Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

Identificar e compreender a especificidade que regem a proteína montagem complexa na vivo são de extremo interesse para pesquisadores bioquímicos. Grande proteína heterogêneos assemblies são a norma e não a excepção. Esta noção é suportada pelo monitoramento espectroscópico na vivo assembly, isolando complexos utilizando técnicas de interrupção de célula mais suaves, avaliando produtos a partir de métodos de purificação baseada na afinidade e visualizando-os usando alta resolução microscopia de elétron criogênica (cryo-EM). Para entender o controle de especificidade de montagem dentro da célula, pesquisadores devem rotineiramente isolar, identificar e caracterizar em última análise, estas estruturas dinâmicas de montagem/desmontagem. A ferramenta molecular mais utilizada para identificar os componentes destes conjuntos frequentemente requer imunoprecipitação baseados em anticorpos, que se baseia na manutenção da estabilidade dos complexa durante o rompimento da pilha. Diversas técnicas analíticas acopladas recentemente foram desenvolvidas para capturar complexos de amostras de células usando microfluidic com base em abordagens, tais como ressonância de plasmon de superfície (SPR). Após a remoção das superfícies SPR, estas amostras foram analisadas pelo tempo de dessorção/ionização do laser assistida por matriz de voo (MALDI-TOF)^1,2. Avançando nesta metodologia usando protocolos mais fácil permitirá que pesquisadores Visualizar e validar previstos complexos que ocorrem no ambiente celular. Desde SPR é um sistema baseado em microfluídica, surgem muitas vezes problemas da formação de agregados. Contornar este problema requer diluição da amostra, que por sua vez, pode diminuir a integridade dos complexos biológicos susceptíveis de concentração.

Um avanço relativamente recente em tecnologias de etiqueta-livre é o desenvolvimento do sistema interferometria (BLI) biolayer³. Estes particular à base de luz de reflectância emulam sistemas replicar, ou melhores, vinculação de SPR e cinéticos resultados em uma fração do custo^3,4 particularmente se são usadas unidades de canal único. BLI mede alterações em padrões de interferência de luz refletida entre uma camada de referência (controle) e a superfície biolayer (experimental). A mudança resultante na fase é medida em tempo real como uma leitura cinética e quantitativo⁵. A superfície de biosensor, contendo produtos químicos específicos de imobilização, fisicamente é transferida entre soluções, em vez de alterações de reserva por abordagens microfluidic em SPR, para medição através de desvios de fase de comprimento de onda. Efeitos de transferência de massa são impedidos por agitar a solução. Ao contrário da SPR, estes sistemas são bastante úteis na avaliação de complexos de amostras biológicas brutos. O parâmetro físico medido durante BLI experiências principalmente depende de uma mudança em massa ou espessura da superfície de biosensor que resulta da proteína complexa montagem ou desmontagem.

Estes biossensores de fibra óptica são relativamente baratos e fáceis de usar. Um aspectos úteis do BLI emergentes é a fácil remoção de complexos de proteína recém montado da superfície. Uma recente aplicação deste método permitida o nosso laboratório para observar a cinética de tempo real de pH em grande escala induzidas pelo rearranjo de estrutura da proteína do componente antígeno protetor (PA) toxina antraz como o prepore (PA_prepore) a transição para sua formulário de poros (PA_pore). Verificou-se esta transição na ponta biosensor usando microscopia de elétron (EM)⁶. Remoção de complexos de superfícies biosensor evita maiores efeitos de diluição de volume frequentemente encontrados ao liberar complexos de superfícies da microplaqueta ao usar sistemas de microfluídica.

No trabalho atual, complexos de toxina antraz são montados e desmontados na superfície biosensor e em seguida lançados em volumes microlitro. Os componentes complexos resultantes são validados usando ortogonalmente EM e espectrometria de massa (MS).

1. montagem de complexos macromoleculares definidos em superfícies de Biosensor Biolayer interferometria (BLI)

1. Montagem de toxina antraz prepore complexa sobre uma superfície de biosensor reativa amina PDEA-modificado
   1. Hidratar uma amina reativa segunda dica de biosensor BLI geração (AR2G) em 250 µ l de água por dez minutos.
   2. Programa vezes passo, listados na tabela 1, sobre o software que controla a unidade BLI (ver Tabela de materiais).
   3. Começar a BLI executar imergindo a ponta de biosensor em 250 µ l água por 30 s para medir uma base inicial de espessura biosensor e densidade.
   4. Ativar o biosensor imergindo a ponta em 250 µ l NHS (N-Hidroxisuccinimida) de 50 mM e 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) por 7 minutos.
   5. Mergulhe o biosensor registrado em 50 milímetros PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) dissolvido em tampão de borato 0,1 M (pH 8,5) por 5 minutos para gerar uma superfície thiol-reativos registrada.
   6. Mergulhe o biosensor thiol-reativos registrado em 250 µ l de solução contendo 100 nM E126C se_N em 10mm de sódio acetato de pH 5,0, 100 mM de NaCl, buffer por 5 minutos.
   7. Mergulhe a ponta se_N em 50 mM L-cisteína, 1 M NaCl, acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, durante 4 minutos, para saciar qualquer restantes grupos tiol-reativa livre reativos.
   8. Mergulhe a ponta se_N extinta em 50 mM Tris, 50mm NaCl por 2 minutos para estabelecer base de reserva.
   9. Mergulhe a ponta se_N extinta prepore de antígeno protetor 0,5 µM (PA_prepore), 50 mM Tris, 50mm NaCl por 5 minutos para criar o se_N-PA_prepore complexo.
   10. Uma vez PA_prepore está associado, remova a ponta da solução PA_prepore e mergulhar a ponta 50 mM Tris, 50mm NaCl por 30 segundos para lavar qualquer limite não especìfica PA_prepore.
   11. Imergir o se_N-PA_prepore complexo receptor de CMG2 0,5 µM (sem o domínio transmembrana), 50 mM Tris, 50 mM de NaCl, por 5 minutos.
   12. Imergir o se_N-PA_{prepore -}CMG2 complexo 50 mM Tris, 50mm NaCl por 30 segundos para lavar qualquer CMG2 não acoplado ao formulário pre-CDDP complexo.
   13. Para a análise EM liberar o se_N-PA_prepore-CMG2 complexo da ponta biosensor imergindo a ponta em 5 µ l de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50mm NaCl, dentro de um tubo PCR.
   14. Para análise de MS em tandem dos peptides do complexo, liberar o se_N-PA_prepore-tubo de GuHCl (queratina-livre), pH de 25mm bicarbonato de amónio 8.0 dentro um PCR CMG2 complexo da ponta biosensor imergindo o biosensor em 5 µ l 50 mM DTT, 6m . Isto é realizado em um biossensor diferente daquele usado para análise de EM.
2. Montagem de toxina antraz de poro complexa na superfície de PDEA-modificado amina reativos biosensor
   1. Para visualizar o complexo após transição pH, executar etapas 1.1.1-1.1.12 na seção anterior para gerar o se_N-PA_prepore-CMG2 complexo.
   2. Mergulhe a ponta biosensor em um pH de acetato de 10mm 5.0 por 5 minutos para iniciar a transição da PA_prepore a transição de PA_pore . Esta transição é indicada pelo aumento da amplitude (aproximadamente 0.2 nm) seguido por um declínio de amplitude maior que é a hipótese de ser a dissociação do receptor substancial ou total devido à diminuída afinidade de ligação.
   3. Mergulhe a ponta de_pore se_N-PA em 50 mM Tris, 50mm NaCl, pH 8.0, por 30 segundos para lavar tampão ácida.
   4. No exemplo EM análise, mergulhe a ponta biosensor em uma solução contendo micelas 1.25 mM (2,5 mM MSP1D1, 25mm nd-colato, 162,5 mM POPC) por 5 minutos para evitar a agregação em solução após a liberação do bissulfeto.
   5. Para análise EM, liberar o se_N-PA_{poro -}complexo da ponta biosensor Micelle imergindo a ponta em 5 µ l de 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50mm NaCl dentro de um tubo PCR.
   6. Por análise de MS em tandem dos peptides do complexo, divulgar se o_N-PA_poore complexo (não micelle) do biosensor dica imergindo o biosensor em 5 µ l 50 mM DTT, 6 M GuHCl (queratina-livre), pH de 25mm bicarbonato de amónio 8.0 dentro uma PCR tubo. Isto é realizado em um biossensor diferente daquele usado para análise de EM.

2. Visualizar e validar lançaram Macromolecular Assemblies de biosensores BLI por microscopia electrónica de mancha negativa

1. Brilho de descarga uma grade de Cu 300 carbono revestido. Configurações de descarga típico brilho são 0,38 mBar atmosfera estável pressão, negativos 15 mAmps, 20 segundos, em seguida, ventilação com ar.
2. Grade segura entre um par de pinças limpos.
3. Pipete 4 µ l de amostra complexa lançada no tubo do PCR para o grid e permitir a adsorção para 60 anos.
4. Pavio-distância restante líquido com uma rodela de papel de filtro.
5. Manche a grade por pipetagem 5 µ l de 0,75% 0,02 mícron filtrada formiato de uranilo e wicking mancha excesso fora depois de 5 segundos. Permitir que a grade secar à temperatura ambiente.
6. Ver os grades manchada de amostra usando um microscópio eletrônico de transmissão.

3. identificação de completa pré-CDDP Anthrax toxina complexo (se_N-Pa_prepore-CMG2) e espectrometria de massa usando uma transição complexa (se_N-Pa_pore sem CMG2).

1. Diluir as amostras lançadas a 20 µ l e incubar durante 1 hora.
2. Adicionar 2 µ l de iodoacetamide de 55mm, 25mm bicarbonato de amônio, pH 8.0 e incubar durante 1 hora em temperatura ambiente no escuro (coberto com papel alumínio).
3. Dilua a amostra com 100 µ l de bicarbonato de amónio de 25 mM, pH 8.0, para reduzir a concentração de cloridrato de guanidina abaixo de 1 M.
4. Adicionar 5 µ l de sequenciamento tripsina grau modificado em 20 ng / µ l e incubar a 37 ° C durante a noite.
5. Adicionar o ácido acético glacial para uma concentração final de 5% para reduzir o pH a < 3, então, reduzir o volume de 10 µ l em vácuo concentrador.
6. Transferi a solução de peptídeo para a placa da amostra sobre o mostruário do nLC 1200 uHPLC.
7. Carrega 5 µ l da solução de peptídeo sobre uma coluna de fase reversa de uHPLC montada no palco da ionização do MS.
8. Lave a coluna com 15 µ l de 0,1% de ácido fórmico a uma taxa máxima de 5 µL/min e/ou pressão máxima de 800 psi.
9. Eluir peptídeos da coluna fase reversa C18 com um caudal de 350 nL/min durante um período de 90 min usando um gradiente linear de 5% a 40% do solvente B em A + B (solvente a: 0,1% de ácido fórmico; solvente b: 95% acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico).
10. Analise a eluição peptídeos em linha usando em tandem MS.
    1. Defina a origem de ionização de 2500 volts e temperatura de transferência de iões para 250 ° C.
    2. Operar o espectrômetro de massa sob controlo automático para realizar continuamente uma verificação de MS, seguida por tantos em tandem MSMS quanto possível em um período de 3 s, usando o CID e uma energia de colisão normalizado de 35.
11. Identifica componentes de peptídeos e proteínas usando métodos padrão. Para este trabalho, foram realizados dois conjuntos de análise de peptídeos e proteínas.

A capacidade de monitorar e validar a montagem de grandes complexos macromoleculares é um passo crucial para compreender a especificidade e a funcionalidade dos grandes biomolecular assemblies. Os resultados dos métodos aqui apresentados demonstram a facilidade com a quais grandes complexos de proteínas (> 150 kDa em massa) pode ser montado usando interferometria de biolayer, ao mesmo tempo monitorando a cinética e a amplitude do assembly. A natureza única compacta da superfície biosensor permite a análise de montagem ser estendido liberando complexos montados na pequena microvolumes. Estes microvolumes pode ser usados para visualizar a estrutura física inicial dos complexos usando EM e para verificar a identidade dos componentes do complexos usando MS. Uma visão esquemática de todo esse processo é mostrada na Figura 1.

Um elemento-chave para o sucesso conjunto e verificação do complexo macromolecular na superfície biosensor envolve a orientação adequada da proteína semente inicial. Isso garante que os sites de interação da proteína-proteína são acessíveis, não estericamente bloqueada e idealmente posicionado longe da superfície biosensor. Como mostrado na Figura 2, a orientação adequada da toxina antraz complexa é conseguida usando um fragmento N-terminal projetado especificamente do factor letal (seN) para o sítio de ligação doprepore seN-PA está sempre posicionado oposto do biosensor ligação covalente local6,7. O acúmulo subsequente do complexo com vinculação de PA para o biosensor seN BLI seguido solúvel CMG2 ligação para PA, finalmente, cria uma toxina antraz competente de translocação complexa.

O rastreamento de sensogram BLI é uma leitura em tempo real sem as alterações de amplitude devido a adição específica dos componentes toxina antraz como eles são adicionados para o biosensor. A Figura 3 mostra com que um traço representativo emparelhado um modelo do complexo previu a forma em que etapa do processo. A primeira ascensão é seN carregando a ponta. Após têmpera e linha de base, PAprepore em seguida, vincula seN seguido pela adição de solúvel do receptor de CMG2 resultando no complexo montado pre-CDDP de seN-PAprepore-CMG2. Para o progresso em direção o tarde endossomo ambiente, todo o complexo é submetido a um pulso de baixo pH (pH 5.0) que enfraquece o receptor da ligação, permitindo que o prepore fazer a transição para a sua conformação de poros de membrana estendida inserida. 6 Sensogram traços da etapa de acidificação são mostrados na Figura 4. O aumento inicial ou 'pico' na amplitude é provável que a extensão dos poros6 que deve ocorrer antes da diminuição da ligação ao receptor CMG2. O declínio de amplitude maior é mais provável receptor substancial ou total dissociação, devido à afinidade de ligação diminuída. Trabalhos anteriores neste laboratório indicam CMG2 ligação para o totalmente estendida PApore é insignificante em comparação com a interação deprepore CMG2-PA6. Além disso, o rastreamento de cinética de sensogram, observada em todos os sensograms de seN-PAprepore-CMG2 transições para seN-PApore com uma queda de pH, é reproduzível por várias execuções.

Antes e após a acidificação, os complexos de biosensor anexado são facilmente liberados para visualização pela mancha negativa EM e identificação pelo MS (Figura 5). Complexos representativos dos resultados EM são mostrados na Figura 6. Grades de amostra pré-CDDP, mostrar as densidades consistente com intactos complexos ternários composto seN-PAprepore-CMG2. Redes complexas pós-acidificação, mostrar PA uma transição para pore e solubilizado pela inclusão de micela com nenhuma densidade CMG2 óbvia.

As identidades do pré- e pós-acidificação complexos foram verificados pelo MS. Um banco de dados onde as sequências de PA, P13423; SeN, P15917; e CMG2, P58335 foram incluídos em um plano de fundo de um banco de dados de proteínas do mouse derivado do repositório NCBInr. Só as proteínas de interesse foram obtidas a partir desta primeira pesquisa de banco de dados, com a seguinte cobertura de aminoácidos para os complexos ternários e binários: 54% e 22% para PA, 36% e 6% para se e 43% para CMG2, respectivamente (CMG2 não foi detectada no complexo binário). A fim de maximizar a cobertura de aminoácido de proteína, uma segunda identificação de peptídeos/proteínas foi realizada usando um banco de dados de proteínas contendo apenas as três proteínas de interesse. Pré-CDDP MS amostras continham peptídeos de todos os componentes de toxina três com 60.46%, 67.97% e 54.15% de cobertura para seN, PA e CMG2, respectivamente (Figura 7). Resultados de post-CDDP, mostrados na Figura 8, continham apenas peptídeos de seN e PA (cobertura 57.41% e 67.79%, respectivamente). A falta de CMG2 nas amostras post-CDDP são consistentes com a diminuição de nm BLI observada durante a formação de poros.

Figura 1. Visão geral esquemática para análise de complexos de proteína montada sobre e isolado do biosensor BLI usando EM e MS. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Ativação de biosensor: primeiro passo no conjunto específico de orientação na biosensor BLI. O domínio N-terminal do E126C Factor letal, (seN) está ligado através de um enlace thio-criando a interface de ligaçãoprepore PA devidamente orientada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Monitoramento de antraz toxina montagem e desmontagem com BLI: O sensogram mostra mudanças de amplitude em função do tempo devido a adição específica do antraz toxina componentes como eles são adicionados para o biosensor começando com o carregamento seN (etapa 4 A tabela 1). PAprepore é então carregado para a superfície, seguida pela adição de solúvel do receptor de CMG2. O complexo pré-CDDP montado consiste de um se-PAprepore- CMG2. Para o progresso em direção o tarde endossomo ambiente, toda a montar antraz funcional toxina é submetida a um pulso de baixo pH (pH 5.0) que enfraquece o receptor da ligação, permitindo que o prepore fazer a transição para a sua conformação de poros de membrana estendida inserida. Exposição da membrana abrangendo poro é confirmada e solubilizada pela adição de micelas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Sensogram BLI de lançamento CMG2: vestígios da etapa de acidificação mostram um aumento inicial ou 'spike' amplitude seguido por um declínio de amplitude maior que provavelmente pore formação e dissociação do receptor, respectivamente. Verticais pontilhadas linhas vermelhas denotam o início de uma nova etapa. Sensograms estão alinhados no em negrito pontilhado linha vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Analisar os complexos da proteína montada sobre e isolado do biosensor BLI usando EM e MS: Biosensor anexados complexos são facilmente liberados no 5 µ l de tampão contendo TDT para identificação pelo MS. e visualização pela mancha negativa EM clique aqui para Ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Visualização dos complexos de proteínas com EM: pré-CDDP grades de amostra, mostrar as densidades consistente com intactos complexos ternários composto seN-PAprepore-CMG2. Post-CDDP redes complexas, mostrar PA uma transição para pore e solubilizado por micela com nenhuma densidade CMG2 óbvia. Modelos de complexos previstos (lado esquerdo) estão na mesma escala como partículas individuais mostradas. As partículas coloridas com proteína predita (baseada no tamanho de densidade EM) são mostradas abaixo de cada partícula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Verificação de complexos de proteínas com MS: MS Pre-CDDP amostras continham peptídeos de todos os componentes de toxina três com 60.46%, 67.97% e 54.15% de cobertura para seN, PA e CMG2, respectivamente. Peptídeos detectados em uma taxa falsa da descoberta (FDR) igual ou superior a 5% mostrados em amarelo, FDR igual ou superior a 1%, mostrado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8. Verificação de complexos de proteínas com MS: Post-CDDP peptídeos de amostras contidas seN e PA (cobertura 57.41% e 67.79%, respectivamente), mas não CMG2. FDR, igual ou superior a 5% mostrados em amarelo, FDR igual ou superior a 1%, mostrado em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Vezes de passo para single BLI executar a toxina antraz de montagem complexa. Observe que as linhas de base são usadas para lavar desvinculado de proteína da etapa anterior e/ou estabelecer uma nova base de reserva.

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