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Artigo de método

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

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DOI:

10.3791/57901

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21 de outubro de 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Resumo

O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Introdução

Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes1 e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. 2 estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,3 mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. 4 devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador. 5 , 6 , 7

Como muitas técnicas biofísicas exigem monodisperso partículas em solução para medição, isolando as proteínas de membrana de membranas nativas e estabilizar estas proteínas em um mímico solúvel das membranas nativas tem sido uma área ativa de pesquisa em recentes décadas. 8 , 9 , 10 estas investigações levaram ao desenvolvimento de muitos conjuntos de romance anfifílica para solubilizar as proteínas de membrana, tais como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 no entanto, o uso de detergentes micelas continua a ser uma das abordagens mais comuns e simples para satisfazer os requisitos de solubilidade de uma determinada proteína. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 -infelizmente, nenhum único detergente ou mistura mágica de detergentes existe atualmente que satisfaça todas as proteínas de membrana; assim, estas condições devem ser empiricamente selecionadas para os requisitos exclusivos de cada proteína. 26 , 27

Detergentes auto-montagem na solução acima da concentração crítica micelle para formar estruturas agregadas chamadas micelas. Micelas são compostas de muitos monômeros detergentes (normalmente variando de 20-200) com cadeias alquila hidrofóbicas, formando um núcleo micelle e grupos cabeça hidrofílicos, dispostos em uma camada de casca micelle enfrentando o solvente aquoso. O comportamento de detergentes e formação micela foi classicamente descrito por Charles Tanford em O efeito hidrofóbico,28 e tamanhos e formas das micelas de detergentes usados em estudos de proteínas de membrana têm sido caracteriza-se usando o pequeno ângulo espalhamento. 29 , 30 organização de detergente sobre as proteínas de membrana também tem sido estudada, e a formação de complexos proteína-detergente (PDCs) é esperada com moléculas de detergente em torno da proteína em um arranjo que se assemelha o detergente puro micelas. 31

Um adicionado a vantagem em usar detergentes é que as propriedades de micela resultante podem ser manipuladas, incorporando outros detergentes. Muitos detergentes exibem uma mistura ideal, e selecione Propriedades de micelas mistas nem podem ser previstas a partir os componentes e a proporção de mistura. 22 no entanto, a presença de detergente pode ainda apresentar desafios para caracterizações biofísicos, contribuindo para o sinal global. Por exemplo, com raio-x e técnicas de espalhamento de luz, sinal de detergente no PDC é praticamente indistinguível da proteína. 32 investigações com single-particle cryo-microscopia (cryo-EM) normalmente contam com partículas (congeladas) presas; detalhes estruturais da proteína ainda são obscurecidos por determinados detergentes ou uma alta concentração de detergente, que acrescenta ao fundo. 33 abordagens alternativas para interpretar a estrutura completa do PDC (incluindo o detergente) foram feitas através de métodos computacionais que visam reconstruir o detergente em torno de uma proteína de membrana determinado. 34

Para o caso de dispersão de nêutrons, o arranjo de núcleo-casca de detergente no micelle produz um fator de forma que contribui para a dispersão observada. Felizmente, componentes de solução podem ser alterados, tal que eles não contribuem para a dispersão líquida observada. Este processo de "correspondência de contraste" é conseguido pela substituição de deutério de hidrogênio obter uma densidade de comprimento de dispersão que corresponde do fundo (tampão). Uma escolha criteriosa de detergente (com contrapartes deuterados disponíveis) e sua proporção de mistura devem ser considerados. Para detergentes micelas, essa substituição pode ser realizada usando um detergente com o mesmo grupo de cabeça mas tendo uma cadeia deuterado (d-cauda em vez de h-cauda). Uma vez que os detergentes são bem misturados,35 seus agregados terá uma densidade de comprimento de dispersão que é a fração molar-ponderada média dos dois componentes (h-caudas e d-caudas). Quando este contraste médio é consistente com a do grupo principal, as estruturas de agregação uniformes podem ser correspondidas totalmente para remover todas as contribuições para dispersão observada.

Apresentamos aqui um protocolo para manipular o contraste de nêutrons de micelas detergentes pela incorporação de moléculas de detergente quimicamente idênticas com cadeias alquila deutério-rotulados. 19 , 36 , 37 isto permite completo contraste simultâneo de correspondência do micelle núcleo e casca, que é um recurso exclusivo de dispersão de nêutrons. 35 , 38 com este significativamente refinado nível de detalhe, correspondência de contraste pode habilitar caso contrário inviáveis estudos de estruturas de proteínas de membrana. Além disso, esta abordagem de correspondência de contraste pode ser estendida para outros sistemas que envolvem detergente, como polímero troca reações dispersantes óleo-água e39 ,40 ou até mesmo outros agentes solubilizante, tais como bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloco de copolímeros. 43 A abordagem semelhante como descrito neste manuscrito, mas empregando uma única espécie de detergente com substituições de deutério parcial sobre o grupo alquila de cadeia e/ou cabeça, foi recentemente publicada. 37 enquanto isso pode ser esperado para melhorar a distribuição aleatória de hidrogênio e deutério em todo o detergente em comparação com a abordagem apresentada aqui, o número limitado de posições disponíveis sobre o detergente para substituição e em duas etapas síntese de detergente necessário coloca desafios adicionais para a consideração.

As etapas 1 e 2 do Protocolo detalhado abaixo muitas vezes sobrepõem-se desde o planejamento do experimento inicial deve ser feito para apresentar uma proposta de qualidade. No entanto, a apresentação de proposta é considerada aqui como o primeiro passo para enfatizar que esse processo deve ser iniciado bem antes de um experimento de nêutrons. Também deve ser notado que um passo pré-requisito, que deve ser demonstrado pela proposta, é a caracterização bioquímica e física (incluindo pureza e estabilidade) da amostra apoiando a necessidade de estudos de nêutrons. Uma discussão geral do ângulo pequeno neutrão espalhamento (SANS) está além do escopo deste artigo. Uma introdução breve, mas completa está disponível na obra de referência, Caracterização de materiais por Kaufmann,44 e uma abrangente livro focado em pequeno ângulo solução biológica dispersando recentemente tem sido publicado. 45 -mais leitura recomendada é dado na seção de discussão. Dispersão de ângulo pequeno usa o vetor de dispersão chamado Q como a quantidade de central que descreve o processo de espalhamento. Este artigo usa a definição amplamente aceita Q = 4π sin (θ) / λ, onde θ é meio o ângulo entre o feixe de entrada e dispersado e λ é o comprimento de onda da radiação de nêutron em Angstroms. Outras definições existem que uso diferentes símbolos tais como está ' para o vetor de dispersão e que podem diferir por um fator 2 π ou usando nanômetros no lugar de Angstrom (Veja também a discussão da Figura 10).

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Protocolo

1. preparar e apresentar um nêutron instalação feixe tempo e proposta de instrumento

  1. Consulte os recursos online para identificar instalações de dispersão de nêutrons que fornecem acessar de tempo de feixe de nêutrons usuário geral, como Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa de nêutrons facilidades e informações sobre pesquisa de nêutrons em todo o mundo está disponível online. 46 estar ciente de que estas instalações têm tipicamente regulares convites à apresentação de propostas; Isto determina quando a próxima viga estará disponível. Nêutrons são usados para uma variedade de aplicações; Pesquisar por instrumentos de espalhamento (SANS) ângulo pequeno neutrão, particularmente aqueles com capacidades para amostras biológicas.
  2. Use os recursos fornecidos pelas instalações de nêutrons para ajudar a navegar o processo de submissão de proposta de tempo feixe nêutrons. Consulte com um cientista de dispersão de nêutrons (NSS) que está associado com o instrumento para o qual você irá aplicar. Rever as informações atuais da facilidade nêutrons sobre chamadas de proposta, prazos e conselhos para apresentação; Oak Ridge está disponível on-line. 47 apresente a proposta de tempo de feixe seguindo todas as orientações para uma apresentação bem sucedida.
  3. Se deuterado proteína é requerido (ver 2.2), instalações de dispersão de nêutrons são suportadas frequentemente pelos laboratórios e experiência dedicada à produção de materiais deuterados. Para solicitar acesso ao laboratório da Bio-Deuteration (BDL) em ORNL, selecione o BDL como o segundo instrumento no sistema de proposta. Enquanto a proposta de SANS é revista para viabilidade e por um Comitê de revisão científica, BDL solicitações somente são selecionadas para viabilidade. Para ajudar com a análise de viabilidade BDL, apresentar uma informação preenchido pedido formulário48 que descreve o protocolo de expressão de proteínas e rendimento estimado (disponível on-line).
  4. Após a bem sucedida revisão da proposta de altura da viga, confirme a data premiada do tempo de feixe com antecedência o experimento. Certifique-se de que todos os detalhes de amostra e buffer e fórmulas são listadas corretamente na proposta de revisão adequada. Quaisquer alterações para o plano experimental proposto, incluindo alterações na composição da amostra e buffer, exigem notificação da instalação.
    Nota: As alterações devem ser discutidas tão logo quanto possível com o NSS atribuído.

2. determinar o Neutron contraste Match Points e contraste necessário para a medição da proteína

  1. Reunir informações (a partir de bases de dados online informações sobre o produto do fornecedor, valores publicados, etc.) relativas às composições atômicas e volumes para os componentes do sistema de detergente a ser correspondido por contraste. Esta informação é usada para determinar densidades de comprimento de dispersão de nêutrons (SLDs) e contraste, portanto, pontos de partida (CMPs) em solução, que é fundamental para obter qualidade SANS informações dados e estrutural para a proteína de membrana de interesse no contexto de uma PDC. Uma tabela Resumindo os pontos de partida de propriedades e contraste físicos para detergentes usados em estudos biofísicos de proteínas de membrana é incluído (tabela 1).
  2. Determinar o neutron SLDs usando o aplicativo web MULCh: módulos para análise a de contraste variação dados49 (disponível on-line50 livre-de-carga). Um link para o manual do utilizador está localizado na página inicial. Acessar o site e ler a documentação que o acompanha. Figura 1 e Figura 2 fornecem uma visão geral de contraste módulo de entrada e saída para dois exemplos relacionados.
    Nota: Outros sites de cálculo SLDs estão disponíveis, como o mantido pelo Instituto Nacional de padrões e tecnologia (NIST) centro de investigação de nêutrons. 51
    1. Abra o módulo de contraste clicando em 'Contraste' localizado no painel de navegação esquerdo. Fornecer um texto para um título do projeto e inserir os dados abaixo para dois componentes (por exemplo, detergente grupo cabeça e cauda) como ' subunidade 1' e ' subunidade 2'.
    2. Insira a fórmula molecular para cada componente na caixa de texto 'Fórmula'.
      Nota: O botão de rádio estou ' deve ser selecionada em 'Tipo de substância' para inserir uma fórmula molecular. Além disso, use a letra 'X' na fórmula para indicar os átomos de hidrogênio prontamente trocáveis. Sequências de DNA, RNA ou proteína podem ser inseridas se a correspondente 'P', 'R', ou tinha ' botões de rádio são selecionados. Se várias cópias de um componente existem dentro da subunidade, o valor para 'Nmolecules' pode ser alterado em conformidade. Um exemplo prático aqui refere-se aos lipídios, como detergentes contendo duas caudas idênticas, permitindo a fórmula para uma cauda ser inserida com Nmolecules igual a 2.
    3. Insira o volume em Angstroms cúbicos para cada componente na caixa abaixo o 'Volume (Å3)'. Uso fórmula28 do Heberle para cadeias alquila de comprimento n, V-cauda = 27,4 + n * 26,9, para calcular o volume aproximado de cauda, ou obter volumes moleculares de informações sobre o produto fornecido ou publicados valores em a literatura.
    4. Inserir os dados para componentes de reserva. Alterar o número dissolvido espécies no solvente usando o menu suspenso para adicionar ou remover linhas para cada componente de reserva. No caso de formação de micela detergentes, incluem os monómeros detergentes livre como componentes de reserva separada na concentração de micelle crítico do detergente (CMC).
    5. Clique em 'Enviar' para executar os cálculos de contraste de nêutrons e gerar uma página de resultados que fornece uma tabela de dispersão comprimento densidade e contraste pontos de partida, bem como fórmulas para a determinação desses parâmetros em qualquer determinado percentual de D2O em o buffer. Rever os parâmetros de dispersão com especial atenção para os componente CMPs. Se os pontos de partida são semelhantes (dentro de 10% D2O) e a concentração livre micelle é baixa e, em seguida, a média CMP pode ser utilizados para correspondência de contraste as contribuições de detergente. Na maioria dos casos, o CMP do detergente grupo cabeça e cauda serão diferentes em mais de 10-15%, produzindo um fator de forma de núcleo-casca nos dados de SANS que ofusca a recolha directa do sinal do espalhamento da proteína sozinho.
  3. Avalie o contraste entre o detergente grupo cabeça e cauda. Quando o detergente principal grupo e alquil cadeia cauda CMPs não são bem-acompanhado, a disponibilidade e a incorporação de um detergente de deutério-substituídos podem permitir dispersando as densidades de comprimento de selecionar os componentes a ser manipulado. Na maioria dos casos, isso exigirá formando uma micela mista através da incorporação de um detergente idêntico com cadeias alquila deutério-substituídos. A adição de deutério aumenta a densidade de comprimento de dispersão do núcleo formado pelas caudas de cadeia alquila. O ponto de extremidade desejado, neste caso, é tal que a cabeça do grupo shell CMP e núcleo de cadeia alquil CMP tem valores aproximadamente iguais.
    1. Levante o CMP do núcleo micelle detergente para ser aproximadamente igual da CMP de shell do grupo cabeça, determinando a relação apropriada de mistura entre h-caudas e d-caudas que atinge o completo contraste correspondência com os grupos de cabeça. Um pré-requisito para esta determinação é conhecimento da CMP para uma cauda de cadeia alquil deutério-substituídos. Uma contrapartida comercialmente disponíveis para n-dodecil-β-D-maltoside (DDM) está disponível com hidrogênio de cadeia alquil todo substituído por deutério (d25-DDM). Repita os cálculos de contraste descritos no passo 2.1 para uma cauda tinha ' no lugar 'h-cauda'.
    2. Calcule a relação de mole de h-cauda a cauda d necessária para correspondência de contraste com o grupo cabeça CMP. A fórmula a seguir pode ajudar com esta determinação:
      CMPcabeça = CMPh-cauda * χh-cauda + CMPd-cauda * χd-cauda
      onde a CMP é a densidade de comprimento de espalhamento e χ é a fração de volume para o componente de detergente cabeça, cauda-h, ou d-cauda. Para soluções em buffer da DDM, incorporação de 44% em peso (43% por mole) do detergente total como d25-DDM com cadeias alquila deutério-substituídos produz um único CMP em 48,5% D2O para componentes de cabeça e caudos.
  4. Considere o grau de substituição de deutério para a proteína de membrana. Para medir o suficiente sinal de dispersão da proteína, a CMP para a proteína deve ser de pelo menos 15% D2O em solução longe do detergente CMP e condições de medição. O sinal aumenta com o quadrado desta diferença de %. Desde que o CMP de uma proteína sem rótulo normalmente ocorre com ~ 42% D2O em solução (semelhante a muitos grupos de cabeça detergentes um CMP), deutério rotulagem da proteína é quase sempre uma necessidade. 52

3. express e purificar a proteína de membrana de interesse

  1. Preparar meio LB (caldo lisogenia) e crescer Escherichia coli (e. coli) células abrigando um vetor de expressão inducible da sequência da proteína alvo.
    1. Prepare a mídia mínima. H2O ou D2O, dissolver 7,0 g/L (NH4)2então4, 5,25 g/L, Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, citrato de hidrogênio diamónio 0,50 g/L, glicerol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20% w/v MgSO 4·7H2O e 1,0 mL/L de metais de traço Holme (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L de CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L at2EDTA·2H,2O e 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparar soluções adequadas de estoque de antibióticas, usando H2O ou D2O.
    3. Prepare uma solução stock de isopropil-β-D-1-thiogalactopyranoside usando H2O ou D2O.
    4. Estéril-filtro todas as soluções em secam, recipientes esterilizados usando vácuo garrafa-top e seringa de filtros com um tamanho de poros de 0,22 micron.
  2. Adaptar-se as células de Escherichia coli deutério-rotulado médio anteriores ao aumentar para superexpressão de uma proteína deuterada.
    1. Inocule 3 mL de meio LB com uma colônia isolada de uma placa de ágar caldo lisogenia (LB) ou células de um estoque de glicerol congelado. Desenvolvem-se células a 37 ° C numa incubadora de agitação a 250 RPM ou reduzir a temperatura de 30 ° C ou abaixo para evitar o crescimento excessivo da cultura quando incubando durante a noite.
      Nota: O procedimento de adaptação pode ser variado. 55 , 56 , 57
    2. Uma vez que a cultura LB tem crescido a uma densidade óptica em 600 nm (OD600) de ~ 1, diluí-lo 01:20 em 3 mL de meio mínimo de H2O e crescem a um OD600 ~ 1. Repita as 01:20 diluições com meio mínimo contendo 50, 75 e 100% D2Ó (ou até a porcentagem desejada de2O D).
      Nota: como o D2O teor é aumentou, taxas de crescimento irão diminuir. A relação entre a porcentagem de2O D na substituição de mídia e deutério crescimento da proteína tem sido relatada na literatura. 58 , 59 , 60
    3. Continue a crescer a cultura em um biorreator para aumentar o rendimento de massa celular deuterado (Figura 3).
      Nota: Procedimentos passo a passo para a operação do biorreator foram revistos em outro lugar. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Colheita e lyse pilhas de Escherichia coli para purificação de extração e proteínas de membrana
    1. As células de pelotas por centrifugação a ~ 6.000 x g durante 30-45 min a 4 ° C.
    2. Suavizar o centrifugado por imersão em buffer no gelo para ~ 30 min. Então, suavemente resuspenda o pellet de células no buffer pipetando suavemente com uma pipeta sorológica, ou suave balançar sobre um roqueiro 2D, para uma concentração final de 1 ~ g celulares molhado massa/10 mL de tampão.
      Nota: um buffer de exemplo é 50 mM HEPES (ácido 4 de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic), pH 7,5, 200 mM NaCl suplementado com um comprimido de inibidor de protease.
    3. Lyse pilhas ressuspensa com três passagens através de um homogeneizador de alta pressão de 10.000 psi enquanto o fluxo de refrigeração.
      Nota: Dependendo da escala necessária, outros métodos de Lise podem ser usado (por exemplo, pela imprensa francesa ou sonication).
    4. Detritos de célula da pelota por centrifugação a ~ 4.000-5.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Repita este passo até que o sobrenadante é esclarecido.
    5. Se (~ 150.000 x g durante 30-45 min) o sobrenadante da etapa anterior, que contém o solúvel e fracções de membrana. O sedimento após ultracentrifugação contém a fração de membrana.
    6. Resuspenda o pellet de membrana em um grande homogenizacao homogenizador e isolar a fração de membrana novamente por ultracentrifugação (etapa 3.3.5). Repita este passo pelo menos uma vez para remover proteínas frouxamente ligadas.
    7. Solubilize membranas tocando rock suave para ~ 30 min a 4 ° C em um buffer contendo detergente adequado para a purificação. Solubilização é aparente quando a suspensão gira de nublado para transparente. Remova o material insolúvel por ultracentrifugação (~ 150.000 x g durante 30-45 min).
      Nota: Um buffer de exemplo é 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM de NaCl, imidazol 20mm e 4% (p/v) DDM para purificação por cromatografia de afinidade do Ni2 + .
  4. Purifica a proteína seguindo um protocolo previamente desenvolvido para formas protonadas.
    Nota: Ver neto et al . para um protocolo de depuração de exemplo para um hexahistidine com a tag M. marisnigri JR1 intramembrane aspartil protease (d-MmIAP). 65 o rendimento final era ~ 1 mg de deuterado de crescimento de cultura de células deuterado 5 L, que foi usado no experimento de SANS (Figura 4).
  5. Troca a proteína purificada para o Buffer de troca"Final" para a correspondência de contraste.
    1. Preparar 200 mL de "Buffer de câmbio Final" contendo a mistura correta para contraste de correspondência, por exemplo,20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM de NaCl e 0,05% total DDM (0,028% DDM e 0,022% d25-DDM) em 49% D2O.
    2. Equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com > 2 volumes de coluna (CV) de "Buffer de câmbio Final" em 3.5.1 usando um sistema rápido proteína líquida cromatografia (FPLC).
    3. Após a injeção da amostra, executar a coluna e isolar frações correspondente à proteína de interesse.
    4. Concentre a proteína para a concentração final desejada (2-5 mg/mL).
      Nota: Um volume de ~ 300 μL é exigido para preencher uma cubeta de quartzo cilíndrica 1 mm usada para SANS.
    5. Reserve uma parte alíquota do buffer correspondente para SANS subtração de fundo.
      Nota: A alíquota pode ser tomada diretamente do buffer preparado, ou idealmente de uma fração de eluição limpo no final da execução de FPLC.

4. fazer os preparativos finais para tempo de feixe e coletar sem dados

  1. Depois que a proposta foi aceite e acesso ao site tenha sido aprovado, complete a formação necessária com antecedência o tempo atribuído feixe. Isso inclui prearrival, bem como laboratório radiológico, no local e formação de instrumento específico de treinamento baseado na web.
    Nota: Requisitos de formação pode ditar a chegada antecipada para usuários iniciantes. Mais informações estão disponíveis online. 66
  2. Carregar amostras e buffers para coleta de dados.
    Nota: Uma visão geral sobre a dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico (Bio-SANS) área de ambiente de amostra instrumento é mostrada na Figura 5.
    1. Carregar amostras e buffers em células de quartzo. Células de quartzo estão disponíveis a partir do cientista de instrumento ou instalação. Use gel de carregamento dicas para acessar a estreita abertura da maioria das amostras de células.
    2. Certifique-se de que o obturador do feixe está fechado, então abordar a área de meio ambiente de amostra e coloque as células de quartzo no cambiador da amostra. Grave a posição do cambiador de amostra para cada célula de amostra.
    3. Verifique a área e garantir que o caminho do feixe é livre de obstrução, em seguida, deixar a área de meio ambiente de amostra e abrir o obturador de feixe.
      Nota: Cuidadosamente siga os regulamentos e as regras de instalação, obedecer a todos os comentários e ouvir conselhos do cientista instrumento. Amostras não podem ser removidas do feixe e manipuladas após a exposição ao feixe sem seguintes precauções especiais. Consulte com um técnico de controle radiológico (RCT) antes destes procedimentos.
  3. Executar a varredura da tabela, para coleta de dados automatizado
    1. Opere o aparelho através do controle personalizado software baseado em LabVIEW, ambiente de controle de instrumento espectrômetro (SpICE). Siga as instruções para operação do instrumento fornecido pelo cientista Neutron Scattering. Uma visão geral das janelas de operação de varredura de tabela é fornecida na Figura 6.
    2. Depois de inserir as informações necessárias nas áreas apropriadas, executar a varredura da tabela, e começará um processo de coleta de dados automatizada. Monitorar o progresso através da guia 'Table Scan Status'.

5. reduzir sem dados de imagem 2D para lote 1D

  1. Identifica cada arquivo de dados de amostra e reserva dos números gravados de varredura. Cada medição será atribuída um número exclusivo de varredura. Esta informação é útil durante a redução de dados para identificar cada amostra correspondente e um par de reserva.
  2. Usar o software MantidPlot e script Python para redução
    1. Usuários de dispersão de nêutrons são fornecidos com os dados de conta para acessar seus dados no Cluster de análise remota. 67 logar ao Cluster de análise remota e executar "MantidPlot" na linha de comando. Figura 7 e Figura 8 são fornecidas para auxiliar estes passos.
    2. Obter um certificado de redução do usuário do cientista de dispersão de nêutrons (isso normalmente irá acontecer durante o experimento); Este script é baseado em Python e conterá todos os necessária calibração e ajustes de dimensionamento para reduzir a imagem de dispersão 2D em um terreno de 1D de intensidades espalhadas em função do ângulo de dispersão, I(Q).
    3. Abra o Script de redução de usuário fornecido no MantidPlot e coloque os números correspondentes de varredura ou identificação para os pares de amostra e reserva em lista apropriada.
    4. Execute o script para gerar redução de dados como um arquivo de texto de quatro colunas (ordem de coluna é Q, I(Q), I(Q) erro, erro de Q) no local especificado. O espaço de trabalho adequado em MantidPlot com o botão direito e selecione "Enredo com erros..." para um exame inicial dos perfis de dispersão.

6. analisar os dados para os parâmetros estruturais da partícula da dispersão

  1. Transferi o arquivo de redução de dados do servidor de análise para um computador local usando a transferência de arquivos FTP segura. Isso pode ser realizada com o uso de software como o FileZilla ou CyberDuck. Instruções adicionais e detalhes para se conectar ao sistema de arquivos do servidor de análise são fornecidas na página de login do analysis.sns.gov.
  2. Baixe o ATSAS software suite65,68 (suíte ATSAS toda). 69 programas individuais70 também estão disponíveis online para analisar os dados SANS, ou seja, determinar os parâmetros estruturais e modelos ab initio .
    Nota: Muitas opções estão disponíveis para SANS análise de dados de macromoléculas. 45
  3. Use PRIMUS71 para plotagem de dados, dimensionamento e subtração e Guinier análise de buffer.
    1. Lançar o ATSAS 'Análise de dados SAS' aplicativo e carga reduzidas dados arquivos correspondente ao par de amostra e buffer.
      1. Para dimensionar corretamente o buffer, selecione um intervalo de dados em alta Q (Q > 0,5 Å-1) onde ambos os perfis são semelhantes e plana e clique no botão de 'Escala', localizado sob as 'operações' guia. Um fator de escala será aplicado para o buffer de tal que estas duas regiões planas devem se sobrepor. Cuidado: deve haver uma razão física plausível que justifique a escala da intensidade de tampão para coincidir com a amostra. Se a discrepância é grande, consulte uma cientista de instrumento para abordagens válidas para subtração de fundo. 44 , 45 , 72
      2. Aumente o intervalo de dados para exibir todos os pontos. Clique em 'Subtrair' para executar esta operação. Botão direito do mouse o datafile reserva-subtraído na legenda e salvar este arquivo para análise posterior. Figura 9 descreve o uso da guia 'Operações'.
    2. Realizar uma análise de Guinier os subtraído de buffer de dados de exemplo usando a aba 'Análise' do aplicativo 'Análise de dados SAS'.
      1. Certifique-se de que o arquivo apropriado é selecionado na lista e clique em 'Raio de giração'. Será fornecida uma tentativa automatizada para executar um Guinier caber clicando no botão 'Autorg'.
      2. Expandir o intervalo de dados usados para incluir todos os dados de baixo-Q e começam a restringir o intervalo de dados, tira pontos de alta-Q até o Qmax * Rg limite é abaixo de 1,3. Use o enredo dos resíduos para verificar que os dados são lineares na faixa de ajuste. O Guinier caber produz uma aproximada Rg e0 para as partículas de dispersão.
      3. Fazer pequenos ajustes para a região de ajuste e monitorar a sensibilidade destes valores para o intervalo de dados usados no ajuste. Figura 10A demonstra o uso da ferramenta 'Raio de giração'.
  4. Obter a função de distribuição de probabilidade (P(r)) em GNOM. 73 o arquivo de saída gerado aqui irá ser usado como uma entrada para o ab initio processo de modelagem.
    1. Iniciar o assistente de distribuição de distância dentro da Tab. 'Análise' obtendo um bom ajuste aos dados é essencial para a obtenção de um modelo de qualidade. Para obter mais informações sobre como obter ajustes precisos, por favor, consulte o revisão de74 por Putnam, et al
      Nota: O GNOM programa fornece informações adicionais sobre o ajuste além do assistente de distribuição de distância. Figura 10B demonstra uso adequado da ferramenta 'Distribuição de distância', e a Figura 11 ilustra alguns dos erros comuns encontrados.
    2. Determine Dmax, a máxima distância interatômicas dentro da molécula.
      1. Estimar um valor para Dmax, desmarcando a caixa para forçar Rmax = 0 e inserindo um valor grande para Dmax (150 Å, por exemplo). O primeiro x-intercept na trama de reacionamento produz esta estimativa.
      2. Fazer alterações incrementais a esse valor Dmax e intervalo de dados usados ou número de pontos utilizados no ajuste para otimizar o GNOM apto para os dados e a curva resultante de reacionamento.
    3. Continue a aperfeiçoar o ajuste GNOM e salvar os arquivos de saída GNOM com boas ajuste parâmetros para posterior ab initio etapas de modelagem.
  5. Simule SANS perfis de modelos de alta resolução PDB usando o programa CRYSON. 75
    1. Abra o programa e selecione a opção '0'. Selecione o nome do arquivo PDB no navegador de arquivos de pop-up. Pressione enter para aceitar as configurações padrão, exceto para especificar a cadeia deuteration frações e a fração de D2O no solvente para alcançar os parâmetros de contraste adequado.
    2. Ajuste o modelo a um conjunto de dados experimental inserindo 'Y' e selecionar o arquivo de dados no navegador de arquivos de pop-up. Aceite os valores padrão restantes, e arquivos de saída serão gravados no local do arquivo PDB. Arquivo de 'Fit' contém informações para o perfil de dispersão previsto partir do modelo 3D de alta resolução.

7. criar modelos Ab Initio da sem dados.

Nota: DAMMIF76 e77 dentro da suite de software ATSAS de DAMMIN é usado para reconstruir modelos de átomo fictício (barragens) usando um processo de recozimento simulado de saída, que contém dados de reacionamento, ou obter informações sobre a probabilidade o GNOM ou frequência de distâncias interatômicas dentro da partícula de dispersão. Esses programas podem ser executados no modo em lotes ou no servidor web ATSAS-Online.

  1. Iniciar o assistente de forma PRIMUS do botão 'Dammif' na guia 'Análise' ' SAS da análise de dados' e usar uma seleção manual dos parâmetros. A entrada para o assistente é ilustrada na Figura 12.
    1. Definir o intervalo de Guinier de ajuste (etapa 6.3.2) e prossiga para a próxima etapa usando os botões de navegação. Definir valores de ajuste do terreno de reacionamento (etapa 6.4) e prossiga para a próxima etapa.
    2. Fornece parâmetros para o ab initio processo de modelagem. Digite um prefixo para os nomes de saída do modelo (por exemplo, SANSEnvelope), escolher a modelagem de qualquer modo 'rápido' ou 'lento', digite um valor para o número de modelos (17 recomendado para significância estatística), selecione uma das opções disponíveis para a simetria das partículas, anisometry e escala angular (se conhecido). Certifique-se que as caixas são verificadas para modelos médios com DAMAVER e refinam o modelo final com DAMMIN.
    3. Inicie o processo usando o botão de 'confirmação'. Uma vez que o processo estiver concluído, exibir e salvar o diretório de trabalho.
      Nota: O processo de modelagem típico para uma única, pequena proteína pode demorar até algumas horas com um computador pessoal típico. Arquivos são armazenados em diretórios temporários até que salvou.
  2. Sobreposição e sobrepor a final SANS envelope com um modelo de alta resolução relacionado usando SUPCOMB dentro ATSAS. Coloque uma cópia do modelo PDB de alta resolução para estar apto para o envelope SANS no diretório de trabalho. Executar SUPCOMB na linha de comando usando os nomes de arquivos PDB como dois argumentos com a estrutura de modelo listado primeiro: supcomb $ HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: O nome do segundo ficheiro listado será reescrito como um novo arquivo com um "r" anexado ao final e ter novas coordenadas para sobreposição sobre a estrutura do modelo.
  3. Visualize os resultados ab initio modelo usando PyMOL (pymol.org), um programa de visualização de gráficos 3D molecular. Figura 13 fornece uma visão geral das operações PyMOL.
    Nota: Existem diretrizes de publicação para a modelagem estrutural de dados pequeno ângulo de dispersão de biomoléculas em solução. 78
    1. Iniciar o aplicativo PyMOL e abrir os arquivos. pdb correspondente para o 3D SANS envelope e a estrutura de alta resolução SUPCOMB-alinhados para ser visualizado.
    2. Visualize o envelope SANS representando este modelo como uma superfície. Clique do ' botão ao lado do modelo e selecione ' Mostrar: como: superfície '.
    3. Visualize a estrutura da espinha dorsal da proteína de alta resolução por que representa este modelo como um desenho animado. Selecione do ' botão ao lado deste modelo e selecione ' Mostrar: como: Cartoon'. Exibir a cadeia como um arco-íris de N - a C-terminal, selecionando o botão 'C' e ' pela cadeia: 'Chainbows.
    4. Modifica a transparência da representação da superfície para maior clareza. Barra de menu de 'Configuração', selecione ' transparência» superfície» 40% '.
    5. Fazer o fundo branco e não-opaco. Barra de menu 'Exibir', selecione ' fundo»' e selecione 'Opaco' para desmarcar essa opção e 'Branco' para marcar essa cor para o fundo.
      Nota: as operações adicionais e usos para PyMOL podem ser encontrados em PyMolWiki.org.

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Resultados

Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta devem incluir info...

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Discussão

Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A disponibilidade comer...

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Divulgações

Os autores Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver são contratados através de UT-Battelle nos DOE para apoiar o programa de usuário ciência nêutrons e Bio-SANS instrumento no Oak Ridge National Laboratory usado neste artigo.

Este manuscrito tem sido co-autoria de UT-Battelle, LLC, sob contrato DE-AC05-00OR22725 com nos departamento de energia (DOE). O governo dos EUA mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos EUA mantém uma licença não exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado este manuscrito ou permitir que outros a fazê-lo, para fins de governo dos Estados Unidos. DOE fornecerá acesso público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público do DOE. 82

Agradecimentos

O escritório de biológica e investigação ambiental apoiaram pesquisa do ORNL centro de Biologia Molecular estrutural (CSMB) e Bio-SANS usando recursos suportados pela divisão de instalações científicas usuário, escritório de ciências básicas de energia, departamento dos EUA de energia. O trabalho estrutural em proteínas de membrana no laboratório de Lieberman foi apoiado pelo NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa laboratórioEMD MilliporeUFC905096
Citrato de amônio dibásicoFisher ScientificA663componente médio
Sulfato de amônioEMD Millipore2150componente médio
Bioflo 310 Sistema de biorreatorEppendorfM1287-2110equipamento
Cloreto de cálcio di-hidratadoAcros423525000componente médio
CarbenicilinaIBIAntibióticoIB02025
CloranfenicolEMD Antibiótico Millipore3130
Cloreto de cobalto (II)AcrosAC21413-0050componente médio
Sulfato de cobre (II)AcrosAC19771-1000 componente médio
Óxido de deutérioSigma-Aldrich756822Purificador
gás DrieriteW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, dissódico, di-hidratadoEMD Millipore4010componente médio
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3equipamento
Ä Purificador kta UPC100GE Healthcare equipamento
GlicerolSigma-AldrichG5516componente médio
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colunaGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Cloreto de ferro (III) hexahidratadoMP BioquímicosICN19404590componente médio
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Sulfato de magnésio heptahidratadoVWR97062-134componente médio
Sulfato de manganês(II) monohidratadoAcrosAC20590-5000componente médio
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated ShakerThermo ScientificSHKE6000-7 equipamento
n-Dodecil-d25-β-D-maltopiranosídeoAnatraceD310T
n-Dodecil-β-D-maltopiranosídeoAnatraceD310A
Fosfato de potássio monobásicoVWR97062-346componente médio
RC 6 Plus CentrífugaThermo Scientific Sorvall46910equipamento
SIGMAFAST comprimidos de coquetel inibidor de protease, Cloreto deSigma-AldrichS8830
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich
Fosfato de sódio dibásicocomponente médioSigma-AldrichS7907
m Membrana PESVWR28145-501Labware
Filtro de topo de garrafa descartável estéril com 0,2µ m Membrana PESThermo Scientific596-4520 material de laboratório
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
coluna Superose-12 10/300 GL GE Healthcare 
Ultrospec 10 Medidor de Densidade de CélulasGE Healthcare 80211630equipamento
Sulfato de zinco monohidratadoAcrosAC38980-2500 componente médio
Material de científicode de componente médio 17116701 sódio sem EDTA S3014 Sigma-Aldrich 795429 Filtro de seringa estéril de 25mm de com 0,2µ1751750117517301

Referências

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