Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.
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Artigo de método
Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção
Neste artigo
Resumo
Resumo
Anticorpos, também denominados como diferenciados de imunoglobulinas (Ig), secretadas por linfócitos B, células plasmablasts/plasma, na imunidade humoral fornecem uma formidável defesa contra a invasão de agentes patogénicos através de diversos mecanismos. Um dos principal objetivos da vacinação é induzir proteção anticorpos antígeno-específicos para prevenir infecções fatais. Timo-dependentes (TD) e antígenos de Timo-independente (TI) podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) bem como a geração de células B de memória com a ajuda fornecido por apresentadoras de antígenos (APCs) de células. Aqui, descrevemos um protocolo para caracterizar TD e TI Ig isotipo respostas em ratos utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com antígenos conjugados hapteno modelo TNP-KLH (em alum) e TNP-polissacarídeo (em PBS), respectivamente. Para induzir resposta de memória TD, uma imunização de reforço do TNP-KLH em alum é dado em 3 semanas após a primeira imunização com o mesmo antígeno/adjuvante. Soros de mouse são colhidos em pontos diferentes de tempo, antes e após a imunização. Total de níveis de Ig de soro e anticorpos específicos TNP são posteriormente quantificados usando o Ig isotipo específico sanduíche e ELISA indireta, respectivamente. Para corretamente quantificar a concentração de soro de cada isotipo Ig, as amostras devem ser apropriadamente diluído para caber dentro da escala linear das curvas padrão. Usando este protocolo, consistentemente obtivemos resultados confiáveis com sensibilidade e alta especificidade. Quando usado em combinação com outros métodos complementares tais como citometria de fluxo, em vitro cultura de esplênica de células B e imuno-histoquímica coloração (IHC), este protocolo permitirá aos pesquisadores uma compreensão abrangente do anticorpo respostas em um determinado ambiente experimental.
Introdução
Os linfócitos B são o principal jogador na imunidade humoral e o único tipo de célula em mamíferos que são capazes de produzir anticorpos, também denominados como imunoglobulinas (Ig)1,2. Anticorpos secretados pelas células B fornecem uma formidável defesa contra patógenos através de diversos mecanismos, incluindo a neutralização, opsonização e ativação do complemento, levando a imunidade protetora3a invadir. Secreção de anticorpos pelas células B só é alcançada após a ativação completa das células B específicas, que normalmente requer que duas distintas sinaliza3
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética institucional pesquisa animal da Universidade de Rutgers. Todos os mouses são utilizados em conformidade com as diretrizes do NIH e sob um animal protocolo aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. preparação dos ratos e coleção de ingênuo Mouse Sera
- Manter todos os ratos para experimentos de imunização em uma determinada instalação livre de patógeno animal.
- Nocaute de gênero de correspondência, jovem adulto (8-12 semanas de idade) de uso e littermate controle de ratos que têm os mesmos pais e gaiolas para estudos de imunização.
- Plane....
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Resultados
Nós usamos este protocolo para investigar as funções de um regulador crítico do sistema imunológico, TRAF3, em TI e TD Ig isotipo respostas9,10,11. TRAF3, directa ou indirectamente regula a transdução de sinal de um número de receptores imunes inatos e adaptativos, incluindo a superfamília de receptores TNF, receptores Toll-like e T celular receptor/CD28, entre outros27
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Discussão
Aqui, descrevemos o protocolo para a caracterização de TD e TI Ig isotipo respostas nos ratos usando ELISA. Sucesso da implementação do presente protocolo requer o uso de materiais especificados na tabela 1, incluindo placas de ensaio de ELISA, imunização Ags, anticorpos de isotipo específico do Ig e padrões. Deve ter cuidado para evitar o uso de placas de cultura de tecidos tratada por ELISA. Diluições dos padrões e amostras de soro devem ser feitas em chapas separadas não tratadas (fundo redondo) e em .......
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Divulgações
Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de subsídios saúde R01 CA158402 (P. Xie) e R21 AI128264 (P. Xie), o departamento de defesa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), um prêmio de piloto o Cancer Institute de New Jersey através do Grant número P30CA072720 do Instituto Nacional de câncer (P. Xie), uma concessão biomédica Busch (P. Xie), uma bolsa de Victor Stollar (a. leite) e um B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Leitor de microplacas sintonizáveis VersaMax | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipamento para leitura de chapas |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | Software SOFTmax PRO 5.3 | para leitor de chapas |
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software para gráficos e estatísticas |
| TNP-AECM-polissacarídeo (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag para imunização |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag para imunização |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (taxa de conjugação: 38) | Revestimento Ag para ELISA TNP |
| (3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 específico para TNP (taxa de conjugação: 3) | Revestimento Ag para alta afinidade TNP-específico |
| Ig Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Adjuvante de alúmen para imunização |
| Tubos de polipropileno Falcon | Fisher Scientific | 14-959-11A | Para incubação de TNP-KLH/alum |
| BD Seringa de Insulina | Fisher Scientific | 14-829-1B | Para injeção i.p. de camundongos |
| Placas Imunológicas de 96 Poços, Fundo Plano | Fisher Scientific | 14-245-61 | Para |
| microplacas de 96 poços não tratadas ELISA, fundo redondo | VWR | 82050-622 | Para diluições em série de padrões e amostras |
| Substrato de fosfatase, comprimidos de 5 mg Sigma | S0942-200TAB | Substrato AP | |
| Dietanolamina | VWR | IC15251690 | Um componente do tampão de substrato AP |
| Cabra anti-rato IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Captura Ab para camundongo IgM |
| Cabra anti-rato IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Captura Ab para camundongo IgG1 |
| Cabra anti-rato IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Captura Ab para camundongo IgG2a |
| Cabra anti-rato IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Captura Ab para camundongo IgG2b |
| Cabra anti-rato IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Captura Ab para rato IgG3 |
| Cabra anti-rato IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Captura Ab para rato IgA |
| Cabra anti-rato IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Captura Ab para rato IgE |
| AP-Cabra anti-rato IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detecção Ab para rato IgM |
| AP-Cabra anti-rato IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detecção Ab para rato IgG1 |
| AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detecção Ab para camundongo IgG2a |
| AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detecção Ab para camundongo IgG2b |
| AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detecção Ab para camundongo IgG3 |
| AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detecção Ab para mouse IgA |
| AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detecção Ab para camundongo IgE |
| IgM de camundongo padrão | BD Biosciences | 553472 | IgM específico para TNP, Clone G155-228 |
| Mouse IgG1 padrão | BD Biosciences | 554054 | IgG1 específico para TNP, Clone 107.3 |
| Mouse IgG2a padrão | BD Biosciences | 556651 | IgG2a específico para TNP, Clone G155-178 |
| Camundongo IgG2b padrão | BD Biosciences | 554055 | IgG2b específico para TNP, Clone 49.2 |
| Camundongo IgG3 padrão | BD Biosciences | 553486 | IgG3 específico para KLH, Clone A112-3 |
| IgA de camundongo padrão | BD Biosciences | 550924 | IgA induzida por óleo mineral, Clone MOPC-320 |
| IgE de camundongo padrão | BD Biosciences | 557079 | IgE específica para TNP, Clone C38-2 |
Referências
- Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
- Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
- Murphy, K.
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Reimpressões e permissões
