كوكتيل. احتضان مع الخرز إلى جانب الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- بيليه الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل سوبيرناتانتس وتغسل حبات 3 مرات مع 1 مل تبس المثلج يحتوي على 0.2% NP-40.
- يغلي الخرز في 50 ميليلتر لايملي عينة العازلة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي الخرز في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية، وتجاهل الخرز.
ملاحظة: يمكن تخزين المادة طافية في 4 درجات مئوية لفترة قصيرة أو-20 درجة مئوية لفترة طويلة. - الكشف عن وجود 1α منطقياً من مجمعات البروتين إيمونوبريسيبيتاتيد بوصمة عار الغربية كما سبق ذكره في الخطوة 3، 3 فصاعدا.
ملاحظة: غير مطلوب البروتين التحديد الكمي لهذه الخطوة. تحميل حجم كامل (50 ميليلتر) من المادة طافية كل عينة في كل بئر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجاهزة التدرج الجل (4 – 20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم الاستجابة الخلوية لنقص، التعبير تم فحص مستويات والتعريب سوبسيلولار المكونات لعلاج نقص التالية المعقدة منطقياً-1. HEK293A الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج ح 4 أو أبقى في نورموكسيا كعناصر تحكم. تم فحص مستويات البروتين 1α سكانية وارنت في خلية كاملة أو النووية/هيولى مقتطفات من لطخة غربية. ومثلما كانت مستويات منطقياً-1α المتوقعة، ومجموع upregulated من نقص، بينما مستويات ارنت في مجموع ليساتيس الخلوية لم تكن كبيرة تغيير (الشكل 1A). وباﻹضافة إلى ذلك، نقص الناجم عن تراكم النووية 1α سكانية وارنت في الخلايا HEK293A (الشكل 1B)، وما يتسق مع التقارير السابقة، على الرغم من أن التعبير هيولى من ارنت لم يتم الكشف عنه في بعض خطوط الخلية اختبار19.
وبعد ذلك، أثبتنا التفاعل بين 1α سكانية وارنت بعد علاج نقص. أعدت مقتطفات النووي من الخلايا HEK293A يتعرض إلى نورموكسيك أو ظروف التاكسج لتجارب 4 h. إيمونوبريسيبيتيشن Co أجريت باستخدام مقتطفات النووي من الخلايا HEK293A. كما هو مبين في الشكل 2، كان منطقياً-1α إيمونوبريسيبيتاتيد co جنبا إلى جنب مع ارنت من المقتطفات النووية التاكسج HEK293A الخلايا.
مجتمعة، وصف يمكن بنجاح استخدام البروتوكول للحث على رد التاكسج في الخلايا، وكذلك تحديد ملزمة البروتين الفيزيولوجية من اندوجينوسلي أعرب عن مجمعات سكانية-1α/ارنت داخل النواة.
رقم 1: تنظيم التعبير البروتين والتعريب سوبسيلولار عناصر سكانية-1 بنقص- (أ) تحليل Immunoblot مجموع التعبير 1α سكانية أو ارنت في الخلايا HEK293A. كانت تتعرض لنقص ح 4 (ح) الخلايا أو الاحتفاظ بها في نورموكسيا (N). البروتينات من مقتطفات كامل الخلية مفصولة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة وتحليلها بواسطة immunoblotting مع مكافحة-منطقياً-1α ومكافحة ارنت والأجسام المضادة جليسيرالديهيدي 3-الفوسفات نازعة (جابده). واستخدمت كعنصر تحكم تحميل جابده. (ب) تحليل إيمونوبلوت التعبير 1α سكانية وارنت في الكسور سوبسيلولار الخلايا HEK293A. HEK293A الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج ح 4 (ح) أو أبقى في نورموكسيا (N). 25 ميكروغرام من البروتين من مقتطفات النووية أو هيولى تم تحليلها بواسطة immunoblotting استخدام مكافحة-منطقياً-1α، ارنت مكافحة، ومكافحة يين ويانغ 1 (YY1) والأجسام المضادة-جابده. واستخدمت YY1 وجابده كتحميل عناصر التحكم للكسور النووية وحشوية، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: 1α سكانية ويتفاعل مع ارنت تحت ظروف التاكسج. كانت تتعرض لنقص ح 4 خلايا HEK293A أو أبقى في نورموكسيا كعناصر تحكم. النووية أعدت مقتطفات من الخلايا HEK293A وأجريت إيمونوبريسيبيتيشنز باستخدام جسم ارنت المضادة. النووية مقتطفات (مدخلات) وتم تحليل البروتينات إيمونوبريسيبيتاتيد التي إيمونوبلوتينج باستخدام الأجسام المضادة-منطقياً-1α ومكافحة ارنت ومكافحة YY1. YY1 استخدمت كعنصر تحكم تحميل للمدخلات في حين استخدمت مفتش مراقبة سلبية للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن co. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الحل | المكونات | تعليقات |
| المخزن المؤقت للغسيل الكلوي | 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4)، 20% والغليسيرول، 100 ملم بوكل، يدتا 0.2 مم، بمسف 0.2 و 0.5 ملم DTT | إضافة بمسف و DTT فورا قبل الاستخدام. |
| المخزن المؤقت قيد التشغيل | 2.5 مم تريس-HCl (PH 8.3)، 19.2 مم جليكاين والحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪ | مزيج 100 مل 10 × تريس/جليكاين/الحزب الديمقراطي الصربي المخزن المؤقت مع 900 مل ddH2o. |
| نقل المخزن المؤقت | 2.5 مم تريس-HCl (PH 8.3)، جليكاين 19.2 مم و 20% ميثانول | مزيج 100 مل 10 × تريس/جليكاين المخزن المؤقت مع الميثانول 200 مل و 700 مل ddH2o. |
| TBS المخزن المؤقت | تريس-Cl (درجة الحموضة 7.6) 50 مم و 150 مم كلوريد الصوديوم | يخلط المخزن المؤقت x TBS 100 مل 10 مل 900 ddH2o. |
| المخزن المؤقت تبس-T | 50 مم تريس Cl (درجة الحموضة 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم و 0.1% 20 توين | مزيج 100 مل 10 x TBS المخزن المؤقت مع 900 مل ddH2س و 1 مل 20 توين. |
| المخزن المؤقت لحظر | 50 مم تريس Cl (درجة الحموضة 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم، والحليب الخالي من الدسم توين 20 و 5% 0.1% | حل 5 غ من "مانع" الصف نشاف في 100 مل تي تبس المخزن المؤقت. |
| المخزن المؤقت للملكية الفكرية | 50 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4)، 180 ملم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 20%، 0.2% مثبط البروتياز NP-40 و 1 x كوكتيل | إضافة كوكتيل مثبط البروتياز فورا قبل الاستخدام. |
الجدول 1: إعداد الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مجمع منطقياً-1 هو منظم رئيسي للتوازن الأكسجين الخلوية وينظم عدد كبير جينات المشتركة في الاستجابات التكيفية الخلوية المختلفة لنقص. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 رواية مهم لفهم توصيل الإشارة التاكسج. تجارب Co-إيمونوبريسيبيتيشن تستخدم عادة للدراسات القياسية لتحديد مسارات توصيل الإشارات الخلوية. ومع ذلك، overexpression البروتين يستخدم على نطاق واسع وقد يؤدي هذا إلى التحف التجريبية. وباﻹضافة إلى ذلك، منطقياً-1α بروتين غير مستقرة ويصبح سرعة المتدهورة من خلال إعادة الأوكسجين11. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي نقص النووية إزفاء عناصر سكانية-1 في خطوط خلايا الثدييات الأكثر. ولذلك، يلزم البروتوكولات التقليدية co-إيمونوبريسيبيتيشن الأمثل للتعرف على الناحية الفسيولوجية ذات الصلة منطقياً-1 البروتينات المتفاعلة بعد علاج نقص. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تعديل co-إيمونوبريسيبيتيشن يستخدم لإظهار التفاعل بين 1α سكانية وارنت في نقص.
لتجنب تدهور منطقياً-1α أثناء إعادة الأوكسجين، كانت حصاد الخلايا التاكسج داخل الدائرة بتجهيز الدرج الأمامي الحاضنة التي تمت قبل متوازن لظروف التاكسج. كان اكويليبراتيد المخزن المؤقت أغسل دببس أيضا إلى ظروف التاكسج قبل الاستخدام. إذا كان هناك لا نقص محطة العمل المتاحة للمعالجة، ويمكن غسلها مع دببس التاكسج متوازن قبل الخلايا التاكسج وتحصد بعد ذلك بسرعة على الجليد. إذ ترى أن يمكن أن يؤدي نقص إزفاء النووية عناصر سكانية-1 وأن overexpression البروتين قد تؤدي النتائج أرتيفاكتوال، استخدمت البروتينات النووية الذاتية في هذا البروتوكول. استخدام مقتطفات النووية في البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co كما تم الإبلاغ عن20آخرين. وهو يمثل ميزة تقنية لدراسة التفاعلات بين البروتينات النووية، نظراً لأنه يقلل من فرصة للبروتينات النووية من يجري تضعف بها بكامل الخلية البروتينات. وعلاوة على ذلك، استخدام مقتطفات النووية قد تكون مفيدة للحد التفاعلات غير محددة، لا سيما من وفرة عالية البروتينات هيولى غير ذات صلة، وإلى تحسين الاستقرار النووي البروتين بالتقليل من التعرض إلى البروتياز الموجودة في السيتوبلازم. استخدام مقتطفات النووية الذاتية بدلاً من خلية كاملة مقتطفات للشركة-إيمونوبريسيبيتيشن يظهر تحسن تقني كبير، كما يمكننا فقط الكشف عن التفاعل بين منطقياً-1α و GABPα باستخدام مقتطفات النووية الذاتية ولكن لا تستخدم كل مقتطفات الخلية17.
في بروتوكول وصف، ويمكن أن يكون كذلك الأمثل عدة شروط لتحسين النتائج. نحن الناجم عن نقص في الخلايا HEK293A بمعاملتها مع الأكسجين 1% ح 4. ومع ذلك يمكن متنوعة لأنواع مختلفة من الخلايا مستويات الأوكسجين ومدة علاج نقص وتعديلها وفقا لأهداف الدراسة. على سبيل المثال، 1α سكانية ومنطقياً-2α يمكن الأثران ينظمها نقص بطريقة محددة نوع خلية، مما يدل على أدوار متميزة في مختلف السياقات البيولوجية. قد تبين أن في خلايا neuroblastoma، منطقياً-1α الأكثر نشاطا خلال فترات قصيرة من نقص شديد (1% O2)، بينما 2α سكانية نشطة أيضا تحت نقص معتدل (5% O2) وتصبح أكثر نشاطا في المعاملة نقص مزمن التالية (48 – 72 ساعة من التعرض التاكسج)21. 0-5 مستويات2% O تستخدم عادة لعلاج نقص في المختبر ، حيث 1 – 5% س2، 0.1 – 1% O2 و 0 – 0.1% O2 كثيرا ما تعرف بأنها خفيفة نقص ونقص أكسجين، على التوالي22. تركيز الملح هو معلمة أخرى تتطلب التحسين، خصوصا وأنها تلعب دوراً حاسما للتفاعلات الأيونية في القياسية23. واستخدمت في هذه الدراسة مقتطفات النووية مع البروتينات النووية المستخرجة عادة استخدام عازلة التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح. ولذلك، مقتطفات النووية قد تكون ديسالتيد قبل التجارب co-إيمونوبريسيبيتيشن. هنا، نحن ديسالتيد المقتطفات النووية باستخدام مخزن مؤقت الغسيل الكلوي التي تحتوي على 100 مم بوكل، وتمتزج مقتطفات دياليزيد المخزن المؤقت IP يحتوي على 180 ملم كلوريد الصوديوم التناسب لتحقيق تركيز ملح نهائي ما يقرب من 150 مم، ومماثلة فسيولوجية الشروط القياسية داخل الخلايا. يمكن تعديل تركيز الملح النهائي تبعاً للخصائص القياسية للفائدة. واستخدمت في هذا البروتوكول، جابده كعنصر تحكم تحميل مقتطفات الخلية كلها والكسور هيولى. ونحن لم يلاحظ أي تأثير التنظيمية الهامة الناجمة عن نقص على التعبير جابده في الخلايا HEK293A. ومع ذلك، جابده سابقا قد ثبت أن يكون upregulated من نقص في بعض أنواع الخلايا24. مع هذا في الاعتبار، واحدة قد تحتاج إلى استخدام البديل المناسب تحميل عناصر التحكم عند الضرورة25. بشكل منفصل، لاحظنا قدرا كبيرا من خلفية إشارة نابعة من الخرز أو الأجسام المضادة المستخدمة في البروتوكول الحالي. للحد من الخلفية، يمكن للمرء إطالة خطوات الغسيل (10 – 15 دقيقة) أو أداء يغسل 3 أكثر من (5 – 10 مرات). بدلاً من ذلك، يمكن أيضا زيادة قوة الأيونية المخزن المؤقت أغسل بالمعايرة تركيز الملح من 150 إلى 500 مم خلال يغسل. يمكن أيضا يتم مسح ليساتيس مسبقاً بحضانة مع البروتين سيفاروسي A/G الخرز ح 1 في 4 درجات مئوية بالتناوب.
ويقتصر على مقتطفات النووية هذا البروتوكول وعلى هذا النحو قد لا تكون مناسبة لدراسة القياسية داخل مقصورات الخلوية الأخرى مثل الميتوكوندريا وهيولي. مماثلة لغيرها من البروتوكولات التقليدية co-إيمونوبريسيبيتيشن، لا يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة القياسية في الوقت الحقيقي أو لتحديد ما إذا كانت القياسية مباشرة أو غير مباشرة.
وباختصار، نحن نقدم بروتوكول تعديل co-إيمونوبريسيبيتيشن للتعرف على رواية البروتينات المتفاعلة ذات الصلة فسيولوجيا منطقياً-1. هذا البروتوكول أيضا مناسبة لدراسة التفاعلات بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصا للتجارب co-إيمونوبريسيبيتيشن تحت ظروف نقص، يمكن استخدام جزء من بروتوكول وصف للخلايا التحكم نورموكسيا أيضا لدراسة القياسية النووية تحت ظروف نورموكسيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونشكر أستاذ مشارك الخطيئة أونغ تيونغ لاستخدام محطة العمل نقص. أيد هذا العمل ما يلي: سنغافورة وزارة التعليم، وزارة التربية والتعليم 1T1-02/04 و MOE2015-T2-2-087 (إلى Y.A.)، لي كونغ عجزا كلية الطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية بدء المنحة M4230003 (إلى p.o.b.)، "مجلس البحوث السويدية"، مؤسسة بيرسون إرلينغ الأسرة، مؤسسة نوفو نورديسك، Stichting af مؤسسة جوتشنيك والرابطة السويدية لمرض السكري، وشركة التأمين وكالة، وأبحاث السكري ومؤسسة العافية، ومؤسسة مرسى فون كانتزوو، برنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في معهد كارولينسكا، المنسق منسق الإغاثة الطارئة-2013-مساعد المدير العام 338936-بيتالماجي، ومؤسسة والنبرغ أليس كنوت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
