Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar um embrião de zebrafish põr modelo, seguido por um procedimento detalhado sobre a utilização de tal modelo para alto throughput zebrafish embrião põr em uma placa de 96 poços.

Resumo

O peixe-zebra é que um organismo reconhecido mundialmente água doce frequentemente usada em biologia do desenvolvimento, toxicologia ambiental e humana doença campos de investigação com ele relacionada. Graças a suas características únicas, incluindo a grande fecundidade, translucidez do embrião, evolução rápida e simultânea, etc., zebrafish embriões são frequentemente utilizados para avaliação de toxicidade em larga escala de produtos químicos e drogas/compostom triagem. Um procedimento de rastreio típico envolve adulto zebrafish desova, seleção de embriões e põr os embriões em placas multi bem. A partir daí, embriões sejam sujeitos a exposição e a toxicidade do produto químico, ou a eficácia dos medicamentos/compostos pode ser avaliada relativamente rápido com base em observações fenotípicas. Entre estes processos, põr de embriões é uma das etapas mais demoradas e trabalhosas que limita o nível de produtividade. Neste protocolo, apresentamos uma inovadora abordagem que faz uso de um modelo arraying 3D-impresso juntamente com vácuo manipulação para acelerar esta etapa trabalhosa. O protocolo neste documento descreve o projeto total do modelo arraying, uma instalação experimental detalhada e procedimento passo a passo, seguido por resultados representativos. Quando implementado, essa abordagem deve provar benéfica em uma variedade de aplicações de pesquisa usando zebrafish embriões como assuntos de teste.

Introdução

Como um organismo modelo popular, o zebrafish é amplamente utilizado nos campos da medicina e toxicologia^1,2,3,4. Em comparação com plataformas em vitro , zebrafish oferecem muito maior complexidade biológica que um ou dois tipos de células não podem oferecer. Além de ser um todo organismo modelo, do zebrafish grande fecundidade, rápido e simultâneo de desenvolvimento embrionário e órgão alta translucidez ter dado este vantagens exclusivas do modelo a ser usado para a toxicidade de grande escala ou drogas/composto^5....

Protocolo

1. projeto e fabricação de embriões um Zebrafish põr modelo

1. Cria o modelo de arraying com um 12 por 8, layout de 96 poços que se encaixa uma padrão placa de 96 poços. Uso as dimensões listadas na figura 1A , para a câmara de compressão superior do embrião (consulte também o arquivo suplementar).
   1. Use as dimensões indicadas na figura 1B e 1D pela captura bem.
   2. Use as dimensões na Figura 1 , para a câmara de vácuo inferior.
   3. Use as dimensões na figura 1B para o ar / tomada.
   ....

Resultados

A Figura 3 mostra um típico modelo de arraying 3D-impresso. Este modelo usa resina fotossensível como matéria-prima e foi feito por uma impressora 3D; uma camada de tinta preta, aplicou-se para fornecer um melhor contraste com a cor dos embriões. A posição de 96 poços (12 por 8) foi projetada para se encaixar com uma padrão placa de 96 poços. Da mesma forma, um modelo de bem 384 (24 por 16) também pode ser projetado e fabricado usando o mesmo método. O lado p.......

Discussão

Há duas etapas críticas neste protocolo que exigem muita atenção para uma implementação bem sucedida do modelo 3D-impresso para põr o zebrafish embriões.

O fator mais importante no design do modelo arraying é a armadilha bem. Para garante há apenas um embrião preso em cada poço, um deve prestar atenção para o diâmetro e a profundidade do poço uma armadilha e o diâmetro do furo. O diâmetro recomendado é dentro de 1,5 a 2 vezes o diâmetro de um embrião típico (incluindo o córion). A profundidade.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Caixa de acasalamento	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Frasco de Lavagem, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Cloreto de Sódio	Vetec	V900058-500G
Cloreto de Potássio	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Cloreto de cálcio	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Bicarbonato de sódio	Vetec	v900182-500G
Hidrato de Azul de Metileno	TCI	M0501
Ácido clorídrico	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011008
Sais Marinhos	Oceano Instantâneo	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Gota Controlada Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
OLYMPUS	SZ61		microscópio
	Ltd.	LRH-250
Impressora 3D	UnionTech	Lite600
Resina fotossensível	UnionTech	UTR9000
Bomba de vácuo	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
sela a	de Solarbio	YA0245
96 Costar		3599
Multi pipeta de 8 canais 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
Espanador de Gás Comprimido	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Água	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Forno de Secagem	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
Água			Água fora da instalação' s sistema de água
Água de ovo			diluída 60mg " Oceano instantâneo" sais marinhos e azul de metileno 0,25 mg/L em 1 L de água
DI Holtfreter»			dissolver 7,0 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,4 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 0,1 g de cloreto de potássio (KCl), 0,235 g de cloreto de cálcio (CaCl2,2H2O) em 1,9 L de água DI. Ajuste o pH para 7 usando HCl e ajuste o volume para 2 L usando água Di

Incubadora bioquímica Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co. de do , A placa adesiva do PCR de placa boa do sistema