Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

Summary

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Abstract

micro-RNAs (miRNAs) são transcrições de single-stranded RNA que se ligam ao RNA mensageiro (mRNAs) e inibem a sua tradução ou promovem a sua degradação. Até à data, os miRNAs têm sido implicados em um grande número de processos biológicos e doença, que tem representado a necessidade para os métodos de detecção confiável de miRNA transcrições. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para Digoxigenina-rotulado (escavação) trancado ácido nucleico (LNA) baseada em investigação miRNA deteção, combinada com proteína immunostaining em seções de coração de rato. Primeiro, realizamos uma técnica hibridização em situ utilizando a sonda para identificar miRNA-182 expressão nas seções de coração de controle e os ratos de hipertrofia cardíaca. Em seguida, realizamos imunocoloração para proteína cardíaca de troponina T (miocardite), sobre as mesmas seções, co localizar miRNA-182 com as células de casos. Usando este protocolo, fomos capazes de detectar miRNA-182 através uma fosfatase alcalina baseado ensaio colorimetric e miocardite através de coloração fluorescente. Este protocolo pode ser usado para detectar a expressão de qualquer miRNA de interesse através das sondas LNA escavar-etiquetadas e expressão de proteínas relevantes em cortes de tecido de coração de rato.

Introduction

micro-RNAs (miRNAs) são curtas (18-25 nucleotides), RNAs single-stranded, não codificante que funcionam como reguladores negativos da expressão génica a nível pós-transcricional por inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) e/ou promover a degradação do mRNA ¹. os miRNAs são transcritas de intrões ou exões de codificação ou não-codificante genes e são clivadas no núcleo por DROSHA, que os miRNAs precursor (pre-miRNAs), que são estruturas de Hairpin loop curto de 70 nucleotídeos². Seguindo citoplasmática de exportação, pré-miRNAs são subsequentemente transformados por DICER em miRNAs maduros que abrangem 18-25 nucleot....

Protocol

As amostras de tecido do coração de rato para este estudo foram obtidas em conformidade com a legislação e as normas institucionais e foram aprovadas pelo Comitê de uso e Yale University institucional Cuidado Animal.

1. preparação da solução

1. Preparar O RNase livre ddH₂, tratando de 5 L de DDQ₂O com 5 mL de diethylpyrocarbonate de 0,1% (DEPC) durante a noite (O/N), à temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar o DEPC. Uso tratada com DEPC ddH₂O para a preparação de soluções a jusante como indicado.
   Cuidado: DEPC é um conhecido agente cancerígeno, lidar com na coifa.
2. P....

Results

hibridação de miRNA in situ foi otimizada em seções de coração de rato usando um scramble miRNA e U6-snRNA, que serviu como controles positivos e negativos, respectivamente. Coloração positiva é indicada em azul, enquanto a coloração negativa é indicada pela falta de desenvolvimento de cor (figura 1A-1B). Casos específico expressão de miRNA-182 foi avaliada em seções de coração de controle e PlGF superexpressão ratos. Os ratos carreg.......

Discussion

deteção de transcrição de miRNA pode ser conseguida através de técnicas diferentes que variam em sensibilidade, especificidade e poder quantitativa. Aqui, demonstramos o acoplamento de miRNA hibridação in situ com imunocoloração e descrever um protocolo que permite a avaliação simultânea dos níveis de expressão de moléculas miRNA e proteína, sobre as mesmas seções de coração. Nós primeiro mostrar como realizar a hibridação in situ de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas em seções de coração de parafi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dietilpirocarbonato	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20	American Bioanalytical	AB02038	surfactante não iônico
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Proteinase K, recombinante, PCR Grau	Sigma Aldrich	3115879001
ProK Paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Cloreto de Sódio	ThermoFisher	S271	NaCl
Cloreto de Magnésio Hexahidratado	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
Solução de Ácido Clorídrico, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Solução de ácido clorídrico, 12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-metilimidazol	Sigma Aldrich	336092
cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida	Sigma Aldrich	39391	EDC
Solução de peróxido de hidrogênio H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Citrato trissódico di-hidratado	Sigma Aldrich	S1804	Citrato de sódio
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda de detecção	QIagen	YD00615701	cloridrato de Levamisol marcado com 5'-DIG e 3'-DIG
	Sigma Aldrich	31742
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Comprimidos	Sigma	Aldrich 11697471001	NBT-BCIP
Cloreto de potássio	ThermoFisher	P217	KCl
solução DAPI (1mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Glass coverbreaker	ThermoFisher	12-545E	Lamínula de vidro
Lamínula de plástico	Grace Bio-Labs	HS40 22mmX40mmX0.25mm	RNA-ase lamínula de plástico livre
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de Fab	Sigma Aldrich		11093274910 DIG anticorpo
Caneta de barreira hidrofóbica	Vector Laboratories	H-4000	Papanicolau
anticorpo anti-cardíaco Troponina T	Abcam	ab92546	anticorpo cTnT
Anticorpo secundário de absorção cruzada IgG (H+L) anticorpo anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-11011	anticorpo anti-coelho-568
Meio de montagem de fluorescência Dako DAKO		S3023	meio de montagem Soro
ovelha	Sigma Aldrich	S3772
Soro de cabra	Sigma Aldrich	G9023
Formamida deionizada	americana Forno de	AB00600
	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer