Summary
Bèta-cel functie is belangrijk voor de homeostase van de bloedglucose, die bij eencellige resolutie met behulp van een genetisch gecodeerde verslaggever voor calcium toestroom wordt geëvalueerd.
Abstract
Alvleesklier beta-cellen reageren op de toenemende bloed glucose concentraties door afscheidende het hormoon insuline. De disfunctie van de beta-cellen leidt tot hyperglycemie en ernstige, levensbedreigende gevolgen. Inzicht in de werking van de beta-cellen onder fysiologische omstandigheden en welke factoren van genetische en omgevingsfactoren kunnen hun disfunctie kan leiden tot betere behandelingsopties voor diabetische patiënten. De mogelijkheid voor het meten van het calciumgehalte in beta-cellen fungeert als een belangrijke indicator voor bèta-cel functie, als de toestroom van calcium ionen triggers insuline. Hier beschrijven we een protocol voor het toezicht op de toestroom van de glucose-gestimuleerd calcium in zebrafish beta-cellen met behulp van GCaMP6s, een genetisch gecodeerde sensor van calcium. De methode zorgt voor de opvolging van de dynamiek van intracellulair calcium met eencellige resolutie in ex vivo gemonteerd eilandjes. Het glucose-reactievermogen van de beta-cellen binnen de dezelfde islet kan worden vastgelegd gelijktijdig onder verschillende glucose concentraties, die de aanwezigheid van functionele heterogeniteit onder zebrafish beta-cellen suggereert. Bovendien is de techniek biedt hoge temporele en ruimtelijke resolutie, die de oscillerende aard van de instroom van calcium op glucose stimulatie onthult. Onze benadering opent de deuren voor het gebruik van de zebravis als model te onderzoeken van de bijdrage van genetische en omgevingsfactoren factoren naar bèta-cel functie en dysfunctie.
Introduction
Onze bloed-glucose wordt onderhouden in een smalle bandbreedte, voor een groot deel te wijten aan de functie van de endocriene alvleesklier. De endocriene functie van de alvleesklier wordt uitgevoerd door de eilandjes van Langerhans, die hormoon-afscheidende cellen bevatten. De insuline-afscheidende beta-cellen zijn verantwoordelijk voor het verminderen van de niveaus van de bloedglucose na een maaltijd van koolhydraten bevatten. Onvoldoende insuline secretie van bèta-cel kan leiden tot diabetes1, dat wordt gekenmerkt door aanhoudende hoge bloedglucose. Type 1 en Type 2 Diabetes, die momenteel meer dan 400 miljoen mensen wereldwijd treft, leidt tot de morbiditeit en mortaliteit2. Door onderzoek naar de moleculaire en ecologische factoren die aan bèta-cel dysfunctie bijdragen, zullen wij beter begrijpen hoe diabetes type 2 begint en vordert. Daarnaast bieden de mogelijkheid om te differentiëren van menselijke stamcellen in functionele beta-cellen in vitro een bron van nieuwe bèta-cellen voor cel-vervangende therapieën bij Type 1 Diabetes. Te dien einde is het belangrijk om te studeren van bèta-cel functie en rijping in genetische modelorganismen om te krijgen de nodige kennis voor het maken van functionele beta-cellen in een schotel.
Bèta-cel functie kan worden gecontroleerd op het niveau van de gehele-islet door het kwantificeren van de totale hoeveelheid insuline afgescheiden in reactie op glucose-stimulatie. Deze cumulatieve benadering bestudeert het rotseilandje als een enkele groep cellen zonder differentiatie van de afzonderlijke eigenschappen van een cel. Echter bleek de analyse van de glucose reacties van afzonderlijke bèta-cellen een diversiteit in de functionele eigenschappen van de beta-cellen en de aanwezigheid van heterogeniteit3. Om te beoordelen van de functie van individuele beta-cellen, is het mogelijk om te controleren de intracellulaire veranderingen die tot insuline secretie4 leiden. Insuline secretie wordt voorafgegaan door een vermelding van glucose in de beta-cellen. De glucose die in de beta-cellen invoert wordt snel gemetaboliseerd aan ATP. Hogere intracellulaire concentraties van ATP verkleinen de kans op open ATP-gevoelige kalium ionenkanalen leidt tot bèta-cel depolarisatie. Depolarisatie wordt geopend van de spanning-gevoelige calcium ionenkanalen en verhoogt van intracellulair calcium. Op zijn beurt activeert calcium exocytose van insuline, die is uitgebracht in het verkeer en verlaagt glucoseniveaus door het stimuleren van glucose-gebruik5,6,7.
Verschillende strategieën hebben toegepast voor het onderzoek naar de functie van de beta-cellen, met inbegrip van monitoring van het membraan potentiële8, de directe visualisatie van insuline-blaasjes exocytose9en kwantificering van intracellulaire Ca2 + toestroom als een proxy voor glucose-reactievermogen10. Onder hen biedt beeldvorming van intracellulaire Ca2 + het voordeel van opschalen de analyse op meerdere individuele cellen binnen de dezelfde islet11,12, waardoor directe vergelijking van de glucose-reactie tussen individuele beta-cellen. Intracellulaire Ca2 + concentratie kan met calcium-gevoelige fluorescente kleurstoffen13 of14indicatoren (GECIs) genetisch-gecodeerde calcium worden gecontroleerd. Overwegende dat de calcium-indicator kleurstoffen ontbreken celtype specificiteit, GECIs kan worden uitgedrukt in een bepaalde celtype door specifieke initiatiefnemers. Daarnaast biedt de nieuwe generatie van GECIs, zoals GCaMP6, beter signal-to-noise verhouding samen met sneller temporal dynamics15. Hier beschrijven we het nut van de nieuwe generatie van GECIs, in het bijzonder GCaMP6s, te visualiseren van calcium in de beta-cellen bij eencellige resolutie. We toepassen deze methode op de primaire eilandje van de zebravis als ons model van keuze. Tijdens de ontwikkeling van het embryo, beta-cellen in de primaire islet zijn afkomstig uit de dorsale en ventrale alvleesklier ontluikt16. Het primaire eilandje ligt op een stereotiepe anatomische positie binnen de zebravis alvleesklier, waardoor haar gemakkelijke identificatie en isolatie. Beta-cellen in de primaire islet zijn nodig om glucose-verordening, omdat hun genetische ablatie tot hyperglycemie17,18 leidt. Bovendien worden deze beta-cellen glucose-responsieve tijdens de vroege ontwikkeling van de zebravis19. Dit protocol kan ook worden toegepast op de secundaire eilandjes, die tijdens de post embryonale stadia vormen imaging. Het protocol kan beeld beta-cellen ex vivo, in latere stadia van ontwikkeling en onder gedefinieerde glucose concentraties.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Animal Welfare Act en met toestemming van de Landesdirektion Sachsen, Duitsland (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. voorbereiding
Opmerking: Dit protocol is voor ex vivo beeldvorming van de primaire islet zebrafish van dubbele transgene Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); GS (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. In deze transgene lijn, de insuline-promotor (ins) rijdt de specifieke expressie bèta-cel van de twee transgenen: nls-Renilla-mKO2, die de kern van de beta-cellen met monomere Kusabira oranje 2 (mKO2) markeert fluorescentie; en GCaMP6s15, die stoot groene fluorescentie in reactie op de stijging van de intracellulaire calciumgehalte. De bèta-cel-specifieke uitdrukking van GCaMP6s kan bestuderen van het glucose-reactievermogen van de beta-cellen zonder inmenging van calcium veranderingen in het omringende celtypes.
- Bereiden van verse fibrinogeen voorraad (10 mg/mL) door het oplossen van 10 mg van boviene fibrinogeen in 1 mL Ca2 +/Mg2 +-met Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een centrifugebuis 1,5 mL. Vortex krachtig tot het fibrinogeen poeder lost volledig. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten meer.
Opmerking: De voorraad kan worden bewaard bij kamertemperatuur voor 2 – 3 h. negeren de voorraad als de oplossing begint te polymeriseren en viskeuze wordt. - Bereid de fibrinogeen werkende oplossing (3.3 mg/mL) door verdunning van de voorraad van fibrinogeen drieledig in HBSS. Bijvoorbeeld, Meng 300 µL van fibrinogeen voorraad in 600 µL van HBSS te bereiden 900 µL van fibrinogeen werkende oplossing.
- Bereid trombine-oplossing (10 U/mL) door ontbinding 10 eenheden van trombine in 1 mL HBSS of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
Opmerking: Deze oplossing kan worden voorbereid, aliquoted in 50 µL delen en bevroren bij-20 ° C. - 200 mM D-glucose oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1,8 g van D-Glucose in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag.
- 300 mM KCl oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1.1 g van KCl in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag.
- Aanschaffen van 35 mm diameter glas-onderkant gerechten voor de montage van de eilandjes.
- Gebruik voor de dissectie en de montage van het eilandje, een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en rood filter kubus (TRITC: excitatie: 532 – 554 nm, emissie: 570 – 613 nm; of Texas-rood: excitatie: 540-580 nm, emissie: 592-667 nm).
- Voor de beeldvorming van de calcium instroom in bèta-cellen, gebruik een omgekeerde confocal microscoop (Zeiss LSM 780 of gelijkaardig) met 20 X (0.8 nvt) lucht doelstelling en uitgerust met een plaat houder voor de 35 mm diameter glas-onderkant gerechten.
- Voorbereiden op een 200 mg/L-oplossing van tricaïne methaan sulfonaat (MS222) euthanizing de zebravis.
- 90 mm petrischalen aanschaffen voor de zebravis dissectie.
2. de zebravis primaire Islet dissectie en montage
- Euthanaseren een vis langdurige incubatie met MS222. Voor dit, zachtjes verwijderen de vissen uit de vissentank met behulp van een visnet en Incubeer het in een petrischaal met de oplossing van de MS222 totdat het dier toont geen beweging van de operculaire (kieuwen); typisch, dit duurt 5 min. overdracht de vis naar een petrischaal met de HBSS oplossing met Ca2 +/Mg2 +.
-
Ontleden onder een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en een rood filter kubus, de huid die betrekking hebben op de rechterkant van de buik van het dier te isoleren van de alvleesklier.
- Snijd de huid van de zebravis van mond naar anaalvin met scherpe pincet hiervoor. Schil weg de gesneden huid blootstellen van de buik; Deze snipping bloot de interne organen. Met behulp van de rode fluorescentie van mKO2 expressie in de beta-cellen, gaan de locatie van de eilandjes door visueel onderzoek onder de Microscoop. Verwijder zo nodig de lobben van de lever, zoals zij betrekking op het rotseilandje hebben kunnen, waardoor het moeilijk te vinden.
Opmerking: De primaire eilandje ligt in de buurt van de voorste regio van de buik, meestal aan de rechterkant.
- Snijd de huid van de zebravis van mond naar anaalvin met scherpe pincet hiervoor. Schil weg de gesneden huid blootstellen van de buik; Deze snipping bloot de interne organen. Met behulp van de rode fluorescentie van mKO2 expressie in de beta-cellen, gaan de locatie van de eilandjes door visueel onderzoek onder de Microscoop. Verwijder zo nodig de lobben van de lever, zoals zij betrekking op het rotseilandje hebben kunnen, waardoor het moeilijk te vinden.
- Reinig de primaire islet door het zorgvuldig verwijderen van omliggende weefsel zoals lever en adipocytes. Het nemen van voorzorgsmaatregelen niet te verwonden of steken van het rotseilandje; na verrekening van het omringende weefsel, worden de afzonderlijke cellen op het oppervlak van het eilandje waarneembaar.
- Pipetteer een druppel van de 30 µL van HBSS in het midden van een glazen-bodem schotel. De ontleed islet overbrengen in deze daling.
- Grondig wassen het rotseilandje eenmaal met HBSS en eenmaal met 30 µL van de werkoplossing fibrinogeen (3.3 mg/mL). Zorg ervoor om te voorkomen dat het drogen van het eiland tijdens de stappen wassen omdat het niet te doen leidt tot celdood.
- Voeg toe 10 µL van de trombine oplossing (10 U/mL) langzaam en voorzichtig. Ongewijzigd te laten het eilandje en de schotel voor 15-20 min. Let op dat de daling van de fibrinogeen-trombine viskeuze en enigszins dekkend op dit punt zal worden.
3. Ex Vivo wonen-imaging van GCaMP-intensiteit van de fluorescentie in Zebrafish primaire eilandjes
- Voeg 200 µL van HBSS op de top van de schimmel en zet de schotel voorzichtig aan de houder van de plaat van de confocal microscoop. Gebruik een 20 X 0.8 nb, lucht doelstelling voor confocal imaging. Zoek het eilandje met behulp van de optie helderveld.
- Met behulp van het filter voor rode fluorescentie te bekijken van de nucleaire mKO2-fluorescentie in beta-cellen, richten op het eilandje. Individuele kernen moet duidelijk zichtbaar zijn.
- Zoek een duidelijke imaging vliegtuig door handmatig het brandvlak van de confocal microscoop zodat het doorlopen van de dikte van het eiland langs de z-as te wijzigen. Ervoor zorgen dat de beeldvorming vliegtuig voldoende (50-100) van beta-cellen voor imaging bevat, en de helderheid van de nucleaire mKO2-fluorescentie uniform, met name in het midden van het eilandje is.
- Instellen van een sequentiële aanwinst voor GCaMP6s en mKO2 fluorescentie met behulp van de volgende instellingen in het "Smart configuratiemenu": GCaMP6s, excitatie: 488 nm, emissie: 500 – 555 nm, onwaar-kleur: groen (Selecteer "GFP"); mKO2, excitatie: 561 nm (mCherry), emissie: 570 – 630 nm, onwaar-kleur: rood (Selecteer "mCherry").
Opmerking: Met deze instelling, het rode kanaal behaalt de positie van bèta-celkernen, terwijl het groene kanaal de intensiteit van de fluorescentie GCaMP behaalt. - Resolutie van de afbeelding instellen op 1024 x 1024 pixels, snelheid op 10 en gemiddeld op 1 in de "overname Mode". Geïnitieerde een continu opnemen door de optie voor "Time-serie" en de "duur" voor 500 cycli, met ongeveer 2 s overname keer per frame in te stellen.
Opmerking: De eerste 50 frames van de tijd-serie overeen met de activiteit van de beta-cellen met glucose gehalte van 5 mM. Dit is de reactie van de basislijn. Een reagerende bèta-cel zal tonen wassende en afnemende in de intensiteit van de groene fluorescentie met tijd. Wij hebben geconstateerd dat een paar (1-5%) van de beta-cellen op 5 mM glucose oscilleren. -
Houd een oogje op de imaging cyclus. Na de eerste 50 frames, verhogen de concentratie glucose van de omringende oplossing tot 10 mM zonder het stoppen van de opname.
- Zonder storing veroorzaakt de Beeldacquisitie, zachtjes Pipetteer 5 µL van de 200 mM D-glucose oplossing op de top van de gel houden van het eilandje. Verwerven van 150 frames aan 10 mM glucose.
Opmerking: De toename van de concentratie van glucose zal toenemen met het aantal bèta-cellen ondergaan GCaMP fluorescerende oscillaties in het groene kanaal. - Erop toezien dat de kernen van de cellen stabiel tijdens het proces blijven. Als het eilandje te uitgebreid tijdens de overname schudden is en de kernen zijn verhuizen van het brandvlak, gooi het monster (indien nodig).
- Wacht een voldoende lange periode van polymerisatie van de schimmel fibrinogeen-trombine tijdig met het oog op de stabiliteit van de latere monsters.
- Zonder storing veroorzaakt de Beeldacquisitie, zachtjes Pipetteer 5 µL van de 200 mM D-glucose oplossing op de top van de gel houden van het eilandje. Verwerven van 150 frames aan 10 mM glucose.
- Bij 200 kaders, verdere verhoging de concentratie van de oplossing tot 20 mM door zachtjes pipetteren 10 µL van de 200 mM D-glucose-oplossing. Verwerven van 150 frames voor de concentratie van 20 mM.
- Depolarize na 350 frames, het eilandje met behulp van 30 mM van KCl. Voeg 20 µL van de 300 mM KCl stockoplossing hiervoor. In dit stadium, vaststellen dat de GCaMP6s fluorescentie oscillaties zal stoppen en met een hoge intensiteit repareren; beta-cellen die niet op glucose reageren kunnen ook een toename in groen-fluorescentie intensiteit op KCL toevoeging weergeven.
4. kwantificering van GCaMP fluorescentie Trace voor afzonderlijke Beta-cellen
Opmerking: Als u wilt traceren en kwantificeren van de reacties van individuele beta-cellen op verschillende niveaus van de glucose, kwantificeren de intensiteit van de fluorescentie GCaMP voor de gehele periode van de beeldvorming. Kwantificering gebeurt in cellulaire resolutie. Hiervoor gebruik van FIJI20 om de intensiteitswaarden van de fluorescentie van de GCaMP uit de beelden (stappen 4.1-4.6), en de spreadsheet-software of de R21 voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.8 – 4,9).
- Open het afbeeldingsbestand in FIJI met behulp van de "LSM gereedschapskist". Hiervoor selecteer "Plugin | LSM Toolbox | Toon van LSM toolbox". In de "LSM werkset", klik op "Open LSM" en selecteer het afbeeldingsbestand.
Opmerking: Voor formaten niet ondersteund door de "LSM gereedschapskist", converteren ze eerst tiff voor analyse. - Pak de reacties van cellen met behulp van het hulpprogramma (ROI) regio-of-interest in FIJI. Open de "ROI-Manager" in het menu "Analyseren" onder "Tools". Handmatig tekenen de ROI met behulp van de "selectiegereedschap veelhoek" gelegen in de werkbalk.
- Trekken de ROI in het rode kanaal waarin de kernen van de bèta-cel zichtbaar zijn. Selecteer de ROI zodanig dat het een oppervlakte groter is dan de kern van een cel om op te nemen sommige van het cytoplasma van de cel. Ervoor zorgen dat de positie van de ROI consistente tussen frames en de positie aanpassen indien nodig.
- De geselecteerde ROIs aan de "ROI-manager" toevoegen door te klikken op de knop "Add [t]". Selecteren en toevoegen van meerdere ROIs aan de ROI voor het verkrijgen van gegevens over meerdere cellen.
- Vervolgens het menu "Analyseren" Selecteer "Set metingen". Selecteer "Geïntegreerde dichtheid" voor het opgeven van de extractie van totale fluorescentie intensiteit binnen het gebied.
- Verschuiven naar het groene kanaal met de fluorescentie GCaMP en selecteer "Multi maatregel" in de "ROI-Manager".
Opmerking: Dit zorgt voor de intensiteit-metingen voor de cellen gedurende de tijd-serie. - In het geval dat de positie van de ROI moet worden aangepast als gevolg van beweging van het eiland, handmatig compileren de metingen van de intensiteit in verschillende frames. Kopieer en plak de waarden naar een apart werkblad.
- De tijdstempels van de afbeeldingsframes verkrijgen "LSM gereedschapskist". Gebruik "postzegels | T postzegels | Bestandsnaam | Dumpen naar tekstbestand' voor de tijdstempels. Opslaan van tijdstempels met behulp van de optie "Opslaan als" of kopieer ze naar het werkblad.
- Bij het samenstellen van de intensiteitswaarden voor alle cellen, de analyse één cel tegelijk of automatisch (bijvoorbeeldmet behulp van Excel-formules of R) uit te voeren.
-
Analyseren van afzonderlijke cellen in twee stappen.
- In de eerste stap, de intensiteit van de fluorescentie boven de basislijn worden berekend. Bereken de basislijn fluorescerende intensiteit (F0) als het gemiddelde van de fluorescentie intensiteiten voor de eerste 50 frames (5 mM glucose) te dien einde. Vervolgens aftrekken van de basislijn (F0) uit de hele tijd-serie (F-F0).
Opmerking: een paar cellen prima overweg met duidelijke GCaMP oscillaties onder basale glucose, die meestal blijven na stimulatie met hogere concentraties. Voor dergelijke cellen is het alleen mogelijk om te schatten F0 door middel van de gemiddelde intensiteit van de initiële frames waarin de cellen een daling in de fluorescentie toonde. - In de tweede stap van de analyse, de definitieve GCaMP fluorescentie intensiteit te verkrijgen door het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie.
Opmerking: Dit is uitgevoerd om te verwijderen van de verschillen tussen eilandjes van verschillende dieren. Individuele eilandjes weer verschillende niveaus van fluorescentie emissie op glucose stimulatie. - De intensiteit van de fluorescentie normaliseren door het onder te verdelen met de hoogste intensiteitswaarde. Hiervoor berekenen de piek intensiteit (Fmax -F0), en deelt u de basislijnwaarden afgetrokken door piek intensiteit aan het rendement van de uiteindelijke GCaMP fluorescentie intensiteit (F-F0) / (Fmax -F0).
- In de eerste stap, de intensiteit van de fluorescentie boven de basislijn worden berekend. Bereken de basislijn fluorescerende intensiteit (F0) als het gemiddelde van de fluorescentie intensiteiten voor de eerste 50 frames (5 mM glucose) te dien einde. Vervolgens aftrekken van de basislijn (F0) uit de hele tijd-serie (F-F0).
- Gooi de cellen die niet een verandering in intensiteit na KCl stimulatie, vertonen als ze misschien wel ongezond of beschadigd.
- Voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.9-4.10) in R, het gebruik van het script van de R (plotcelltrace. R) voorzien van dit manuscript.
Representative Results
Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, werden de reacties van de glucose van de beta-cellen in een eilandje van een zebravis 45 dagen na bevruchting (dpf) geanalyseerd. Hiervoor was het primaire rotseilandje ontleed van een euthanized dier en gemonteerd in de fibrinogeen-trombine schimmel in een glazen-bodem schotel. Het eilandje werd ondergedompeld in HBSS met 5 mM glucose. De concentratie van glucose werd verhoogd op een stapsgewijze manier 10 mM en 20 mM. De reacties van beta-cellen op de stijgende glucose-concentraties werden geregistreerd. Ten slotte werden de beta-cellen depolarized met behulp van 30 mM KCl (Figuur 1). De depolarisatie met behulp van KCl induceert calcium vermelding in gezonde bèta-cellen.
Met behulp van FIJI en een data-analysesoftware, de intensiteit van de fluorescentie GCaMP6s van individuele beta-cellen is geëxtraheerd en genormaliseerd (Figuur 2). Zoals blijkt uit het spoor van de intensiteit van de fluorescentie, weergeven individuele beta-cellen oscillaties in GCaMP6s fluorescentie op glucose stimulatie, die op KCl stimulatie stopt. De techniek biedt een mobiele oplossing van bèta-van de cel glucose-reactievermogen en een raam in hun functionaliteit.
Figuur 1: Ex vivo wonen-imaging van calcium toestroom in zebrafish beta-cellen met behulp van GCaMP6s. Een primaire eilandje van Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) was gemonteerd in fibrinogeen-trombine schimmel en geïncubeerd met 5 mM (basale) glucose. Beta-cellen waren gemarkeerd met een rode nucleaire marker, terwijl de GCaMP6s fluorescentie aanwezig in het groene kanaal is. Het eilandje werd gestimuleerd met een glucose-oprit bestaande uit opeenvolgende incubatie met 10 mM en 20 mM D-glucose en depolarized via de toevoeging van 30 mM die KCl. pijlpunten mark individuele beta-cellen waarvan de activiteit werd geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: genormaliseerde GCaMP6s fluorescentie intensiteit-trace voor individuele beta-cellen. Genormaliseerde GCaMP6s fluorescentie intensiteit-trace voor de beta-cellen gemarkeerd met pijlpunten in Figuur 1. De x-as geeft de tijd in seconden. Aan de top verbeelden bars de concentratie van glucose en KCl in de HBSS medium. De y-as geeft de genormaliseerde fluorescentie intensiteit tijdens de tijd-serie. Hiervoor wordt basislijn intensiteit (F0) berekend als de gemiddelde intensiteit tijdens de incubatie in 5 mM glucose. Dit wordt afgetrokken van de volledige gegevens van de tijd-serie (F - F0). De intensiteit-over basislijn is genormaliseerd door de maximale intensiteit, weergegeven door de cel (F - F0) / (Fmax- F0). De genormaliseerde trace toont een oscillerende reactie van beta-cellen om glucose, die gelijk wanneer de cellen zijn depolarized met 30 mM KCl. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier tonen we een techniek voor de kwantificering van bèta-cel glucose reactievermogen bij eencellige resolutie. Dit wordt mogelijk gemaakt door monitoring van intracellulair calcium concentratie met behulp van een genetisch-gecodeerde calcium-indicator, GCaMP6s. De activiteit van de bèta-cel is gevangen ex vivo door de montage van het eilandje in een mal van fibrinogeen-trombine. Een kritieke stap van het protocol is de stabiliteit van de schimmel. Voldoende tijd moet worden gegeven voor de fibrinogeen te ontbinden in de HBSS oplossing. Zonder dit doet de schimmel niet voldoende polymeriseren om te zorgen voor stabiliteit tijdens de imaging-sessie. Een eilandje gemonteerd in fibrinogeen-trombine schimmel en ondergedompeld in cel voedingsbodems kunt levensvatbaar blijven voor ten minste een week (gegevens niet worden weergegeven). Alternatieven voor de schimmel fibrinogeen-trombine, zoals lage-smelt agarose, kunnen worden gebruikt om het monteren van de eilandje-22. Een andere belangrijke parameter is de dissectie van het eiland. Tijdens deze stap moet het weefsel rondom het eilandje worden verwijderd zonder verwonden of prikken van het eilandje. Een bekwame dissectie wordt geleverd met de praktijk.
Een beperking van de imaging protocol is de beperking tot één van de confocal vlakken van het eiland. Dit wordt gedaan om het vastleggen van de dynamiek van calcium toestroom binnen afzonderlijke bèta-cellen. Een Z-stapel door de gehele dikte van het rotseilandje leidt tot lage imaging snelheden en verlies van oscillerende signaal van de afzonderlijke cellen. Deze beperking kan worden verbeterd door gebruik te maken van snellere vervoermiddelen zoals spinnen-schijf microscopie, confocal-imaging om het vastleggen van de dynamiek van de calcium in 3 dimensies. Een andere grens zou in vivo calcium imaging12. Het transparante karakter van de zebravis embryo of het gebruik van pigment-minder stammen van zebravis volwassenen23 kan de mogelijkheid voor in vivo imaging in de toekomst bieden.
De beeldvorming van bèta-cel activiteit met hoge ruimtelijke en temporele resolutie kan onderzoeken van de functionele heterogeniteit tussen individuele beta-cellen. Deze aanpak kan helpen licht werpen op het bestaan van de bèta-cel subpopulatie. Meerdere studies hebben onlangs, het bestaan van de subpopulatie aangetoond in de nominaal homogene beta-cellen24,25,26. Ex vivo imaging kan gecombineerd worden met genetische verslaggevers te karakteriseren van de sub-bevolking van reactie op glucose. Bovendien, kan het combineren van de beeldvorming setup met farmacologische stimulatie zorgen voor screening van verbindingen die bèta-cel functie zouden kunnen verbeteren.
Kortom kunt de techniek die hier gepresenteerd kwantificering en vergelijking van het reactievermogen van de glucose voor individuele beta-cellen. Het biedt een directe venster in bèta-cel functie, een belangrijke parameter in de ontwikkeling van diabetes.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Ninov lab voor opmerkingen op het manuscript, leden van centrum voor regeneratieve therapieën Dresden (CRTD) vis en microscopie faciliteit voor technische bijstand. N.N. wordt ondersteund door financiële middelen van de DFG-CRTD, Cluster van Excellence bij TU-Dresden, Duits onderzoek Stichting (DFG) en het Duitse Center voor Diabetes onderzoek (DZD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
- Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
- Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
- Pipeleers, D. G.
- MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P.
- Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).
- Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
- Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
- Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
- Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
- Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
- Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756 (2016).
- Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).
