Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O teste de diferença de potencial nasal tem sido usado por quase três décadas para auxiliar no diagnóstico de fibrose cística (CF). Provou ser útil em casos de atenuado, oligo - ou mono-sintomática formas de CF geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias. Em contextos clínicos e pré-clínicos, o teste tem sido utilizado como um biomarcador para quantificar respostas para estratégias terapêuticas específicas para adaptação cf. o teste de um rato é um desafio e pode acarretar uma mortalidade associada. Este paper descreve a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua. Ele enumera as medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. Ele também descreve o cuidado animal no final do teste, incluindo a administração de uma combinação de antídotos das drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com recuperação total dos animais. Dados representativos obtidos de um CF e um rato selvagem-tipo mostram que o teste discrimina entre CF e não-CF. No total, o protocolo descrito aqui permite medições correctas do estatuto funcional de trans-epitelial transportadores de cloreto e sódio em ratos de respirar espontaneamente, bem como vários testes no mesmo animal reduzindo relacionados ao teste mortalidade.
Introdução
Há quase três décadas, utilizaram-se medições elétricas de diferença (PD) potencial para avaliar o estado funcional de transportadores de íons transmembrana expressado na mucosa nasal, como representante das vias aéreas distais1. Como uma dinâmica multipasso teste2,3, nasal PD permite funcional dissecação de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) e atividade de sódio epitelial canal (ENaC), ambos localizados na membrana apical as células epiteliais e exercendo cargos críticos na superfície hidratação das vias aéreas. A principal aplicação clínica do teste PD nasal....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os estudos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais da UCL (2017/UCL/MD/015) e de acordo com as normas da Comunidade Europeia para uso de animais na pesquisa (CEE n º 86/609). Os investigadores estão qualificados para a experimentação animal, seguindo a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. pré-teste de avaliação e gestão
- Prepare o cateter nasal de duplo lúmen.
Nota: Um cateter nasal é feito como um tubo de duplo lúmen capilar, um lúmen sendo usado para a perfusão contínua d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A fim de ilustrar as anomalias de transporte do íon característico em CF, foram realizadas medidas de PD nasais seguindo o protocolo descrito acima em um rato F508del-CF e um controle do tipo selvagem do fundo genético FVB/129 da colônia de Bruxelas CFTRtm1Eur ratos30. Este modelo clinicamente relevante, abrigando um dos mais graves F508del-CFTR mutação23,24,25e.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo adequado para medição PD nasal sob perfusão contínua de soluções em espontaneamente ratos de respirar por um período de tempo necessário para testar a integridade dos transportadores de íons, principalmente CFTR e ENaC. Todas as etapas do protocolo foram cuidadosamente otimizadas para garantir a recuperação completa de animais e de boa qualidade e de dados podem ser reproduzidos. Em particulares, a críticos passos são avaliação de anestesia e de gestão e posição adequada.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores Agradecemos a Prof J. Lebacq edição criticamente o manuscrito. CFTRtm1Eur (homozigotos ratos F508del-CFTR (FVB/129) foram desenvolvidos por Erasmus MC, Rotterdam, Países Baixos, com o apoio da Comunidade Económica Europeia acção de Coordenação Europeia para a investigação no 6º PQ UE de fibrose cística LHHM-CT-2005-018932.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de polietileno Portex | Smiths Medical, Hythe, Kent, Inglaterra CT21 6JL | Portex 800/100/500; 2,0 mm de diâmetro, 3,0 mmOD | para preparar tubos capilares para sonda nasal |
| Creme de eletrodo | Parker, Fairfield, NJ, EUA | Creme Redux | para construir pontes de eletrodos |
| Eletrodos Ag/AgCl | Biomedical, Clinton Township, MI, EUA | JNS BNT131-1,0 | eletrodos de medição e referência |
| cloridrato de amilorida | Sigma, St Louis, MI, EUA | A7410 | para preparar soluções |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, EUA | F6886 | para preparar soluções de perfusão |
| Voltímetro Knick Portamess | Elektronisch Meβ gerä te, Berlim, Alemanha | Portavo 904 pH | para medir a diferença de potencial |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβ gerä te, Berlim, Alemanha | Software Paraly SW112 | para capturar dados de diferença potencial |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Bélgica | Dormicum 15mg/3ml | para servir como anestésico pré-medicação |
| fentanil | Janssen Cilag, Berchem, Bélgica | Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml | para servir como medicação anestésica |
| medetomidina | Orion Pharma, Espoo, Finlândia | Domitor 1 mg/ml | para servir como medicação anestésica |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Bélgica | Dehidrobenzperidol 2,5 mg/ml | para servir como medicamento anestésico |
| clonidina | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Alemanha | Catapressan 0.15 mg/ml, | para servir como medicamento anestésico |
| encaminhamento cateter IV | Becton Dickinson, Sandy, UT, EUA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | para construir pontes de eletrodos |
| fórceps | Ferramentas de ciência fina, Heidelberg, Alemanha | Dumont #5, Ferramentas de ciência fina | para colocar o cateter nasal |
| naloxona | Braun Medical, Bruxelas, Bélgica | Narcan, 0,4 mg/ml | para servir como antagonista anestésico |
| atipamezol | Zoetis, Bloomberg, Bélgica | Antisedan, 5 mg/ml | para servir como antídoto específico para medetomedina |
| Almofadas de aquecimento | Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | para evitar hipotermia durante e após o teste |
| Bomba peristáltica P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Suécia | 18111091 | para perfundir soluções na |
| cola de cianoacrilato | Loctite, Henkel, Dü sseldorf, Alemanha | super cola 3 | para unir dois tubos capilares para sonda nasal |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, EUA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconato | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconato | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, |
| USP BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA | BD 26G (0,45x10 mm) | injeção intraperitoneal |
Referências
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
