Artigo de método

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

DOI:

10.3791/57901

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21 de outubro de 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Resumo

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O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Introdução

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Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes1 e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. 2 estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,3 mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. 4 devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador.

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Protocolo

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1. preparar e apresentar um nêutron instalação feixe tempo e proposta de instrumento

  1. Consulte os recursos online para identificar instalações de dispersão de nêutrons que fornecem acessar de tempo de feixe de nêutrons usuário geral, como Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa de nêutrons facilidades e informações sobre pesquisa de nêutrons em todo o mundo está disponível online. 46 estar ciente de que estas instalações têm tipicamente regulares convites à apresentação de propostas; Isto determina quando a próxima viga estará disponível. Nêutrons são usados para uma variedade de aplicações; Pesquisar por instrumentos de espalhament....

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Resultados

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Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta devem incluir info.......

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Discussão

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Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A disponibilidade comer.......

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Divulgações

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Os autores Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver são contratados através de UT-Battelle nos DOE para apoiar o programa de usuário ciência nêutrons e Bio-SANS instrumento no Oak Ridge National Laboratory usado neste artigo.

Este manuscrito tem sido co-autoria de UT-Battelle, LLC, sob contrato DE-AC05-00OR22725 com nos departamento de energia (DOE). O governo dos EUA mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos EUA mantém uma licença não exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado este manuscrito ou permitir que outros a fazê-lo, para fins de governo dos Estados Unidos. DOE fornecerá acesso público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público do DOE. 82

Agradecimentos

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O escritório de biológica e investigação ambiental apoiaram pesquisa do ORNL centro de Biologia Molecular estrutural (CSMB) e Bio-SANS usando recursos suportados pela divisão de instalações científicas usuário, escritório de ciências básicas de energia, departamento dos EUA de energia. O trabalho estrutural em proteínas de membrana no laboratório de Lieberman foi apoiado pelo NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa laboratórioEMD MilliporeUFC905096
Citrato de amônio dibásicoFisher ScientificA663componente médio
Sulfato de amônioEMD Millipore2150componente médio
Bioflo 310 Sistema de biorreatorEppendorfM1287-2110equipamento
Cloreto de cálcio di-hidratadoAcros423525000componente médio
CarbenicilinaIBIAntibióticoIB02025
CloranfenicolEMD Antibiótico Millipore3130
Cloreto de cobalto (II)AcrosAC21413-0050componente médio
Sulfato de cobre (II)AcrosAC19771-1000 componente médio
Óxido de deutérioSigma-Aldrich756822Purificador
gás DrieriteW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, dissódico, di-hidratadoEMD Millipore4010componente médio
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3equipamento
Ä Purificador kta UPC100GE Healthcare equipamento
GlicerolSigma-AldrichG5516componente médio
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colunaGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Cloreto de ferro (III) hexahidratadoMP BioquímicosICN19404590componente médio
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Sulfato de magnésio heptahidratadoVWR97062-134componente médio
Sulfato de manganês(II) monohidratadoAcrosAC20590-5000componente médio
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated ShakerThermo ScientificSHKE6000-7 equipamento
n-Dodecil-d25-β-D-maltopiranosídeoAnatraceD310T
n-Dodecil-β-D-maltopiranosídeoAnatraceD310A
Fosfato de potássio monobásicoVWR97062-346componente médio
RC 6 Plus CentrífugaThermo Scientific Sorvall46910equipamento
SIGMAFAST comprimidos de coquetel inibidor de protease, Cloreto deSigma-AldrichS8830
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich
Fosfato de sódio dibásicocomponente médioSigma-AldrichS7907
m Membrana PESVWR28145-501Labware
Filtro de topo de garrafa descartável estéril com 0,2µ m Membrana PESThermo Scientific596-4520 material de laboratório
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
coluna Superose-12 10/300 GL GE Healthcare 
Ultrospec 10 Medidor de Densidade de CélulasGE Healthcare 80211630equipamento
Sulfato de zinco monohidratadoAcrosAC38980-2500 componente médio
Material de científicode de componente médio 17116701 sódio sem EDTA S3014 Sigma-Aldrich 795429 Filtro de seringa estéril de 25mm de com 0,2µ1751750117517301

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR struc....

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