Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Resumo

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Resumo

Um grupo de trabalho iniciado dentro francês citometria de associação (AFC) foi desenvolvido a fim de harmonizar a aplicação da citometria de fluxo multiparâmetros (MFC) para o diagnóstico de doença mieloide na França. O protocolo aqui apresentado foi estabelecido e aplicado entre setembro de 2013 e de 2015 novembro seis laboratórios de diagnóstico francês (hospitais universitários de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice e Lille e Institut Paoli-Calmettes em Marselha) e permitiu a padronização de aquisição de dados e preparação de amostra da medula óssea. Três bancos de dados de maturação foram desenvolvidos para neutrófilos, monocítica e linhagens eritroide com medula óssea de indivíduos "saudáveis" doador (indivíduos sem qualquer evidência de doenças hematopoiéticas). Um método robusto de análise para cada linhagem mieloide deve ser aplicável para o uso rotineiro de diagnóstico. Novos casos podem ser analisados da mesma maneira e comparados com os bancos de dados de sempre. Assim, quantitativas e qualitativas de anormalidades fenotípicas podem ser identificadas e aqueles acima 2SD comparado com dados de amostras normais da medula óssea devem ser consideradas indicativas de patologia. A principal limitação é a maior variabilidade entre os dados obtidos usando os anticorpos monoclonais obtidos com os métodos baseados em tecnologias de hibridoma e atualmente utilizados no diagnóstico clínico. Definição de critérios para validação técnica dos dados adquiridos pode ajudar a melhorar a utilidade do MFC para diagnósticos MDS. O estabelecimento destes critérios exige análise contra um banco de dados. A redução da subjetividade do investigador na análise de dados é uma importante vantagem deste método.

Introdução

Na ausência de marcadores fenotípicos específicos para as alterações displásicas ocorrem em células mieloides durante a iniciação de MDS e progressão, foi proposta uma nova abordagem em anos recentes, com base na avaliação de vias de maturação (expressão alterada de antígenos mieloides durante a produção de células mieloides maduras) ou da distribuição anormal de diferentes tipos de células na medula óssea (BM) de células compartimentos^1,2.

Este artigo apresenta um novo método para aplicação padronizada do MFC, a fim de detectar alterações displásicas em compartimentos de células mi....

Protocolo

O protocolo listado abaixo foi aprovado pelo "Comité de Protection des Personnes" (Comitê de ética independente) 1 Sud-Est da Universidade Hospital de Saint-Etienne, França.

1. citômetro de configurações

Nota: As configurações de citômetro foram realizadas de acordo com recomendações de fluxo de França, em conformidade com o procedimento EuroFlow "EuroFlow operacional protocolo padrão (SOP) para instalação do instrumento e a compensação (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Configuração de instrumento mensal
   1. Ligue o citômetro. Certifique-se de que todos os níveis de....

Resultados

As 54 amostras de BM colhidas em anticoagulante EDTA-K foram incluídas no estudo. Analisaram-se os dados do MFC na ausência de qualquer informação sobre os pacientes. Estudo retrospectivo mostrou que as amostras de BM eram de 7 doadores saudáveis (5 machos e 2 fêmeas com idade mediana de 47,4 [35-48], 11 indivíduos sem evidência de doença hematopoiética (8 machos e 3 fêmeas com idade mediana de 57.9 [35-72]) e 36 casos com vários condições patológicas: 1 caso com anemia e nível de creati.......

Discussão

A qualidade do aspirado BM poderia impactar os resultados finais. A hemodiluição do aspirado BM pode distorcer a distribuição de células em diferentes estágios de maturação devido à ausência dos progenitores ou precursores. Provavelmente, empregar um granel lise método pode ajudar na normalização da BM aspirados por hemodiluição em análises de fluxo cytometric. Além disso, os passos críticos para a avaliação da displasia mieloide BM por citometria de fluxo são o exemplo de processamento e coloração, aquisição de dados e .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BD FACSCanto II citômetro de fluxo	BD Biosciences, CA, USA	SN:	3-laser, configuração 4-2-2, Filtros e espelhos detalhes: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Modelo No: 320002001	centrífugas de baixa velocidade; capacidade 60 tubos FACS
Pipetas de 10µ L e 200µ L
Pasteur pipetas
15 mL Tubos Falcon
polipropileno para FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, EUA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, EUA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, EUA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, EUA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD34	BD Biosciences, CA, EUA	347222	clone 8G12 Camundongo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, EUA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, EUA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, EUA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Camundongo Anti-Humano CD35	BD Biosciences, CA, EUA	555452	clone E11 Camundongo IgG1, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, EUA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Camundongo BALB/c IgG1, k Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD14	BD Biosciences, CA, EUA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Camundongo Anti-Humano CD36	BD Biosciences, CA, EUA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, EUA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Camundongo Anti-Humano CD33		345800	clone P67.6 Camundongo BALB/c IgG1, κ Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, EUA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Solução de lise 10x concentrado (IVD)	BD Biosciences, CA, EUA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS& T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Espanha	SPH-RCP-30-5A	lotes EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Partículas de compensação Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, EUA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Software Diva versões 6.1.2 e 6.1.3	BD Biosciences, CA, EUA
Comprimidos salinos tamponados com fosfato	R& D Systems, Minneapolis, EUA	5564
Albumina de soro bovino( BSA)	Sigma-Aldrich, França	A9647
Azida de sódio 99%	Sigma-Aldrich, França	199931
Software Infinicyt versão 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Espanha

V33896301336 tubo de