Artigo de método

Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

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DOI:

10.3791/57921

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10 de junho de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.

Resumo

Células-tronco pluripotentes humanas ingênuo (N-hPSC) com funcionalidade aprimorada pode ter um impacto grande em medicina regenerativa. O objetivo do presente protocolo é eficientemente reverter células-tronco pluripotentes humanas linhagem-aprontadas, convencional (hPSC) mantidas em condições alimentador-livre ou dependente do alimentador para uma ingênuo como pluripotência com funcionalidade aprimorada. Este método de reversão química ingênuo emprega o fator de inibição clássica leucemia (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibição cocktail (LIF-2i), suplementado com apenas um inibidor de tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverte hPSC convencional para um estado estável pluripotentes adotando transcriptional, bioquímicos e epigenéticas características do humano pré-implantação epiblasto. Este método de LIF-3i requer manipulação de cultura celular mínima e é altamente reprodutível em um amplo repertório de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e linhas de células-tronco (hiPSC) isento de transgene humano pluripotentes induzidas. O método de LIF-3i não requer uma etapa re-escorvamento antes a diferenciação; N-hPSC podem ser diferenciados diretamente com altíssima eficiência e manter espectofotômetro e estabilidades de epigenomic (incluindo em loci imprinted). Para aumentar a universalidade do método, hPSC convencional primeiro são cultivadas no coquetel de LIF-3i suplementado com duas pequenas moléculas adicionais que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) sinalização (LIF-5i). Nesta etapa de adaptação LIF-5i breve significativamente aumenta a expansão clonal inicial do hPSC convencional e permite que eles sejam posteriormente ingênuo-revertido com LIF-3i sozinho em grandes quantidades, assim obviating a necessidade para colheita/subcloning raro N-hPSC colónias mais tarde. LIF-5i-estabilizado hPSCs são mantidos posteriormente no LIF-3i sozinhos sem a necessidade de moléculas anti-apoptotic. O mais importante, LIF-3i reversão marcadamente melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de hPSC convencional diminuindo sua expressão de gene linhagem-aprontadas e apagando a interlinha variabilidade de diferenciação dirigida comumente observada entre linhas hPSC independente. Caracterizações representativas de LIF-3i-revertido N-hPSC são estratégias fornecidas e experimentais para comparações funcionais do hPSC isogénicas na linhagem-aprontadas vs. ingênuo, como Estados são descritos.

Introdução

O sistema de cultura 2i (inibidor de MEK/ERK e GSK3β) foi originalmente desenvolvido para refinar a culturas de células-tronco embrionárias (mESC) heterogêneo baseado em soro mouse a um estado de solo uniforme de pluripotência parecido com o rato epiblasto pré-implantatório1. No entanto, 2i não oferece suporte a manutenção estável de pluripotentes humanas de linhas de células-tronco (hPSC)2. Os vários pequena molécula complexa, fator de crescimento-completada e abordagens transgênicas recentemente têm sido relatados para capturar presumidamente semelhante humano ingênuo como pluripotentes molecular afirma2. No entanto, muitos dos Estados "ingênua, como" criados com estes métodos também exibiram espectofotômetro instabilidade, epigenomic defeitos (por exemplo, global perda do imprinting genômico parental), ou com deficiências potenciais de diferenciação.

Em contraste, o coquetel de triplo inibição química da GSK3β, ERK e tankyrase sinalização e fator inibitório de leucemia (LIF-3i) foi suficiente para a reversão de ingênuo, como estável de um amplo repertório de hPSC convencional linhas3. LIF-3i-revertido ingênuo hPSC (N-hPSC) mantido cariótipos normais e aumentou suas expressões de genes específicos ingênuo humano pré-implantação epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC de reversão também conferido com uma matriz de características moleculares e bioquímicas únicas de pluripotência mESC-como ingênua que incluiu sinalização aumento de STAT3 fosforilada, diminuição da fosforilação de ERK, global 5-metilcitosina CpG hypomethylation, desmetilação de CpG todo o genoma em células-tronco embrionárias (ESC)-promotores de genes específicos e dominante uso de intensificador de OCT4 distal. Além disso, em comparação com outro ingénuo métodos de reversão que resultaram em aberrantly hypomethylated impresso loci genômicos, N-hPSC LIF-3i-revertido fosse desprovido de perda sistemática de padrões impressos de CpG ou perda de expressão de DNA metiltransferase (por exemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Uma cultura de LIF-3i directa de um vasto leque de convencionais células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC) cultivadas em alimentadores ou E8 alimentador-free condições alcançado reversão rápida e do volume para um estado de epiblasto ingênuo. No entanto, direto LIF-3i ingênuo reversão pode ser ineficiente em algumas linhas hPSC convencional instável devido as inerentes variabilities genômicas e linhagem-aprontadas decorrentes as origens de doador geneticamente diversas.

Assim, para ampliar a utilidade do método LIF-3i, uma otimização gradual foi desenvolvida e é apresentada neste documento, que permite reversão ingênuo universal com quase qualquer hESC convencional ou hiPSC transgene-free linha cultivadas em alimentadores. Este método de reversão ingênuo universalizada emprega uma etapa transitória cultura inicial no hPSC convencional que complementa o coquetel LIF-3i com dois adicionais pequenas moléculas (LIF-5i) que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) ( sinalização de purmorphamine). Uma passagem inicial do hPSC convencional no LIF-5i adapta-los para posterior reversão de LIF-3i estável em grandes quantidades. Adaptação de LIF-5i inicial aumenta significativamente a proliferação clonal inicial única célula do hPSC convencional cultivada em E8 ou alimentadores (antes da sua passagem estável, contínua subsequente no LIF-3i sozinho). Linhas hPSC convencional adaptadas primeiro para uma passagem no LIF-5i toleram granel subsequente clonal passagem de células ingênuo-revertido em condições de LIF-3i, que elimina a necessidade de escolher e subcloning de raras colônias estáveis, ou o uso rotineiro de anti-apoptotic moléculas ou inibidores de Rho-associada a proteína quinase (ROCK).

O método de LIF-3i tem sido empregado com sucesso estàvel expandir e manter um amplo repertório de > 30 linhas independentes, geneticamente diversa hPSC convencional para > passagens de 10 a 30 usando qualquer um dos métodos enzimáticos ou não enzimáticos dissociação, e sem evidência de indução de cromossômica ou anormalidades epigenomic, incluindo anormalidades em loci imprinted gene. Além disso, sequencial cultura LIF-5i/LIF-3i é o ingênuo única reversão método que até agora tem sido relatado que melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de linhas convencionais hPSC, diminuindo sua expressão de gene linhagem-preparado e melhorar drasticamente a sua potência de diferenciação multipotentes. O LIF-3i ingênuo reversão método supressão inerente interline variabilidade de diferenciação das linhas hPSC linhagem-aprontadas, convencional e terá uma grande utilidade de aplicação na medicina regenerativa e terapias celulares.

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Protocolo

Todos os animais procedimentos foram realizados em conformidade com as orientações de cuidados com animais e protocolos aprovados pela Johns Hopkins School de medicina Instituto do Comité de uso (IACUC) de animais.

1. preparação de fibroblastos embrionários de Mouse (MEF) para dependentes do alimentador convencional (hESC médio/MEF) ou ingênuo-revertida (LIF-3i médio/MEF) hPSC cultura

  1. Comprar ou preparar suprimentos de baixo-passagem internos dos alimentadores MEF da CF1 ou CF1 x embriões do rato E13.5 do híbrido DR4 seguindo protocolos publicados4.
    1. Cryopreserve culturas MEF baixa passagem (p1-p2) pre-(para armazenamento a longo prazo) ou pós-irradiação (por até 6 meses) e armazenamento em nitrogênio líquido conforme descreveram anteriormente4.
    2. A irradiação (5.000 rad) MEF expandida sob p5 usando um γ - ou X-ray-difusora a granel e preparar alíquotas de 1,5 x 106 células por frasco para armazenamento de curto prazo (menos de 6 meses) a-80 ° C em um freezer de ultra baixa temperatura.
    3. Placa entre 1,2 x 106 (recém irradiados não-criopreservadas) e 1,5 x 106 (irradiados criopreservadas) MEF por um 6-gelatinizada placa para a preparação de culturas do alimentador, conforme descrito abaixo.
  2. Prepare a gelatina-revestido estéril 6-poços placas de cultura de tecidos tratados pela adição de 1,5 mL de solução estéril de gelatina de 0,1% a cada poço em uma câmara de segurança biológica.
  3. Incubar as placas com revestimento em gelatina a 37 ° C, durante pelo menos 1 h ou durante a noite numa incubadora de CO2 de laboratório.
  4. No dia seguinte, descongele baixa passagem (e.g., P2 para P4) DMSO-criopreservado e irradiada (5.000 rad) MEF, de acordo com os passos indicados abaixo.
    Nota: Não irradiados MEF deve também ser descongelado, expandido e irradiado imediatamente antes do uso.
  5. Coloque uma alíquota MEF criopreservada em banho maria a 37 ° C. Após o descongelamento, esterilizar o tubo com etanol e imediatamente diluir o crioprotetor DMSO pelo menos 10 vezes, com média MEF (tabela 1) dentro de uma armário de biossegurança (por exemplo, transferência 1ml DMSO-MEF alíquota em 9 mL de meio de MEF em uma estéril 15 mL cônica).
  6. Centrifugar as células MEF diluídas em 200 x g durante 5 min em tubos cónicos estéril 15 mL.
  7. Em uma armário de biossegurança, aspirar e desprezar o sobrenadante sem célula e resuspenda o pellet celular em 1 a 2 mL de meio de MEF fresco.
  8. Delicadamente, descartar a solução de gelatina e adicione 2 mL do MEF re-suspendido no meio de MEF para cada poço de uma placa de 6 efeitos colaterais, como indicado acima. Células de contagem MEF e placa 1,2 x 106 (recém irradiados não-criopreservadas) ou 1,5 x 106 (irradiados criopreservadas) MEF por uma placa gelatinizada 6.
    Nota: Todas as placas de cultura de células que são transferidas da incubadora de CO2 para a biossegurança do armário podem ser limpadas cuidadosamente com papel de etanol-pulverizado, mas não devem ser diretamente pulverizadas sobre com solução de etanol 70% para evitar a disseminação de etanol em poços.
  9. Incube as placas MEF a 37 ° C durante a noite em uma incubadora de laboratório CO2 (5% de CO2, ambiente úmido) para permitir que a penhora, antes de utilizar.

2. estabilização das culturas hPSC convencional para posterior reversão ingênua com uma etapa de adaptação breve LIF-5i a granel

  1. Valide todas as linhas convencionais hPSC por possuir um cariótipo normal por G-borda, antes da reversão de início LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Reversão de LIF-3i das linhas de alta-passagem convencional hPSC (EG., P > 40-50) deve ser evitado, uma vez que estas culturas já podem abrigar aberrações genômicas que podem afetar negativamente estável, eficiente e granel LIF-3i reversão do preparado, convetional hPSC linhas.
  2. Manter e expandir culturas hPSC convencional com cariótipos normais validados em um sistema de cultura baseado no MEF (conforme descrito na seção 1), ou um sistema de cultura livre de alimentador (de acordo com preferência do investigador).
    Nota: Cocultures de hPSC/MEF ambos alimentador-dependente (por exemplo, hESC suplementado (tabela 1) com 4 a 10 ng/mL bFGF) ou alimentador-livre (EG., E8 mídia 6 5 ou mTSER (de acordo com as instruções do fabricante na métodos de placas revestidas vitronectina) são compatíveis com reversão de ingênuo em massa usando o sistema LIF-5i/LIF-3i/MEF (Figura 1). Métodos não-enzimáticos são preferidos para a passagem de convencional hPSC antes de prepará-los para reversão. LIF-5i e LIF-3i formulações de mídia não contém antibióticos ou agentes antifúngicos. Regras de operação padrão para a esterilidade do armário de biossegurança e manutenção deverão ser rigorosamente observados para evitar qualquer contaminação bacteriana ou fúngica.
  3. O MEF-com base em sistema de cultura, prepare alimentadores MEF na placa de 6 efeitos colaterais conforme descrito na seção 1 pelo menos um dia antes da passagem das culturas hPSC convencional LIF-5i-adaptado.
  4. Depois de culturas convencionais hPSC chegaram a confluência de ~ 50% (ou seja, 3-5 dias após o chapeamento inicial), substituir o meio de cultura padrão hESC com LIF-5i médio (2 mL por bem; A tabela 1).
    Nota: Execute estas etapas em uma armário de biossegurança.
  5. Cultura e manter hPSC/MEF convencional por até 2 dias no LIF-5i a incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Altere o meio de LIF-5i diariamente para adaptá-los para sua passagem subsequente e reversão estável no LIF-3i.
  6. Como alternativa, para as culturas convencionais alimentador-livre (por exemplo, em E8), cultura hPSC no LIF-5i apenas durante a noite antes de passagem na manhã seguinte.
    Nota: Culturas LIF-5i e LIF-3i podem tanto ser mantidas com atmosférico (21% O2) ou fisiológica (5% O2) oxigênio níveis a incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
  7. Antes da passagem, colocar as placas de cultura em um gabinete de segurança biológica, lavar LIF-5i-adaptado hPSC convencional uma vez com PBS e adicionar 1 mL do reagente de dissociação de célula para cada poço. Incubar durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 e triture levemente com uma pipeta em uma suspensão de célula única no armário a biossegurança.
    Nota: Não enzimáticos buffers de dissociação alternativamente podem ser utilizados para a preparação de células únicas para passagem.
  8. Recolher a suspensão de células em meio de hESC (pelo menos 2 vezes diluição) em um tubos cónicos estéril 15 mL e triture suavemente células pipetando para obter uma suspensão de célula única.
  9. Centrifugar a 300 x g por 5 min, aspirado/descartar o sobrenadante e ressuspender o celular em 1 a 2 mL do meio de LIF-5i no armário a biossegurança. Conte as células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  10. Lavar a placa MEF pre-chapeada duas vezes com PBS (2 mL por bem em placas de 6-poços) e distribuir 1 – 2 x 106 células (em média 2 mL LIF-5i) para 1 bem da placa MEF PBS-lavado.
  11. Ajustar e otimizar o chapeamento inicial densidades para cada linha de hPSC individual ser ingênuo-revertido, replating eficiências pode ser altamente variável. Coloca a placa numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
    Nota: O uso rotineiro de reagentes anti-apoptotic não é recomendado para a maioria das linhas hPSC com este método. O sistema de LIF-5i já significativamente melhora eficiências de re-chapeamento clonal em massa inicial do hPSC convencional linhas. No entanto, uma única utilização de inibidor ROCK (5 – 10 μM Y-27632) podem melhorar ainda mais a inicial LIF-5i clonal eficiência re-chapeamento de culturas convencionais hPSC na primeira passagem para algumas linhas instável hPSC linhagem-preparado com a propensão para espontânea diferenciação.
  12. Se a partir do alimentador-livre (por exemplo, E8), culturas diretamente transferir um bem do dissociada hPSC convencional adaptado no LIF-5i em um irradiados bem MEF-chapeado (ou seja, passagem de 1:1).
  13. No dia seguinte, agite suavemente a placa para levantar todas as células não-inscritos, Aspire o meio (lavagem PBS é opcional) e substitua por 2 mL do meio de LIF-5i. Execute esta etapa em uma armário diariamente por 3 – 5 dias ou até que as células são confluente de 60-70% (Figura 1) de biossegurança. Coloca a placa numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).

3. a longo prazo manutenção e expansão de N-hPSC LIF-3i médio

  1. Após a adaptação inicial LIF-5i, passagem estável subsequentes LIF-3i culturas a cada 3-4 dias em uma armário de biossegurança, ou quando as culturas se tornam confluente de 60-70% (Figura 1).
    Nota: LIF-3i culturas exigem manutenção rigorosa e permitindo N-hPSC culturas alcançar a densidade alta confluência/célula de cultura prolongada (ex., > 4 dias) diminui a eficiência de re-chapeamento clonal subsequente e promove espontânea diferenciação.
  2. Em uma armário de biossegurança, descarte o meio de cultura e lavar cada um bem das culturas de LIF-5i/LIF-3i, suavemente, adicionando 2 mL de PBS. Descartar o PBS e adicionar 1 mL de solução de desprendimento de células. Incube durante 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido).
  3. Recolher a suspensão de células, adicionar hESC médio (sem inibidores ou fatores de crescimento (tabela 1); pelo menos 2 vezes diluição) para recuperar todos os hPSC e triture suavemente células pipetando para obter uma suspensão de célula única. Transferi a suspensão para um tubo cônico estéril 15 mL.
  4. Centrifugar a 300 g por 5 min e aspirado/descartar o sobrenadante. Ressuspender o centrifugado no meio de LIF-3i. Conte as células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  5. Placa ~ 2 x 105 células por poço sobre o MEF irradiado na placa de 6 gelatinizado para passagem de rotina das culturas LIF-3i. Para as culturas de LIF-5i-adaptado iniciais, placa uma inicialmente maior densidade (4 x 105 células/poço) antes da primeira passagem em LIF-3i/MEF.
  6. Re-plate e distribuir hPSC LIF-5i-adaptado em fresco PBS-lavado irradiados MEF alimentador placas (preparado no dia anterior como acima) no meio de LIF-3i. Substitua o meio de LIF-3i diariamente.
  7. N-hPSC de passagem para menos em massa contínua de 4 – 7 passagens no LIF-3i médio antes do uso de N-hPSC em estudos funcionais ou criopreservação. Registrar o número de passagens de N-hPSC em qualquer convencional ou mídia LIF-3i.
    Nota: Reversão de LIF-3i alta-passagem (por exemplo, > p40) linhas hPSC linhagem-aprontadas, convencional não é recomendada. Deve ser feito um esforço para reverter linhas hPSC convencional para a passagem mais baixo possível que eles estão disponíveis. Além disso, o uso do hPSC LIF-3i-revertido que sofreram maior que 10 passagens LIF-3i não é recomendado para estudos funcionais, desde que tais culturas N-hPSC podem abrigar anormal dos clones devido à seleção de cultura celular clonal prolongada. Reversões de LIF-5i/LIF-3i frescos das linhas de baixo-passagem convencional hPSC devem ser conduzidas para estudos funcionais, se as existências de N-hPSC com < 10 passagens no LIF-3i não estão disponíveis.

4. criopreservação e descongelamento de LIF-3i-revertido N-hPSC

  1. Expanda o N-hPSC revertido para passagens de pelo menos 5-7 em LIF-3i, como indicado acima, antes da sua utilização em estudos funcionais ou criopreservação a longo prazo. Registre o número de passagens em condições convencionais e em condições de LIF-3i em cada frasco criopreservado.
    Nota: Excesso LIF-3i-revertido N-hPSC não utilizado em ensaios funcionais pode ser criopreservado em cada passagem, mas o congelamento das passagens de pós reversão menores (ex.., < p3) pode resultar em pobres, ou eficiência de recuperação pós-degelo altamente variáveis.
  2. Em uma armário de biossegurança, Aspire o meio de cultura, lavar as células em PBS (2 mL por bem), PBS, Aspire e dissociar hPSC colônias em células únicas usando solução de desprendimento de célula (1 mL por bem). Coloque a placa por 5 min a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Diluir a solução de desprendimento de célula com o meio de LIF-3i (2 dobras), recolher hPSC em uma estéril 15ml cónico, centrifugue células a 200 x g por 5 min e resuspenda o pellet de células num meio de LIF-3i (1 a 2 mL por bem-equivalente). Conte o número de células usando um hemocytometer ou um contador automático de células.
  3. N-hPSC de centrifugação a LIF-3i médio (200 x g por 5 min) e ressuspender as células em um gabinete de biossegurança na solução de congelação (tabela 2), com uma densidade de pelo menos 1 x 106 células/mL.
  4. Células de transferência para os tubos criogênicos de armazenamento a longo prazo e coloque em um recipiente de congelamento lento. Permitir que as amostras congelar durante a noite em um freezer-80 ° C.
  5. No dia seguinte, transferi o cryovials em um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
  6. Para descongelar, coloque o frasco congelado em um banho de água de 37 ° C ~ 2 min.. esterilize o frasco (ou seja, spray de etanol), transferir hPSC em uma estéril 15ml cónico e diluir lentamente o meio de 10 vezes hESC em células (tabela 1) suplementado com 5 μM de Rho-associada a proteína quinase (ROCK) inibidor da Y-27632 dentro de uma capa de segurança biológica estéril do armário.
  7. Centrifugar a 200 x g por 5 min. Em uma armário de biossegurança, descartar o sobrenadante sem célula e resuspenda o pellet de células em meio de LIF-3i (1-2 mL) suplementado com inibidor ROCK 5 μM Y-27632.
    Nota: A exclusão de Y-27632 irá resultar em eficiências de recuperação pós-descongelamento pobre (Figura 2).
  8. Transferi as células descongeladas resuspended no LIF-3i/ROCK inibidor para os poços de MEF-chapeado PBS-lavado. Cryopreserve LIF-3i culturas em uma densidade de 1 x 106 células por frasco. Descongele a cada um destes frascos de alimentadores em um poço de uma placa de 6 efeitos colaterais.
  9. No dia seguinte, começa a regular LIF-3i expansão médio sem inibidor de quinase de Rho.

5. alimentador remoção para a coleta de amostras de N-hPSC

  1. Para preparar as culturas de amostras de LIF-3i/MEF (ou hESC/MEF convencional) (ou seja, para a expressão do gene (por exemplo, RT-PCR quantitativo, microarrays) ou análises de proteínas (por exemplo, borrão ocidental), empobrecem LIF-3i culturas de alimentadores MEF usando Magnético ativado celular classificação (MACS) com anticorpo anti-TRA-1-81 revestido microbeads de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Como alternativa, utilize o seguinte método de pre-chapeamento simples para esgotar as culturas dos alimentadores, conforme descrito abaixo.
  3. Em uma capa de segurança biológica estéril do armário, desprezar o sobrenadante sem célula, lave a pelota com 2 mL de PBS estéril por bem. Desanexe aderentes LIF-3i/MEF as culturas usando solução de desprendimento de célula (1 mL/poço). Incube durante 5 min numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Recolha o hPSC em uma estéril 15ml cónico. Lavar 2 vezes em hESC médio, células de transferência para o estéril 15ml cónico e centrifugar 200 x g por 5 min.
  4. Em uma armário de biossegurança, Ressuspender cada poço de células LIF-3i/MEF dissociado em 2 mL do meio de LIF-3i e transferir diretamente para um novo poço de uma placa de 6 que foi recentemente revestida com 0.1% de gelatina.
  5. Incube as pilhas do hPSC LIF-3i/MEF para 1 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, ambiente úmido). Colete as células não-aderentes com uma pipeta em um novo tubo cónico. Delicadamente, adicione 2 mL do meio de hESC a cada poço e redemoinho para coletar as restantes células não-aderentes.
    Nota: A maioria do MEF irradiado irá anexar a placa gelatinizado em 1 h, deixando a maioria do hPSC em suspensão.
  6. Combinar e centrifugar as células a 300 x g durante 5 min. lavagem em PBS. Snap-congelar o centrifugado em nitrogênio líquido após a centrifugação, ou alternativamente, re-suspender pelotas em um lysing buffer que é compatível com a análise a jusante de proteínas ou ácidos nucleicos (Figura 2B).
  7. Realize caracterizações de LIF-3i hPSC linhas com um controle convencional aprontada isogénicas hPSC correspondente.
    Nota: Devido à variabilidade intrínseca entre e dentro de culturas aprontadas, controles relevantes são preparados em um Commit correspondente na cultura ou antes da reversão de ingênuo. Protocolos detalhados e materiais para jusante bioimaging imunofluorescência, flow cytometry mancha ocidental, expressão gênica (microarrays e ensaios de RT-PCR), estudos de metilação (borrão de ponto, CpG metilação microarray), potenciador de OCT4 proximal e distal ensaios de repórter de predominância e sinalização inibidor de ensaios são fornecidos em outro lugar3.

6. pós reversão ingênua: validação de integridade genômica e de retenção de impressões Parental de LIF-3i-revertido N-hPSC antes da sua utilização em ensaios funcionais

  1. Tela as culturas convencionais, aprontada hPSC partida pela posse de um cariótipo normal (por exemplo, com análise de coloração de Giemsa-banda usando métodos publicados 7) antes de iniciar a reversão LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Este é para eliminar as populações hPSC convencionais que podem abrigar alterações genômicas anormais que podem conduzir a vantagem artefactual seletiva de sobrevivência em condições de LIF-3i clonais.
  2. Para obter melhores resultados, recentemente reverter convencional hPSC culturas para um estado de ingenuidade com LIF-3i várias semanas antes de sua utilização em estudos funcionais ou dirigido a diferenciação.
    Nota: Rotina prolongada cultura 'manutenção' em condições de LIF-3i para mais de 10 passagens seguintes ingênuo de reversão não é recomendado. Expansão de rotina e manutenção das linhas hESC e hiPSC devem ser realizadas utilizando sistemas de cultura convencional (por exemplo, em E8, ou MEF/hESC médio com bFGF).
  3. Avaliar linhas de N-hPSC pós-revertidas para a retenção do normal karyotypes 5 – 7 passagens após reversão de LIF-3i (EG., com de análise coloração Giemsa-banda7, ou qualquer outro método de escolha).
  4. Avaliar todas as linhas de N-hPSC revertidas para retenção de impressões de genómicas parentais normais através de uma análise de metilação do DNA de escolha (por exemplo, protocolos para análise de microarray de DNA de CpG de impressões parentais nos LIF-3i-revertido N-hPSC são fornecidos em outro lugar3 ) após 5 – 10 passagens de reversão de LIF-3i.

7. post ingênuo reversão: Delineamento Experimental diretrizes para ensaios quantitativos diferenciação dirigido usando LIF-3i-revertido N-hPSC

  1. Utilize diretamente o LIF-3i N-hPSC em protocolos de diferenciação dirigida estabelecidos sem manipulações de cultura de células adicionais.
    Nota: Re-escorvamento (i.e., conversão de N-hPSC volta para condições aprontadas convencionais antes da sua utilização em ensaios de diferenciação dirigido) não é necessário com o método de LIF-3i e não é recomendado.
  2. Para controlar para os impactos do ensaio e interline variabilidade no teste funcional de linhas individuais hPSC, Cruz-validar as potências de diferenciação da linhagem-específicos empregando protocolos de diferenciação independente pelo menos três hPSC linhas derivado de origens genéticas independentes (ou seja, vários doadores-derivado hiPSC e hESC).
  3. Para comparações funcionais, configure irmão culturas, em número equivalente de passagem e da mesma linha hPSC (isogénicas) em paralelo com a linhagem-preparado convencional e culturas hPSC LIF-3i-revertida. Manter as culturas hPSC isogénicas de aprontado/ingênuo irmão em seus respectivos meios (por exemplo., E8 vs. LIF-3i) e simultaneamente diferenciar usando protocolos idênticos diferenciação e materiais, para eliminar qualquer viés experimental (Figura 4).
  4. Para isogénicas aprontado vs ingênuo hPSC comparações, ajustar e otimizar o chapeamento inicial densidades para cada ensaio de diferenciação individual.
    Nota: Protocolos detalhados para progenitoras neurais, endoderme definitivo e hemato-endotelial diferenciação dirigida de LIF-3i-revertido N-hPSC são fornecidos em outro lugar 3. LIF-3i-revertido N-hPSC têm mais robusta capacidade proliferativa e diferenciação nos ensaios de diferenciação dirigido do que hPSC convencional. N-hPSC, normalmente, requer uma concentração de chapeamento inicial menor do que o convencional hPSC, e ao contrário de seu hPSC aprontada convencional homólogos, não requer o uso de anti-apoptotic reagentes para melhorar sua sobrevivência clonal seguindo enzimática digestão em ensaios de diferenciação.

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Resultados

Este protocolo otimiza a reversão de ingênuo, como eficiente com LIF-3i em ambas as culturas do alimentador-dependente e independente de alimentador linhagem-aprontadas convencional hPSC (Figura 1). O protocolo detalhado, descritos, adaptação sequencial de contornos LIF-3i, a partir de qualquer condições hPSC dependente de alimentador ou alimentador-free convencionais (por exemplo, E8 médio).

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Discussão

O sistema de LIF-3i aplica-se uma versão modificada do clássico 2i murino ingênuo reversão cocktail1 a células estaminais pluripotentes humanas. A auto-renovação do hPSC (que não pode expandir em 2i sozinho) é estabilizada no LIF-2i, completando este cocktail com o inibidor de tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permite a granel e reversão eficiente do hPSC convencional para um estado de pluripotentes, lembrando o epiblasto pré-implantatório humano3

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Divulgações

Sob um acordo de licenciamento entre tecnologias da vida e da Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade para o licenciamento de células-tronco. Os termos desse acordo são gerenciados pelo JHU em conformidade com suas políticas de conflito de interesses. Isto não altera a adesão dos autores a políticas de jornal sobre a partilha de dados e materiais.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH/NEI (R01EY023962), NIH/FORMULADORES (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk prêmio Fórum de ciência e a Fundação de Moseley.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

Referências

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