Artigo de método

Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

DOI:

10.3791/57904

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11 de agosto de 2018

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1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.

Resumo

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O uso da microscopia confocal como um método para avaliar padrões de localização de peptídeo dentro bactérias comumente é inibido nos limites de resolução de microscópios de luz convencionais. Como a resolução de um microscópio de determinado não pode ser facilmente reforçada, apresentamos os protocolos para transformar a pequena bacilares Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) em formas esféricas maiores, facilmente imagens chamado spheroplasts ou protoplastas. Esta transformação permite que os observadores rapidamente e claramente determinar se peptídeos apresentar-se na membrana bacteriana (ou seja, localização de membrana) ou atravessam a membrana para entrar na célula (ou seja, se). Com esta abordagem, também apresentamos um método sistemático de caracterização de peptídeos como membrana localizando ou se. Enquanto este método pode ser usado para uma variedade de peptídeos de membrana-ativo e cepas bacterianas, demonstramos a utilidade do presente protocolo, observando a interação de Buforin II P11A (BF2 P11A), um peptídeo antimicrobiano (AMP), com e. coli SPHEROPLASTS e b. megaterium protoplastas.

Introdução

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Peptídeos antimicrobianos (AMPs) ganharam atenção devido ao seu potencial uso como alternativas para os antibióticos convencionais1,2,3,4,5. Amplificadores de matam as bactérias, ou se através da membrana celular e interagindo com componentes intracelulares, como os ácidos nucleicos ou por permeabilizing da membrana, causando vazamento de célula conteúdo6. Além de sua utilização como antibióticos, se AMPs pode ser adaptado para aplicações de entrega de drogas porque interrupções podem atravessar a membrana impermeável7,8. Nós, portanto, procurar compreender mecanismos fundamentais de AMP de ação para estabelecer as bases para a sua utilização em design de drogas.

Microscopia confocal oferece uma forma de avaliar os padrões de localização de AMPs fluorescente etiquetadas em células bacterianas, fornecendo insights sobre seu mecanismo de ação9,10,11,12, 13 , 14. através da marcação da membrana da bactéria, um pode determinar se um peptídeo fluorescente etiquetado localiza a membrana ou espaço intracelular de uma célula bacteriana. No entanto, esta técnica é limitada pelo pequeno tamanho e haste forma de bactérias, que pode tornar a imagem desafiadora devido os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais e a variável orientação das bactérias no slide15.

O objetivo do método apresentado é permitir melhorar a visualização dos padrões fluorescente etiquetadas peptídeo localização utilizando microscopia confocal. Visualização é reforçada pelo pequeno, magro, em forma de haste Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) ligando e desligando o Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) bactérias em formas esféricas, alargadas referido como SPHEROPLASTS (por cepas de bactérias Gram-negativas) e protoplastas (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. SPHEROPLASTS e protoplastas são mais fáceis de imagem devido à sua forma simétrica, o que torna a orientação de uma bactéria em um slide, irrelevante para a sua imagem e seu tamanho aumentado. Além disso, apresentamos uma abordagem sistemática para analisar quantitativamente dados de microscopia confocal para caracterizar AMPs como qualquer membrana localizando ou se. Aplicar esses métodos torna mais fácil distinguir fluorescente etiquetado padrões de localização de peptídeo. Os protocolos aqui apresentados podem ser usados para avaliar a localização de uma variedade de agentes de membrana-ativo diferente de AMPs, incluindo peptídeos penetra no celular.

Uma vantagem desta técnica é que ele fornece insights sobre o mecanismo de ação dos amplificadores em um nível de célula única, que pode revelar a heterogeneidade de célula para célula15, ao contrário de outros ensaios de fluorescência comumente usado para identificar o mecanismos de ação dos amplificadores, que fornecem apenas em massa estimativas9,22,23,24,25. O uso de spheroplasts e protoplastas para avaliar a entrada de celular AMP é especial útil26 porque eles são fisiologicamente mais relevantes15 do que outros modelos utilizados para avaliar a entrada da pilha, tais como de vesículas lipídicas24.

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Protocolo

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1. preparação da solução

Nota: Prepare soluções descritas nos passos 1.1 – 1.9 e 1.8 – 1.11 para produzir spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas, respectivamente.

  1. Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 10,34 Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  2. Prepare a solução A 20 mM MgCl2, 0,7 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) e sacarose g 11,98 (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  3. Prepare a solução B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo-se 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g sacarose (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  4. Prepare-se pela dissolução de sacarose g 13,69 (342.3 g/mol) em 50 mL dH2O num 125 mL 0,8 M de sacarose. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  5. Preparar a desoxirribonuclease 5mg/mL eu (DNase eu) pela dissolução de 0,015 g DNase I em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.
  6. Preparar a 0,125 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8.0, dissolvendo dissódico de EDTA 0,698 g desidratar (372.2 g/mol) em 15ml dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  7. Prepare-se 600 cefalexina µ g/mL, dissolvendo 0,03 g de hidrato de Cefalexina (365.404 g/mol) em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em 4 ° C.
  8. Prepare lisozima de 5 mg/mL, dissolvendo lisozima 0,015 g em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.
  9. Prepare-se 3% w/v trypcase soja caldo (TSB) dissolvendo-se 30 g de TSB em 1 L de dH2O em um frasco de 2 L. Alíquota da solução em frascos contendo 25 mL ou 100 mL TSB para ser usado na preparação de Escherichia coli spheroplasts ou b. megaterium protoplastas, , respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. TSB estéril pode ser armazenado em temperatura ambiente ou em 4 ° C.
  10. Prepare a solução C (1 M de sacarose, maleato de 0,04 M, 0,04 M MgCl2, pH 6.5) dissolvendo-se sacarose g 34,23 (342.3 g/mol), ácido maleico de 0,46 g (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) em 100 mL de dH2O num balão de 250 mL. Ajuste o pH para 6,5. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.
  11. Prepare 200 mL de meio de protoplastos misturando 100 mL 3% w/v TSB e 100 mL solução C em um frasco de vidro de 1 L. Autoclave para esterilizar a solução e armazenar à temperatura ambiente.

2. preparação da cultura durante a noite

Nota: Execute seções 2-4 usando técnicas estéreis adequadas. Se desejado, uma estirpe bacteriana pode conter um plasmídeo para resistência a antibióticos reduzir o potencial de contaminação. Se usando uma tensão com a resistência aos antibióticos, adicione os antibióticos necessários em passos 2.1, 3.1, 3.2 e 4.1 – 4.4.

  1. Prepare uma cultura durante a noite, escolher uma única colônia de bactérias, usando a ponta da pipeta estéril e colocando-o em um tubo de cultura de 14 mL contendo 2-3 mL de 3% w/v TSB. Incube a 37 ° C, agitando para 16 – 21 h.

3. preparação de bactérias Gram-negativas Escherichia coli Spheroplasts

  1. Em um balão de 250 mL, diluir a 1: 100 cultura durante a noite em volume de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando-se por cerca de 2,5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,5-0,8 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
  2. Em um balão de 250 mL, diluir esta cultura 01:10 em 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando para 2,5 h na presença de cefalexina de 60 µ g/mL (347.4 g/mol) para produzir filamentos unicelulares de cerca 50 – 150 µm de comprimento , que são observáveis sob magnificação de X 1.000 usando um microscópio de luz (figura 1B).
  3. Recolher os filamentos por centrifugação a solução bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min. decantar e descartar o sobrenadante, reservando-se o pellet.
  4. Lave os filamentos, suavemente, adicionando 1 mL de 0,8 M de sacarose, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Incubar durante 1 min e em seguida, descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
  5. Adicionar 150 µ l de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l de lisozima de 5 mg/mL, 30 µ l de 5mg/mL DNase I e 120 µ l de 0,125 M EDTA em seus respectivos a fim da pelota e incubar a solução à temperatura ambiente por 10 min.
  6. Adicione 1 mL da solução A gradualmente mais 1 min a solução preparada no 3.5 usando uma micropipeta, enquanto suavemente agitando a solução à mão. Incube a solução para 4 min à temperatura ambiente.
  7. 7 mL de solução de 4 ° C B colocar dois tubos cônico de 15 mL. Adicione quantidades iguais de solução preparada no 3.6 a cada um destes dois tubos. Centrifugue a solução a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min.
  8. Usando uma pipeta sorológica, cuidadosamente remova todos, mas 1–2 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet pipetando delicadamente acima e para baixo usando uma micropipeta P1000. Verifique visualmente para ver a formação de spheroplasts, observando a amostra na ampliação de X 1.000 usando um microscópio de luz (Figura 1).
  9. Armazene os spheroplasts a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.

4. preparação de protoplastas de Gram-positivas b. megaterium

  1. Em um balão de 250 mL, diluir o 1:1,000 durante a noite de cultura em 100 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,9–1.0 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.
  2. Despeje a líquido cultura em dois tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.
  3. Usando uma pipeta sorológica, desprezar o sobrenadante de ambos os tubos cónicos. Cada Ressuspender em 2,5 mL de meio de protoplastos e combinar as ressuspensa soluções em um único tubo cónico. Adicionar a solução de ressuspensa combinada em um balão de 125 mL.
  4. Adicionar 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar durante 1 h a 37 ° C, agitando.
  5. Monitore o crescimento dos protoplastas sob a ampliação de x 1.000 usando um microscópio de luz, anotando quaisquer irregularidades, tais como bactérias que aparecem como varetas inchadas em vez de esferas (Figura 2). Usando uma pipeta sorológica, transferi a solução para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.
  6. Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em mídia de protoplastos de 5 mL. Loja protoplastas a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.

5. preparação da solução de peptídeo e tintura de membrana para a imagem latente

  1. Solução de peptídeo
    1. Em um tubo de microcentrífuga envolvido em papel alumínio, dissolva 2 mg de FITC rotulado P11A BF2 em 800 µ l dH2O. uso um peptídeo contendo pelo menos um resíduo de triptofano a fim de realizar medições de concentração de proteína.
    2. Espectrofotometria, medir a absorvância da solução de peptídeo em 280 nm em triplicado. Calcule a concentração de peptídeo usando o coeficiente de extinção molar para triptofano (5.700/Mcm).
    3. Dilua a concentração de peptídeo em dH2O a uma concentração final de 100 – 200 µM. armazene-o em um tubo de microcentrífuga a-20 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.
  2. Tintura de membrana
    1. Em um tubo de microcentrífuga, prepare um estoque de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) dissolvendo-se 5 mg de di-8-ANEPPS em 843.3 µ l de DMSO. Armazenar a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.
    2. Em um tubo de microcentrífuga, prepare-se 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS adicionando 3 µ l de 10mm di-8-ANEPPS de 997 µ l DMSO. Armazenar em um tubo de microcentrífuga a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.

6. visualização de Escherichia coli Spheroplasts e b. megaterium protoplastas usando microscopia Confocal

  1. Pipete 5 µ l de spheroplasts ou protoplastas numa lâmina de vidro revestido de poli-L-lisina. Adicionar 2 µ l de FITC rotulado AMP (100-200 µM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz.
  2. Adicionar 1 µ l da membrana tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz. Cobrir com uma lamela de vidro e lacre com o esmalte.
  3. Ligue o laser confocal de microscópio e argônio. Ajuste o laser de argônio de potência de saída de 20% e 20% de transmissão.
  4. Defina intervalos de comprimento de onda de emissão de 499-532 nm e 745 – 670 nm para o canal de emissão do peptídeo FITC-etiquetadas e canal de emissão de tintura di-8-ANEPPS-rotulado de membrana, respectivamente.
  5. Protoplastas de imagem ou spheroplasts (Figura 1 e Figura 2) com um objetivo X 63. Use o software de imagem para obter 8 bits, imagens de 512 x 512 composto z-pilha composta de 0,5 µm fatias da totalidade dos protoplastos ou do spheroplast.
    Nota: Levar consideração cuidadosa para reduzir a emissão de infiltração enquanto imagem spheroplasts e protoplastas. Consulte a discussão para mais detalhes.

7. Caracterização da localização da AMP

  1. Abra a imagem do composto z-pilha em software de imagem. Localize a centro mais fatia do spheroplast ou protoplastos e coloque uma região circular de interesse (ROI) (0,3 µm de diâmetro) sobre a membrana (ROI 1), um no centro do spheroplast ou protoplastos (ROI 2) e um longe do spheroplast ou protoplastos para medir a fluorescência de fundo (ROI 3) (Figura 5). Evite a inclusão de pixels saturados. A intensidade de fluorescência em cada ROI pode ser calculada pelo software de imagem.
    Nota: Em casos quando não localizar o peptídeo para a totalidade da membrana, desenhe 1 ROI em uma área da membrana onde o peptídeo é localizado.
  2. Use a seguinte equação para determinar a relação de intensidade de fluorescência do peptide intracelular a intensidade de fluorescência de peptídeo de membrana:
    figure-protocol-1
    Nota: A intensidade de fluorescência em ROI 3 é subtraída de intensidades de fluorescência no ROI 2 e 1 de ROI para dar conta da fluorescência do fundo.

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Resultados

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Ampliando as bactérias e tornando-os esféricos, podemos facilmente distinguir peptídeos localizar à membrana bacteriana ou translocar prontamente através da membrana bacteriana. Os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais torná-lo desafiador para distinguir se o peptídeo sinais surgem da membrana ou espaço intracelular de bactérias normais porque sinais localizados na membrana aparecerá para coincidir com o espaço intracelular (Figura 3A). E...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os protocolos aqui apresentados torná-lo viável para os investigadores mais rapidamente obter maiores tamanhos de amostra de imagens bacterianas porque as bactérias alargadas, esféricas são mais fáceis de localizar, orientar e da imagem. Melhorada a capacidade de coletar dados é valiosa em vários aspectos. Em primeiro lugar, permite uma análise quantitativa mais sistemática dos padrões de localização de peptídeo. Enquanto tendências qualitativas podem ser demonstradas de pequenos conjuntos de imagens, apenas um conjunto ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse são declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID-NIH) prêmio R15AI079685.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Trizma hidroclorito (Tris HCl)SigmaT3253
Trizma base (Tris OH)SigmaT1503
Cloreto de magnésioSigmaM8266
SacaroseSigmaS7903
LisozimaSigmaL6876
Desoxirribonuclease ISigmaD4527
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma106361Usado Sigma 106361 no desenvolvimento do protocolo original; 106361 descontinuado com ED2SS como substituto
Hidrato de cefalexinaSigmaC4895
AmpicilinaFisher ScientificBP1760
BBL Caldo de soja tripticaseFisher ScientificB11768
BF2 P11AFITC NeoScientific
D8779 descontinuado com 34869 como substituição
Ácido maleicoSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Filtro de Seringa com 0.2 μ m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Microscópio confocal de varredura a laserLeica MicrosystemsTCS SP5 IIpara aquisição de imagens
Leica Application Suite, Fluorescência AvançadaLeica MicrosystemsPara processamento de imagens
Di-8-ANEPPS Biotium 61012 DMSO Sigma 34869 Usado Sigma D8779 no desenvolvimento do protocolo original;

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571(2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

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