Method Article

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

DOI:

10.3791/57867

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November 3rd, 2018

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1Department of Hematology, University Hospital of Saint-Etienne, 2Department of Immunology, University Hospital of Grenoble-Alpes, 3Department Hematology, University Hospital of Clermont-Ferrand, 4Department of Immunology, University Hospital of Nice, 5Department of Biopathology, Institute Paoli-Calmettes, 6Department of Hematology, University Hospital of Lille

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um grupo de trabalho iniciado dentro francês citometria de associação (AFC) foi desenvolvido a fim de harmonizar a aplicação da citometria de fluxo multiparâmetros (MFC) para o diagnóstico de doença mieloide na França. O protocolo aqui apresentado foi estabelecido e aplicado entre setembro de 2013 e de 2015 novembro seis laboratórios de diagnóstico francês (hospitais universitários de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice e Lille e Institut Paoli-Calmettes em Marselha) e permitiu a padronização de aquisição de dados e preparação de amostra da medula óssea. Três bancos de dados de maturação foram desenvolvidos para neutrófilos, monocítica e linhagens eritroide com medula óssea de indivíduos "saudáveis" doador (indivíduos sem qualquer evidência de doenças hematopoiéticas). Um método robusto de análise para cada linhagem mieloide deve ser aplicável para o uso rotineiro de diagnóstico. Novos casos podem ser analisados da mesma maneira e comparados com os bancos de dados de sempre. Assim, quantitativas e qualitativas de anormalidades fenotípicas podem ser identificadas e aqueles acima 2SD comparado com dados de amostras normais da medula óssea devem ser consideradas indicativas de patologia. A principal limitação é a maior variabilidade entre os dados obtidos usando os anticorpos monoclonais obtidos com os métodos baseados em tecnologias de hibridoma e atualmente utilizados no diagnóstico clínico. Definição de critérios para validação técnica dos dados adquiridos pode ajudar a melhorar a utilidade do MFC para diagnósticos MDS. O estabelecimento destes critérios exige análise contra um banco de dados. A redução da subjetividade do investigador na análise de dados é uma importante vantagem deste método.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na ausência de marcadores fenotípicos específicos para as alterações displásicas ocorrem em células mieloides durante a iniciação de MDS e progressão, foi proposta uma nova abordagem em anos recentes, com base na avaliação de vias de maturação (expressão alterada de antígenos mieloides durante a produção de células mieloides maduras) ou da distribuição anormal de diferentes tipos de células na medula óssea (BM) de células compartimentos1,2.

Este artigo apresenta um novo método para aplicação padronizada do MFC, a fim de detectar alterações displásicas em compartimentos de células mieloides BM relacionados a Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou outras doenças hematológicas mieloides. Este estudo também mostra a utilidade do uso de bancos de dados de maturação para análise de dados MFC.

Padronização do procedimento de preparação de amostra, aquisição de dados e análise usando os bancos de dados permitiria identificar as anormalidades fenotípicas mais relevantes relacionadas com alterações displásicas em células mieloides BM. Portanto, subconjuntos estatisticamente selecionados com base em formatos bem marcados e bem reconhecidos (diagramas de separador de população automática (APS), histogramas e lotes do ponto) são necessários para o desenvolvimento de uma estratégia de análise que pode ser usada na análise subsequente rondas. A descoberta de anormalidades fenotípicas robustas em MDS facilitariam o diagnóstico em casos com ou sem displasia morfológica mínima e sem aberrancies de citogenéticas. Identificação dos parâmetros discriminatórios para a redução dos painéis imunofenotípica pode simplificar o atual escores2, permitindo a sua aplicabilidade em laboratórios de patologia clínica.

Este método limita as interpretações subjetivas de citometria dados, como tem sido sinalizado no MDS diagnóstico3. Esta etapa é um pré-requisito para o desenvolvimento de ferramentas automatizadas para processamento e análise de fluxo de dados4.

MDS compreende um grupo heterogêneo de desordens de células-tronco hematopoéticas clonais (HSC), em que as mutações spliceossoma cooperarem com modificadores epigenéticas específicas para produzir o fenótipo do MDS. Agora sabe-se que, juntamente com as mutações do HSC, outros mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia do MDS, tais como inflamação mediada por imune aberrante e interações entre linfócitos malignos e o microambiente do estroma do BM. No entanto, estes mecanismos permanecem mal compreendidos. A heterogeneidade ampla clínica e biológica da MDS faz o diagnóstico e seleção da terapia ideal um desafio. Na última década, vários estudos têm mostrado que MFC é muitas vezes mais sensível na detecção de displasia2 do que a morfologia, mas as restrições técnicas e econômicas dificultam essa técnica padronizar, com resultados muitas vezes dependendo do experiência do intérprete3. Além disso, não está claro como MFC pode pender a balança em direção a MDS com ou sem displasia morfológica mínima nos casos e na ausência de anomalias citogenéticas ou em casos-limite como hipocelular MDS, com uma contagem baixa de explosão, de outro não-clonal BM doenças como a insuficiência de medula óssea (i. e., anemia aplástica). Também continua a ser difícil diferenciar casos-limite da MDS com excesso de blastos da leucemia mieloide aguda (LMA). Por todas estas razões, as diretrizes clínicas não integrar a MFC testes para o diagnóstico final do MDS. Em 2011, a rede de câncer abrangente nacional dos EUA (NCCN) recomendado MFC para a estimativa da percentagem de células CD34 +, detecção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna e presença de clones de células T citotóxicas em hipocelular MDS5. Estas duas situações este último também envolvem um objetivo terapêutico porque dados clínicos mostraram uma boa resposta desses pacientes a terapia imunossupressora6. As diretrizes NCCN 2017, citando as recomendações do grupo de trabalho internacional (GTI), listado immunophenotyping aberrante deteção pelo MFC entre os co critérios para o diagnóstico do MDS, mas sem fazer quaisquer especificações6. Além disso, a classificação WHO publicada recentemente estipula que as conclusões de MFC sozinhos não são suficientes para estabelecer um diagnóstico primário de MDS na ausência de dados conclusivos morfológica e/ou citogenética7. No entanto, MFC pode ser usado como um teste adicional mostrando o dysregulation do célula mieloide padrões de maturação e quantificar a "distância normal" para um paciente em um momento específico do curso da doença.

Este método é aplicável em laboratórios clínicos interessados na avaliação de displasia em células mieloides BM, usando MFC immunophenotyping, a fim de refinar o diagnóstico em MDS ou outros distúrbios mieloides com anormalidades displásicos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo listado abaixo foi aprovado pelo "Comité de Protection des Personnes" (Comitê de ética independente) 1 Sud-Est da Universidade Hospital de Saint-Etienne, França.

1. citômetro de configurações

Nota: As configurações de citômetro foram realizadas de acordo com recomendações de fluxo de França, em conformidade com o procedimento EuroFlow "EuroFlow operacional protocolo padrão (SOP) para instalação do instrumento e a compensação (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

  1. Configuração de instrumento mensal
    1. Ligue o citômetro. Certifique-se de que todos os níveis de fluido são adequada e aberto Diva 6.1.3. Executar inicialização fluidics: na barra de menu, selecione ' citômetro | Fluidics Startup'. Clique em 'Okey' quando solicitado. Permita o citômetro aquecer durante pelo menos 30 min.
    2. Verificação de desempenho - grânulos de CST
      Nota: Para esta etapa, prepare-se 12 tubo 75mm poliestireno, grânulos de CST e bainha fluido (ver Tabela de materiais).
      1. Rotular um tubo de poliestireno 12 x 75 mm2 'CST'. Misture o frasco de talão fornecido pela inversão suave ou delicado num Vortex. Adicionar ao tubo rotulado: 0,35 mL de fluido de bainha e 1 gota de grânulos de CST. O tubo de vórtice suavemente e proceder à aquisição. Armazene o tubo para até 8 h 2-25 ° c no escuro se não adquirir imediatamente.
      2. Realizar a verificação do desempenho: na barra de menu, selecione ' citômetro | CST'.
      3. No separador 'Setup' do módulo CST: confirmar o Canto II como a configuração de 4-2 H-2V padrão e também confirmar que uma linha de base criada usando o lote atual de grânulos CST existe para esta configuração. Se não existir uma linha de base, consulte o IFU de grânulos de CST. Confirmar que esta linha de base não expirou: em ' controle de configuração ', selecione ' verificar Performance' do menu drop-down.
      4. Verifique 'Carregar manualmente o tubo' e clique em 'Executar'. Confirme o número de lote exibido. Delicadamente vórtice os grânulos diluídos preparado acima e quando solicitado, carregar os grânulos diluídos e clique em 'Okey'.
      5. Quando a verificação de desempenho estiver concluída, verifique se que o citômetro de desempenho passado. Clique em 'Exibir relatório'. Re-execute a verificação de desempenho se os resultados não passou. Salve o relatório em formato PDF com a data de relatório de acompanhamento de desempenho.
    3. Ajuste o 'PMT fluorescente tensões' com grânulos de arco-íris (Tabela de materiais).
      Nota: Os valores-alvo são estipulados no procedimento operacional padrão do Euroflow (SOP) intitulado "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Esta SOP está disponível no site Euroflow (www.euroflow.org; na área pública; Guia de protocolos).
      1. Criar um novo experimento através de ' mensal data de instalação do instrumento | Amostra '.
      2. ', escolha os parâmetros ópticos e fluorochromes correspondentes aos tubos em causa (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) e verifique os parâmetros de aquisição desejada (Log, A, H e / ou W). Aplica configurações atuais do CST (botão direito do mouse em ' configurações de citômetro ' da experiência). Defina o limite para o parâmetro do FSC em 10.000.
      3. Sobre o citômetro, desligue a compensação ao definir fluorescência tensões de PGTO para configuração de destino das IFM; para este efeito, vá no 'Inspetor', navegue até a guia 'Compensação' Disable compensação pela opção de ' Ativar compensação ' desmarcando.
      4. Criar uma planilha ' alvo IFM ' com todos os lotes do ponto necessário (n = 2; FSC contra SSC, FITC contra PE), histogramas (n = 8; um histograma para cada detector de fluorescência) e dados estatísticos que demonstram a referência a valores de pico (IFM e CV) para cada canal de fluorescência.
      5. Dilua 1 gota de partículas de calibração de grânulos de arco-íris de 8-pico em 1 mL de água destilada e vórtice antes do uso. Adquira sem gravação a solução de grânulos de arco-íris 8-pico em 'LOW' taxa de fluxo. Armazene o tubo para até 8 h em 2-25 ˚ c no escuro se não adquirir imediatamente.
      6. Singlete portão grânulos ' população P1' no FSC contra trama do ponto bivariada de SSC e o pico 8 ou 7 o FITC contra trama do ponto bivariada de PE (o pico mais brilhante ou a outra para baixo, como estipula no documento Euroflow intitulado "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") e o nome deste portão população P2.
      7. Continuar a aquisição da suspensão do grânulo do arco-íris 8-picos e ajustar tensões PGTO em todos os canais de fluorescência para atingir valores de IFM de destino de acordo com o documento Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. Quando são atingidos valores alvo IFM para o pico de 7 ou 8, grave o IFM alvo alcançado e os correspondentes valores finais de pgto. Adquirir 5.000 eventos e gravar os dados.
        Nota: Que PMT valores deve ser usada abaixo na etapa 1.2.3 (verificação de desempenho - confirmação de PGTO valores com grânulos de arco-íris).
      9. Anote estes valores fazendo uma impressão de tela com configurações ' IFM alvo ' e instrumento de planilha e salvar como imagem. jpg.
        Nota: Quando é criado um tubo "Novo", às vezes os PGTO valores variam inesperadamente. Por isso, é essencial uma dupla verificação de pgto. Compare cada vez que os valores de PGTO para suas notas, verifique que os valores de ' IFM alvo ' e PGTO estão corretas!
      10. Salve o 'Application Settings'. No navegador, clique em ' configurações de citômetro '. No menu suspenso, selecione ' configurações de aplicativo 'e salve. Clique em 'Okey'. Se solicitado, clique em Sim para manter os valores de limiar.
        Nota: Salve as configurações do aplicativo usando o nome padrão. Não renomeie as configurações.
    4. Ajuste o 'FCS' e 'Tensões SSC' com sangue lavado lisado (LWB).
      Nota: Para esta etapa, são necessários 50 µ l de uma amostra de sangue periférico (PB) de uma solução saudável voluntária, Lise (Tabela de materiais) e o tampão de lavagem.
      1. Pipetas de 50 µ l de PB em um tubo. Adicione 2 mL de solução de Lise recentemente diluída. Misture delicadamente e incubar durante 10 minutos a RT
      2. Centrifugue por 5 min a 540 x g.
      3. Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l do tubo. Misture delicadamente e adicione 2 mL da solução de lavagem filtrada.
      4. Centrifugue por 5 min a 540 x g.
      5. Repita mais uma vez o 1.1.4.3–1.1.4.4 de passos.
      6. Adicionar 250 µ l de tampão de lavagem filtrada e misture delicadamente.
      7. No experimento criado para aquisição de grânulos de arco-íris, criar um novo ' amostra | Nova planilha ': desenhar um gráfico bi-paramétrica de SSC-A / FSC-A.
      8. Adquirir as células, portão os linfócitos em um FSC contra trama do ponto bivariada de SSC e ajustar tensões FSC e SSC para alcançar os seguintes valores-alvo significa para a população de linfócitos fechado: FSC: 55.000 (gama 50.000-60.000) e SSC: 13.000 (gama 11.000 –15,000).
      9. Adquirir e registar os dados com cerca de 10.000 eventos. Verifique se os valores de alvo FSC e CCD médios para linfócitos fechados. Reajuste a tensão FSC e SSC se necessário.
      10. Tela de impressão e armazenar a impressão dos valores de canal de destino que são obtidos.
    5. Configurações de compensação de fluorescência.
      Nota: Os controles de compensação single-manchado devem ser definidos após as configurações IFM alvo e estabeleceram-se as configurações do FSC/SSC. Para esta etapa, um PB de um voluntário saudável, partículas de compensação (Tabela de materiais), solução de Lise e tampão de lavagem são necessários. A lista de reagentes de anticorpos conjugados a fluorocromo usado para configurar as matrizes de compensação de fluorescência e suas populações de referência estão listados na tabela 1.
      1. Rotular um tubo por reagente deve ser usado na criação de compensação de fluorescência (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71) e um tubo "em branco/inocente".
      2. Pipetar 50 µ l de PB em cada tubo ou 1 gota de "negativo" partículas de compensação + 1 gota de partículas de compensação "positivos" em tubos de controle de compensação indicadas na tabela 1.
      3. Adicione a quantidade apropriada do reagente anticorpo ao tubo. Adicione o tampão de lavagem filtrada para alcançar um volume final de 100 µ l de pelo tubo e misture delicadamente. Incube durante 15 min em RT, protegido da luz.
      4. Adicionar 2 mL de solução de Lise recentemente diluída apenas nos tubos com as células e misture delicadamente. Incube durante 10 minutos a RT, protegido da luz.
      5. Centrifugue por 5 min a 540 x g.
      6. Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Misture suavemente. Adicione 2 mL de tampão de lavagem filtrada.
      7. Centrifugar 5min a 540 x g.
      8. Aspire o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Adicione o tampão de lavagem filtrada para alcançar um volume final de 250 µ l pelo tubo e misture delicadamente.
      9. Crie controles de compensação.
        1. Barra de menu, selecione experimento criado para aquisição de grânulos de arco-íris. Criar um novo ' amostra | Configuração de compensação | Criar controles da compensação.
        2. Na caixa de diálogo resultante, selecione a opção ' incluir controle imaculado separado tubo/bem ' . Crie controles de compensação (não específico do rótulo) genérico para FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Crie controles de rótulo específico compensação para PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71. Clique em 'Okey'.
        3. Em uma nova planilha, criar um gráfico de SSC-A / FSC-A bi-paramétrica e desenhar um portão em linfócitos (P1) e o histograma correspondente para o fluorocromo que será detectado em cada tubo e desenha uma porta P2 para o pico positivo. Exiba a hierarquia (clique direito em um gráfico e selecione ' mostrar a população hierarquia ') para visualizar o número de eventos em P2, exceto para o tubo de controle Unstained.
        4. No navegador, expanda o espécime de controles de compensação.
        5. Vórtice as células imaculadas, preparado acima, para instalar s. 3 – 5 células imaculadas preparadas sobre o citômetro. Ajustar a taxa de fluxo para 'médio ' e clique em ' adquirir dados '. Na trama do SSC-A ponto de FSC-A vs, ajuste o portal P1 para abranger totalmente a população de linfócitos. Botão direito do mouse sobre o portão de P1. Selecione 'Aplicar a todos os controle de compensação'.
        6. Do painel de controle 'Aquisição' , clique em 'dados de registro ' para adquirir 5.000 eventos. Para todas as células coradas controle único-cor, verifique se que o portão de intervalo P2 engloba a população positiva.
        7. Para o PE-Cy7 e APCH7 tubos, adicione um portão de intervalo de P3 para o histograma e garantir que engloba a população negativa, e que o P2 engloba a população positiva.
        8. Calcule a compensação. Barra de menu, selecione ' experiência | Configuração de compensação | Calcular a compensação '. A matriz de compensação o nome: 'Data de compensações'. Selecione 'Link e salvar'.
        9. Salvar a matriz de compensação em configurações do aplicativo de catálogo: clique em 'citômetro configurações | Configurações do aplicativo | Salve ', o nome de matriz de compensação 'Data de compensação' e clique em 'Okey'.
        10. No navegador, clique em ' configurações de citômetro '. No Inspetor, navegue até a guia 'Compensação' Print clique no canto inferior direito.
          Nota: Esta informação também pode ser obtida do catálogo.
        11. Controle da matriz de compensação.
          1. Misture em um tubo de todos o único tubo manchado (APCH7 de escolha).
          2. Criar um novo experimento chamado 'Data de verificação de compensação', Adicionar nova amostra, clique direito em ' configurações de citômetro ' deste experimento e escolha ' Link | Desvincular | Configuração do aplicativo ' salvou na etapa 1.1.3.10. Adquira 50.000 eventos deste tubo com as novas configurações.
          3. Aplica uma nova planilha Global. 1 enredo de ponto FSC/SSC um de criar e desenhar um portão para visualizar os linfócitos e n x (n-1) / 2 outros focasse o portão de linfócitos Visualizar dois-por-dois parâmetros.
  2. Configuração de instrumento diária
    1. Ligue o citômetro. Certifique-se de que todos os níveis de fluido são adequada e aberto Diva 6.1.3. Executar inicialização fluidics: na barra de menu, selecione ' citômetro | Fluidics Startup'. Clique em 'Okey' quando solicitado. Permita o citômetro aquecer durante pelo menos 30 min.
    2. Verificação de desempenho - CST grânulos: Repita os passos 1.1.2.1–1.1.2.5.
    3. Verificação de desempenho - confirmação de PGTO valores com grânulos de arco-íris.
      1. Rotular um tubo de poliestireno como Grânulos de arco-íris '' e verifique se o número de lote está em uso. Misture bem o frasco do grânulo do arco-íris. Preparar os grânulos de arco-íris, adicione 1 gota de grânulos de arco-íris para 1 mL de água destilada ou desionizada. Protege da luz.
        Nota: Proceder à aquisição ou armazenar o tubo em 2-8 ˚ c até aquisição.
      2. Criar uma nova experiência: ' data de grânulos de arco-íris '.
      3. Vincular as compensações: clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione ' Setup Link', selecione a matriz de compensação adequada criada na etapa 1.1.5.9.9 e selecione 'Substituir'.
      4. Desvincular a compensação: clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione 'Desvincular da configuração anteriormente vinculada' e clique em 'Okey'.
      5. Aplicar Configurações de aplicativo '': clique com o botão direito em ' configurações de citômetro ', selecione ' configurações de aplicativo ', aplicar a configuração criada na etapa 1.1.3.10 durante a configuração mensal e selecione 'manter o valor de compensação '.
      6. Desmarque a opção 'Habilitar compensação'.
      7. Crie uma nova amostra no experimento com o modelo de planilha para grânulos de arco-íris. Adquira o tubo na aquisição de 'LOW' .
      8. Durante a aquisição de grânulos, ajuste o portal P1 para incluir apenas a população de grânulo singlet. Ajuste a porta P2 sobre a trama de ponto FITC-A / PE-A para incluir apenas a população de grânulo singlet. Registro 10.000 eventos.
      9. Verifique o IFM e os valores de CV obtidos para população P2 estão as metas pré-definidas do protocolo. Caso contrário, lave o citômetro e iniciar a operação novamente. Salve o relatório como o formato PDF.

2. preparação da amostra BM

Nota: Execute a célula lavar protocolo apenas antes do processo de coloração.

  1. Pipete 600 µ l de amostra primária para um tubo de centrífuga de 15 mL.
  2. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem (PBS + 0,5% BSA [> 98% puro BSA] + 0,09% NaN3 filtrado solução, pH 7,4). Misture a suspensão de células bem usando uma pipeta.
  3. Centrifugue por 5 min a 540 x g (lavagem 1). Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
  4. Repita as etapas 2.2 – 2.3 (lavar 2).
  5. Suspenda o centrifugado em 400 µ l de tampão de lavagem.
  6. Coloração de marcadores de espinha dorsal. Transferi todo o volume de anticorpos a espinha dorsal para um tubo de polipropileno para análise de FACS, identificado com os dados do paciente e a "espinha dorsal". Adicione 350 µ l de amostra lavada (o volume da amostra lavado necessário para preencher todos os tubos no painel). Misture bem com uma pipeta.
    Nota: Calcule o volume total de anticorpos de espinha dorsal para a superfície da membrana, coloração (como mostrado na tabela 2).
  7. Pipetar quantidades iguais da mistura amostra-espinha dorsal para 3 tubos de polipropileno para análise de FACS, identificado com os dados do paciente e "tubo número 1" para "tubo número 3". Se necessário, use tampão de lavagem para atingir um volume final de 200 µ l pelo tubo.
    Cuidado: Tenha cuidado para não deixar vestígios da amostra nas paredes dos tubos; caso contrário, estas células não ser manchadas. Se necessário, vórtice a células e centrifugar o tubo.
  8. Em cada tubo, adicione o volume adequado de anticorpos dirigidos contra marcadores de superfície celular (exceto para os marcadores de coluna vertebral), como especificado na tabela 2. Misture bem com uma pipeta. Incube durante 30 min à RT, protegido da luz.
  9. Adicione 2 mL de solução de Lise. Misture bem com uma pipeta. Incube durante 10 minutos a RT, protegido da luz.
  10. Centrifugue por 5 min a 540 x g. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado, deixando aproximadamente volume residual de 50 µ l em cada tubo. Misture bem com uma pipeta.
  11. Adicione 2 mL de tampão para o centrifugado de lavagem. Misture bem com uma pipeta.
  12. Repita os passos 2.10 – 2.11 (lavar 2).
  13. Centrifugue por 5 min a 540 x g. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado e ressuspender o sedimento celular em 200 µ l de PBS. Misture bem com uma pipeta.
  14. Adquirir as células, de preferência, imediatamente depois da coloração ou armazenar a 4 ° C, protegido da luz, para não mais de 1h até medido no citômetro de fluxo.

3. aquisição de dados

  1. Abra uma nova experiência em software de Diva e renomeá-lo de acordo com o nome, tipo de amostra e data.
  2. Crie uma nova amostra contendo 3 tubos. Especifica o Layout de experimento os anticorpos usados em cada tubo.
  3. Clique direito sobre o ' citômetro Settings', escolha ' configurações do aplicativo ' e aplicar os valores obtidos na configuração mensal (etapa 1.1.3.10).
  4. Abra uma nova planilha Global e criar os lotes do ponto: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Na trama SSC/FSC um ponto, crie um portal para selecionar células singlet. Na trama SSC/CD45 BV500-um ponto, criar portões para selecionar 4 populações: granulócitos, monócitos, linfócitos e explosões. Projeto dessas populações nas tramas ponto criadas anteriormente.
  5. Crie uma nova planilha Global para o controle de compensação, conforme descrito na etapa 1.1.5.9.11.3.
  6. Adquira o tubo em 'MEDIUM' aquisição e registro 500.000 eventos/tubo. Após a validação técnica (avaliação da compensação e a coloração adequada), exporte os dados como arquivos FCS3.0.

4. análise de dados

Nota: Para construir as bases de dados BM normais foram usados arquivos de doadores saudáveis e de indivíduos sem qualquer evidência para uma doença hematopoiética como segue 11 de 18 arquivos para o Neutrophils_NM do banco de dados, 10 de 18 arquivos banco de dados Monocytes_NM e 14 de 18 arquivos de banco de dados NRC_NM. Os arquivos descartados mostrou vários problemas técnicos, como apresentado na seção de resultados de representante. Os arquivos individualmente foram analisados utilizando o software Infinicyt (Tabela de materiais), em conformidade com as várias estratégias retratadas na figura 1A(1-3) para linhagem neutrófilos (perfil Neutrophils_Maturation.inp), Figura 2 A para a linhagem de monócitos (perfil Monocytes_Maturation.inp) e Figura 3A(1-2) de linhagem de célula eritroide (perfil NRC_Maturation.inp).

  1. Estratégia de análise para os neutrófilos -Construção de banco de dados Neutrophils_NM 
    1. Identifica CD34 + confirmada por neutrófilos explosões usando uma interseção de sete portões, permitindo a seleção de CD34 + CD117 + HLADR + baixo CD10 - CD13 + CD11b-eventos (Figura 1a. 1). Atribuir a esses eventos para a guia 'Neutrófilos' na árvore de hierarquia de população e posteriormente, desmarque essa guia a fim de remover estas células (representadas em azul) do visor dos restantes eventos (cinza).
    2. Isolar o CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores de neutrófilos baixas usando uma interseção de seis portões, conforme representado na Figura 1A(2) e atribuí-los à guia 'Neutrófilos' .
    3. Identifica os neutrófilos mais maduros usando uma interseção de quatro portões, permitindo a discriminação de CD45dim SSCint-Oi CD117-HLADR-células e sua atribuição à guia 'Neutrófilos' .
    4. Os eventos restantes, mantendo apenas os neutrófilos visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
    5. Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, execute uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação. Usando APS parcelas com medianas para cada arquivo e SD curvas para cada subpopulação, conforme mostrado, remover os casos fora das curvas de 2SD (veja detalhes na seção de resultados de representante) (Figura 1B).
    6. No arquivo composto resultante com "Neutrófilos" visíveis, desenhar o percurso de maturação em um diagrama APS (Figura 1C , à esquerda) e salvar como um arquivo de .cyt.
      Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados Neutrophils_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 2,C, direita, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados Neutrophils_NM (n = 11) encaixar 2 SD comparado com mediana do grupo.
  2. Estratégia de análise para monócitos - construção de banco de dados de Monocytes_NM
    1. Identificar as células de linhagem monocítica (CD117 + CD64 + HLADR + Oi) usando uma interseção de quatro portas(Figura 2). Atribua a esses eventos para a guia 'Monocytic' na árvore de hierarquia de população.
    2. Os eventos restantes, mantendo apenas as células monocítica visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
    3. Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, executar uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação e, em seguida, remover os casos fora das curvas de 2SD (detalhes na seção de resultados de representante) (Figura 2 B).
    4. No arquivo resultante com "Monocytic" células visíveis, desenhar o percurso de maturação no diagrama de APS (Figura 2C esquerdo) e salvar como um arquivo de .cyt.
      Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados Monocytes_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 2,C, direita, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados Monocytes_NM (n = 10) encaixar 2 SD em comparação com a média do grupo.
  3. Estratégia de análise para hemácias nucleadas (CRN) - construção de banco de dados NRC_NM
    1. Identifica CD34 + explosões eritroide cometido usando uma interseção de sete portões que permitem a seleção de CD34 + CD117 + HLADR + baixa CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventos (Figura 3a. 1). Atribuir a esses eventos para a aba "NRC" na árvore de hierarquia de população e desmarque essa guia a fim de remover estas células (representadas em vermelho) na exibição dos restantes eventos (cinza).
    2. Identificar mais maduros NRCs usando uma interseção de quatro portões que permitem a discriminação de CD45-/ + dim SSClow CD36 + Oi CD71 + CD105 + /-células. Atribua a esses eventos para a aba "NRC" (Figura 3-A(2)). As plaquetas (CD36 + Oi SSClow células) deve ser removido da população NRC (Figura 3-A(2)).
    3. Os eventos restantes, mantendo apenas as células NRC visível, em seguida, exportar essa população clicando desmarque a opção ' arquivo | Exportar ' e verificar que todos os parâmetros necessários são verificados e salvar os dados como arquivos FCS.
    4. Em um arquivo mesclado, consistindo de todos os arquivos exportados do FCS, executar uma verificação de qualidade, avaliando a intensidade da expressão de marcadores para cada subpopulação, seguido pela remoção dos casos fora o 2SD curvas (veja mais detalhes na seção de resultados de representante) ( Figura 3 B).
    5. No arquivo resultante com células "NRC" visíveis, desenhar o percurso de maturação no diagrama de APS (Figura 3C, à esquerda) e salvar como um arquivo de .cyt.
      Nota: Uma comparação de maturação diagrama permite a visualização de todos os parâmetros de todos os arquivos incluídos no banco de dados NRC_NM representado contra o banco de dados normalizado. O diagrama apresentado na Figura 3C, lado direito, mostra que todos os arquivos incluíam no banco de dados NRC_NM (n = 14) encaixar 2 SD comparado com mediana do grupo.
  4. Avaliação da maturação em compartimentos mieloides BM, usando os bancos de dados de maturação
    1. Abra o arquivo .cyt, correspondente a linhagem de interesse (i. e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt para linhagem neutrófilos, Monocytes_NM_GMFF.cyt para linhagem monocítica e NRCs_NM_GMFF.cyt para linhagem eritroide).
    2. Botão direito do mouse na guia 'Maturação' abaixo da guia correspondente para a linhagem de interesse (' neutrófilos | Monocítica | NRC') e salve o banco de dados de maturação a maturação.
    3. Abra um novo arquivo de FCS e realizar a análise, conforme explicado anteriormente (passo 4.1.1–4.1.3 por neutrófilos, passo 4.2.1 para células monocítica, e passo a 4.3.1–4.3.2 para o NRC).
    4. Desenhe o percurso de maturação para a população de interesse.
    5. Abra o banco de dados correspondente na aba 'Ferramentas' (análise de banco de dados) e comparar a população a ser analisado com o banco de dados correspondente de maturação. Verifique os dados para compatibilidade com Banco de dados disponível: completa compatibilidade (triângulo verde); compatibilidade parcial, na maioria das discrepâncias de casos em nome de parâmetros (triângulo amarelo); e incompatibilidade (triângulo vermelho).
    6. Se os dados forem compatíveis ou parciais compatíveis, o software cria o diagrama ' diferenças de maturação normalizado ' . Para visualizar as ' diferenças de maturação de banda parâmetro ', abrir um novo diagrama na aba 'Diagrama' , clique em 'Maturação' e escolher quantos parâmetros para ser exibida, clique em 'Okey' e o diagrama aparecem. Com o botão direito do mouse no diagrama; alterações podem ser feitas na visualização de dados, visualização de dados e visualização de diagrama de maturação.
    7. Para visualizar o significado das diferenças entre o novo arquivo e dados incluídos no banco de dados, configurar um zoom (botão direito do mouse em ' diferenças de maturação normalizado ' e aplicar 'Zoom').

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As 54 amostras de BM colhidas em anticoagulante EDTA-K foram incluídas no estudo. Analisaram-se os dados do MFC na ausência de qualquer informação sobre os pacientes. Estudo retrospectivo mostrou que as amostras de BM eram de 7 doadores saudáveis (5 machos e 2 fêmeas com idade mediana de 47,4 [35-48], 11 indivíduos sem evidência de doença hematopoiética (8 machos e 3 fêmeas com idade mediana de 57.9 [35-72]) e 36 casos com vários condições patológicas: 1 caso com anemia e nível de creati...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A qualidade do aspirado BM poderia impactar os resultados finais. A hemodiluição do aspirado BM pode distorcer a distribuição de células em diferentes estágios de maturação devido à ausência dos progenitores ou precursores. Provavelmente, empregar um granel lise método pode ajudar na normalização da BM aspirados por hemodiluição em análises de fluxo cytometric. Além disso, os passos críticos para a avaliação da displasia mieloide BM por citometria de fluxo são o exemplo de processamento e coloração, aquisição de dados e ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. O departamento de citometria de fluxo, o laboratório de Hematologia do Hospital da Universidade de Saint-Etienne é um membro do consórcio EuroFlow.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os anticorpos utilizados neste estudo foram fornecidos pela BD Biosciences. Os autores gostaria de agradecer ao seu colega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde o departamento de Biologia Molecular, laboratório de Hematologia, University Hospital de Saint-Etienne, França, que forneceu a perícia para interpretação dos dados NGS para o segundo Caso do MDS. Os autores são gratos a hematologia clínico para seu interesse e envolvimento neste estudo e para os pacientes e doadores saudáveis para o seu acordo em participar deste estudo. Os autores também gostaria de agradecer à Fundação "Les Amis de Rémi" apoio financeiro para publicação.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BD FACSCanto II citômetro de fluxoBD Biosciences, CA, USASN:3-laser, configuração 4-2-2, Filtros e espelhos detalhes: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R CentrifugeAWEL Industries, FRSN: 910120016; Modelo No: 320002001centrífugas de baixa velocidade; capacidade 60 tubos FACS
Pipetas de 10µ L e 200µ L
Pasteur pipetas
15 mL Tubos Falcon
polipropileno para FACS
Mouse Anti-Human HLA-DRBD Biosciences, CA, EUA655874clone L243
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome Horizon V450
(Ex max 404 nm/
Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45BD Biosciences, CA, EUA560777clone HI30
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/
Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16BD Biosciences, CA, EUA656146clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorocromo FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13BD Biosciences, CA, EUA347406clone L138
Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ
Fluorocromo PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD34BD Biosciences, CA, EUA347222clone 8G12
Camundongo BALB/c IgG1, κ
Fluorocromo PerCP-Cy5.5
(Ex max 482 nm/
Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117BD Biosciences, CA, EUA339217clone 104D2
Mouse BALB/c IgG1
Fluorochrome PE-Cy7
(Ex max 496 nm/
Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11bBD Biosciences, CA, EUA333143clone D12
Mouse BALB/c IgG2a, κ
D12, Fluorocromo APC
(Ex max 650 nm/
Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10BD Biosciences, CA, EUA646783clone HI10A
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorocromo APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Camundongo Anti-Humano CD35BD Biosciences, CA, EUA555452clone E11
Camundongo IgG1, κ
Fluorocromo FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64BD Biosciences, CA, EUA644385clone 10.1
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorocromo PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD300eImmunostepIREM2A-T100clone UP-H2
Camundongo BALB/c IgG1, k
Fluorocromo APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD14BD Biosciences, CA, EUA641394clone MoP9
Mouse BALB/c IgG2b, κ
Fluorocromo APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Camundongo Anti-Humano CD36BD Biosciences, CA, EUA656151clone CLB-IVC7
Mouse IgG1, κ
Fluorocromo FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105BD Biosciences, CA, EUA560839clone 266
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorocromo PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD33345800clone P67.6
Camundongo BALB/c IgG1, κ
Fluorocromo APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71BD Biosciences, CA, EUA655408clone M-A712
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorocromo APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Solução de lise 10x concentrado (IVD)BD Biosciences, CA, EUA349202
FACSFlow Sheath FluidBD Biosciences, CA, USA342003
FACSDiva CS& T IVD beadsBD Biosciences, CA, USA656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKSCytognos, Salamanca, EspanhaSPH-RCP-30-5Alotes EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Partículas de compensação Multicolor CompBeads(CE/IVD)BD Biosciences, CA, EUAref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Software Diva versões 6.1.2 e 6.1.3BD Biosciences, CA, EUA
Comprimidos salinos tamponados com fosfatoR& D Systems, Minneapolis, EUA5564
Albumina de soro bovino( BSA)Sigma-Aldrich, FrançaA9647
Azida de sódio 99%Sigma-Aldrich, França199931
Software Infinicyt versão 1.8.0.eCytognos, Salamanca, Espanha
V33896301336 tubo de

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