Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.
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Artigo de método
Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco pluripotentes humanas ingênuo (N-hPSC) com funcionalidade aprimorada pode ter um impacto grande em medicina regenerativa. O objetivo do presente protocolo é eficientemente reverter células-tronco pluripotentes humanas linhagem-aprontadas, convencional (hPSC) mantidas em condições alimentador-livre ou dependente do alimentador para uma ingênuo como pluripotência com funcionalidade aprimorada. Este método de reversão química ingênuo emprega o fator de inibição clássica leucemia (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibição cocktail (LIF-2i), suplementado com apenas um inibidor de tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i reverte hPSC convencional para um estado estável pluripotentes adotando transcriptional, bioquímicos e epigenéticas características do humano pré-implantação epiblasto. Este método de LIF-3i requer manipulação de cultura celular mínima e é altamente reprodutível em um amplo repertório de células-tronco embrionárias humanas (hESC) e linhas de células-tronco (hiPSC) isento de transgene humano pluripotentes induzidas. O método de LIF-3i não requer uma etapa re-escorvamento antes a diferenciação; N-hPSC podem ser diferenciados diretamente com altíssima eficiência e manter espectofotômetro e estabilidades de epigenomic (incluindo em loci imprinted). Para aumentar a universalidade do método, hPSC convencional primeiro são cultivadas no coquetel de LIF-3i suplementado com duas pequenas moléculas adicionais que potenciam a proteína quinase A (forskolina) e sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) sinalização (LIF-5i). Nesta etapa de adaptação LIF-5i breve significativamente aumenta a expansão clonal inicial do hPSC convencional e permite que eles sejam posteriormente ingênuo-revertido com LIF-3i sozinho em grandes quantidades, assim obviating a necessidade para colheita/subcloning raro N-hPSC colónias mais tarde. LIF-5i-estabilizado hPSCs são mantidos posteriormente no LIF-3i sozinhos sem a necessidade de moléculas anti-apoptotic. O mais importante, LIF-3i reversão marcadamente melhora a pluripotência funcional de um amplo repertório de hPSC convencional diminuindo sua expressão de gene linhagem-aprontadas e apagando a interlinha variabilidade de diferenciação dirigida comumente observada entre linhas hPSC independente. Caracterizações representativas de LIF-3i-revertido N-hPSC são estratégias fornecidas e experimentais para comparações funcionais do hPSC isogénicas na linhagem-aprontadas vs. ingênuo, como Estados são descritos.
Introdução
O sistema de cultura 2i (inibidor de MEK/ERK e GSK3β) foi originalmente desenvolvido para refinar a culturas de células-tronco embrionárias (mESC) heterogêneo baseado em soro mouse a um estado de solo uniforme de pluripotência parecido com o rato epiblasto pré-implantatório1. No entanto, 2i não oferece suporte a manutenção estável de pluripotentes humanas de linhas de células-tronco (hPSC)2. Os vários pequena molécula complexa, fator de crescimento-completada e abordagens transgênicas recentemente têm sido relatados para capturar presumidamente semelhante humano ingênuo como pluripotentes molecular afirm....
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Protocolo
Todos os animais procedimentos foram realizados em conformidade com as orientações de cuidados com animais e protocolos aprovados pela Johns Hopkins School de medicina Instituto do Comité de uso (IACUC) de animais.
1. preparação de fibroblastos embrionários de Mouse (MEF) para dependentes do alimentador convencional (hESC médio/MEF) ou ingênuo-revertida (LIF-3i médio/MEF) hPSC cultura
-
Comprar ou preparar suprimentos de baixo-passagem internos dos alimentadores MEF da CF1 ou CF1 x embriões do rato E13.5 do híbrido DR4 seguindo protocolos publicados4.
- Cryopreserve culturas MEF baix....
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Resultados
Este protocolo otimiza a reversão de ingênuo, como eficiente com LIF-3i em ambas as culturas do alimentador-dependente e independente de alimentador linhagem-aprontadas convencional hPSC (Figura 1). O protocolo detalhado, descritos, adaptação sequencial de contornos LIF-3i, a partir de qualquer condições hPSC dependente de alimentador ou alimentador-free convencionais (por exemplo, E8 médio).
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Discussão
O sistema de LIF-3i aplica-se uma versão modificada do clássico 2i murino ingênuo reversão cocktail1 a células estaminais pluripotentes humanas. A auto-renovação do hPSC (que não pode expandir em 2i sozinho) é estabilizada no LIF-2i, completando este cocktail com o inibidor de tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permite a granel e reversão eficiente do hPSC convencional para um estado de pluripotentes, lembrando o epiblasto pré-implantatório humano3
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Divulgações
Sob um acordo de licenciamento entre tecnologias da vida e da Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade para o licenciamento de células-tronco. Os termos desse acordo são gerenciados pelo JHU em conformidade com suas políticas de conflito de interesses. Isto não altera a adesão dos autores a políticas de jornal sobre a partilha de dados e materiais.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH/NEI (R01EY023962), NIH/FORMULADORES (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk prêmio Fórum de ciência e a Fundação de Moseley.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 1 |
Referências
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
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Reimpressões e permissões
