Artigo de método

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

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DOI:

10.3791/57944

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14 de julho de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Resumo

A retina é um tecido altamente metabolicamente ativo que requer uma fonte substancial de sangue. A circulação da retina suporta a retina interior, enquanto os vasos da coroide fornecem os fotorreceptores. Alterações na perfusão retiniana contribuam para inúmeros transtornos visão em risco, incluindo retinopatia diabética, glaucoma e retina ramo veia oclusões. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos no controle do fluxo de sangue através da retina e como estas são alteradas durante a doença ocular pode levar à identificação de novos alvos para o tratamento dessas condições. Arteríolas retina são os vasos de resistência principal da retina e, por conseguinte, um papel fundamental na regulação da retina hemodinâmica através de alterações no diâmetro luminal. Nos últimos anos, desenvolvemos métodos para isolar arteríolas da retina rato que são adequadas para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de fisiologia celular. Esta preparação já começou a produzir novos insights sobre como o fluxo sanguíneo é controlado na retina e nos permitiu identificar algumas das principais mudanças que ocorrem durante a doença ocular. Neste artigo, descrevemos os métodos para o isolamento de arteríolas da retina de ratos e incluem protocolos para a sua utilização em eletrofisiologia remendo-braçadeira, imagem latente de cálcio e estudos miografia de pressão. Estes vasos também são favoráveis para uso em PCR-, ocidental mancha e imuno-histoquímica-com base em estudos.

Introdução

Compreensão de como o fluxo sanguíneo é controlado na retina é uma meta importante, desde que o fluxo sanguíneo anormal tem sido implicado na patogênese de uma variedade de vista-ameaçando doenças da retina1,2,3, 4. A circulação da retina, que abastece o interior da retina neurônios e células gliais, tem um arranjo de artéria de final, com todo o sangue das artérias da retina e arteríolas passando através dos capilares para as vênulas da retina e, finalmente, veias5. Fluxo sanguíneo na retina é regulado pelo tom da artéria da retina e arteríolas, bem como a atividade contrátil dos pericitos localizados nas paredes dos vasos capilares da retina e vênulas pós-capilares6,7, 8. o controle do tônus vascular da retina é complexo e é modulado por uma série de entradas do sistema circulatório e tecido circundante da retina, incluindo os gáses de sangue, circulam moléculas e hormonas, e substâncias vasoativas libertado o retiniana vascular endotélio e macroglia9,10,11. As arteríolas da retina são os pequenos ramos arteriais da retina e são compostas de uma única camada de células de músculo liso vascular e um revestimento interno de dispostas longitudinalmente células endoteliais12,13, 14. estes vasos formam o site principal da resistência vascular dentro da circulação da retina e, portanto, desempenhar um papel importante no controle local do fluxo sanguíneo da retina. Arteríolas retina regulam o fluxo de sangue capilar na retina por dilatação ou constrição seu diâmetro luminal, mediado por alterações na contratilidade de músculo liso vascular10,15,16. Compreender os mecanismos moleculares através da qual retinal arteríolas regulam perfusão da retina, portanto, requer preparações onde as células arteriolar músculo liso podem ser acessadas e estudou em condições fisiológicas como possível tão perto.

Ex vivo preparações das embarcações de sangue retinais isoladas fornecem acesso para as células de músculo liso vascular, mantendo ainda sua funcionalidade e interconectividade com o endotélio subjacente. A maioria dos estudos até à data de utilização dos recipientes isolados têm-se centrado na grandes bovina ou suínos vasos arteriais (60-150 µm). Estas podem ser montadas no fio comercialmente disponível ou sistemas de myograph de pressão para permitir o interrogatório farmacológico de células de músculo liso vascular mecanismos contráteis17,18. Tais preparações contribuíram grandemente para o nosso conhecimento da fisiologia vascular da retina, em condições normais. Alguns estudos utilizaram arteríolas retina isoladas de animais de laboratório pequeno como o seu diâmetro menor (~ 8-45 µm) impede a sua utilização em sistemas convencionais miografia19,20,21,22. Uma vantagem importante, no entanto, da utilização de embarcações de animais de laboratório pequeno é a ampla disponibilidade de modelos de doenças geneticamente modificados, transgênicos e da retina. Animais de laboratório pequeno também estão mais receptivos para estudos de intervenção na vivo .

Aqui descrevemos simples protocolos para isolar e canulação arteríolas da retina de ratos para experimentos miografia de pressão. CA2 + imagem e Eletrofisiologia protocolos utilizando estes vasos também são detalhados. Estes podem fornecer mais insights sobre a regulação da contratilidade do músculo liso vascular e fluxo sanguíneo na retina.

Protocolo

Todos os experimentos descritos aqui foram realizados em conformidade com as orientações contidas dentro do Reino Unido animais (procedimentos científicos) Act de 1986 e foram aprovados pelo bem-estar dos animais da Universidade de Belfast e corpo de revisão ética da rainha.

1. isolamento de arteríolas retina

Nota: O seguinte protocolo é usado para isolar as arteríolas da retina. Este método é otimizado para as arteríolas retina do rato, mas pode ser usado com retinas de rato. O rendimento dos navios, no entanto, é inferior ao usar ratos.

  1. Compõem uma solução de baixo Ca2 + contendo Hanks (LCH), conforme mostrado na tabela 1.
    Nota: Esta solução pode ser armazenada por até 3 dias a 4 ° C (quando usando armazenados LCH, certifique-se de que ele se equilibra a temperatura e o pH está correto antes de usar).
  2. Montar o seguinte equipamento antes da coleta de tecido para garantir rápida microdissection de retinas: serrilhada, pinça, tesoura curva, lâmina de prato (prato de Petri do silicone revestido), único gume de dissecação, 2 conjuntos de 1 copo (sem corte) de fórceps pipeta Pasteur (fogo polido para uma ponta suave mas não estreita), 1 pipeta descartável de plástico (com ponta aparada para aumentar a abertura para ~ 5-7 mm), 1 vidro redondo fundo tubo de ensaio (5 mL) e titular. Decantar cerca de 50 mL de LCH para um copo de vidro e preparar um segundo copo para decantar os resíduos líquidos.
    Nota: Consulte a Tabela de materiais para as especificações e detalhes do fabricante.
  3. Eutanásia o rato usando CO2 , seguido por punção cardíaca para extrair sangue (evitar deslocamento cervical ou concussão, porque podem danificar os vasos sanguíneos no olho). Retrair as pálpebras com fórceps serrilhado e, em seguida, usar a tesoura curva para corte em torno dos músculos orbitais e através do nervo óptico. Delicadamente, extrai os olhos da órbita tendo o cuidado de cortar os restantes anexos com uma tesoura.
  4. Coloque os olhos imergidos em solução LCH sobre o prato de dissecação (olhos podem ser transportados no gelo em uma solução de LCH se necessário). Usar um conjunto de pinças contundente para ancorar o olho para o prato, segurando os ligamentos musculares orbital ou nervo óptico; Certifique-se de que o ponto de ancoragem é tão próximo quanto possível da esclera para estabilizar o olho.
  5. Usando a lâmina, corte através da córnea ao longo da ora serrata e remova a lente pressionando suavemente a esclera com fórceps.
  6. Corte o copo de olho na metade simetricamente através do disco óptico. Usando fechado fórceps suavemente 'escova' fora as retinas das duas metades da viseira, tendo o cuidado de remover quaisquer anexos restantes para o disco óptico. Repita o processo com o segundo olho e transferir as retinas dissecadas para o tubo de ensaio utilizando que a pipeta de plástico e uma pequena gota de médio LCH.
  7. Usando a pipeta plástica encher o tubo de ensaio com LCH para ~ 5ml e permitir que as retinas resolver ao fundo.
  8. Lave o tecido aproximadamente 3 vezes removendo ~ 4 mL da solução do tubo e adicionando LCH fresco com a pipeta de plástico. Se necessário, remova o tecido estranho como ligamentos suspensory, humor vítreo e pelos.
  9. Lave o interior do vidro pipeta Pasteur (ponta polida) com LCH para evitar que o tecido grude para a pipeta. Com a mesma pipeta, remova aproximadamente 4 mL de solução de tubo de ensaio. Em seguida, adicione cerca de 2 mL de fresco LCH.
  10. Separe delicadamente (triture) as retinas desenhando o tecido pela ponta do vidro Pipetar lentamente e expelir o conteúdo em tubo de ensaio. Note, não tente introduzir bolhas nesta fase.
  11. Repita a etapa 1.10 até as retinas são divididas para um tamanho de aproximadamente 2-3 mm2.
  12. Lave o interior da pipeta com cerca de 2 mL de LCH e expulsar esta em tubo de ensaio. Permitir que o conteúdo resolver a parte inferior mais 5-10 min.
  13. Repita o processo de trituração, conforme descrito em 1.10-1.12 com força um pouco mais até que os pedaços de tecido são aproximadamente 1 mm2 no tamanho. Mais uma vez, permitir que o tecido se contentar com 5-10 min.
  14. Repita os passos de 1.10-1.12 uma terceira vez com mais força até que os conteúdos são totalmente homogeneizados e permanecem sem pedaços da retina (a solução deve tornar-se leitoso na aparência).
    Nota: Esta técnica produzirá até 8 segmentos de arteriolare (relativamente livres da envolvente neuropile e com alguns ramos permanecem intactos) por isolamento medindo 8-45 µm de diâmetro e 200-2500 µm de comprimento.
  15. Transferir uma pequena quantidade da amostra isolada em uma câmara de gravação fisiológicos ou adicionar corantes fluorescentes para medição de Ca2 + concentração intracelular ([Ca2 +]i; ver secção 3). Descarte de restos de eye copos e solução removida durante o processo de isolamento, em conformidade com as regras locais no tratamento de resíduos animais.
    Nota: Enquanto é aconselhável experimentar em vasos imediatamente após o isolamento, isolado de excedentes pode ser armazenado a 4 ° C por até 8 h.

2. arteriolar pressão miografia

Nota: A pressão Arteriolar miografia é realizado da seguinte forma usando equipamento detalhado na figura 1A, B e a Tabela de materiais.

  1. Transferir uma alíquota do vaso retinal homogeneizado (1-2 mL; isolado de acordo com o ponto 1) para uma câmara de gravação fisiológicos (parcialmente preenchido com nominalmente solução de Ca2 +grátis Hanks; 0Ca2 + Hanks'; ver tabela 1) montado no palco de um microscópio invertido. Deixe os vasos para acertar na parte inferior da câmara de gravação pelo menos 5 min antes da experimentação.
  2. Visualmente de varredura ao longo da câmara de gravação para identificar arteríolas > 200 µm de comprimento e possuindo uma extremidade aberta através da qual a embarcação pode ser canulada (identificação do tipo de navio é mais explorada na seção de resultados). Posição do navio no centro do campo de visão. Se nenhum navios apropriados estão presentes, transferi outra aliquota do navio homogeneizado na câmara de gravação conforme passo 2.1.
  3. Ancorar uma extremidade do vaso usando pinça fina e um deslize de fio de tungstênio pequeno (75 µm de diâmetro e ~ 2-4 mm de comprimento) colocado sobre o navio (veja a Figura 1(i)). Para fazer isso Segure o fio na pinça e localize o fórceps acima da câmara de gravação.
    1. Identificar a sombra correspondente da pinça sob o microscópio, baixe o fórceps para o banho até o fio se torna aparente. Posicione o fio sobre o navio aproximadamente 200 µm de extremidade aberta e soltar o fio perpendicular ao eixo longo do navio.
      Nota: O peso do fio de tungstênio é suficiente para ocluir o vaso distal interromper o fluxo de conteúdo luminal durante a canulação e pressurização.
  4. Mover a arteríola em uma posição apropriada dentro da câmara de gravação tais que encontra-se horizontalmente através do banho com a extremidade aberta, em consonância com a cânula de pressurização (ver Figura 1(ii-iv)). Para fazer isso, empurrando suavemente o deslizamento de fio de tungstênio oclusão com uma seção adicional do fio realizada dentro da pinça; Não toque a arteríola como irá aderir irreversivelmente para a pinça.
  5. Sempre que necessário (para segmentos de arteríola longo), adicionar deslizamentos de fio de tungstênio adicionais sobre o navio tal que a distância entre as extremidades obscurecidas e abertas do navio é não mais do que 200 µm; Isto ajuda a prevenir a arteríola movendo-se fora do campo de visão em cima de pressurização. Se o navio tiver qualquer ramos laterais, estes também devem ser ocluídas com deslizamentos de fio de tungstênio adicionais. Se um ramo lateral não pode ser obstruído descarte o navio.
  6. Perfundir a câmara com 0Ca2 + Hanks a 37 ° C para remover o tecido da retina estranho e para aquecer o banho para temperaturas fisiológicas.
    Nota: Um sistema de aquecedor de perfusão e em linha de banho padrão de gravidade-alimentado pode ser usado para esta finalidade (ver figura 1A). 0Ca2 + Hanks' é usado para facilitar o procedimento de cateterização, desde a remoção da autoridade de certificação externa2 + garante que as arteríolas permanecem dilatadas.
  7. Fabricar cânulas de pressurização dos capilares de vidro de borosilicato filamentado (ponta diâmetro ~ 3-10 µm, dependendo do diâmetro do vaso a ser canulada; embarcações menores exigem mais estreitas cânulas; consulte a Tabela de materiais) usando um extrator de microeletrodos e volta-preenchimento com solução 0Ca2 + Hanks. Certifique-se que a haste da cânula é afilada suavemente em direcção à ponta para facilitar a cateterização.
  8. Montar a cânula em um suporte de pipeta anexado a uma seringa de 10 mL, através de um conector em Y e uma torneira de 3 vias; Isto é usado para pressurizar o sistema, sendo gravado usando um manómetro ligado para o outro lado-braço do Y-conector de pressão (ver figura 1B).
    Nota: Uma pipeta de 'auxiliar' é necessário para ajudar o processo de canulação. Fabricar a pipeta de um capilar de vidro borosilicato apontou um puxador de microeletrodos para um diâmetro de ponta de 0,5 - 2 µm. fortemente fogo polonês a pipeta (muitas vezes até fechado) usando um microforge.
  9. Cuidadosamente coloque a pipeta de auxiliar perpendicularmente ao eixo longo do navio perto de extremidade aberta usando um manipulador de 3 eixos mecânico (ver Figura 1). Posicione a pipeta auxiliar logo acima do navio, mas não tocar isso.
  10. Posicionar a pipeta de canulação na extremidade aberta do navio (veja a Figura 1 e 2A(i)) usando um micromanipulador bem; Posicione a ponta imediatamente adjacente à abertura, avaliada ajustando o plano de foco no microscópio (a 20 X). Quando ambos o fim do navio e a ponta da cânula está em foco ao mesmo tempo a cânula está corretamente posicionada para canulação (ver Figura 2A(ii)).
  11. Avançar a cânula de pressurização para a abertura do vaso usando os controles de eixo x do micromanipulador bem (ver Figura 2A(iii)). Avalie o sucesso da canulação movendo a cânula ao longo do eixo y. Se a cânula permanece dentro do navio é canulado com sucesso (veja a Figura 2A(iv)). Se a cânula se move fora do navio, a cânula é susceptível de ser acima do navio; caso afirmativo repeti passo 2.10-2.11 com a cânula em um plano inferior no eixo z.
  12. Mediante canulação bem-sucedida Desça cuidadosamente a pipeta de auxiliar a bordo do navio para reprimir a arteríola. Guia da parede arteriolar sobre a cânula de pressurização com a pipeta de auxiliar, ao mesmo tempo como a pipeta de canulação é avançada mais no lúmen da embarcação a uma distância de aproximadamente 30-50 µm (ver Figura 2A(v, vi)).
    Nota: Este procedimento requer movimento simultâneo, controlado de ambos manipulators (pipeta auxiliar se movendo em direção a cânula, enquanto a cânula se move para o lúmen da embarcação) e exigirá prática extensiva para alcançar uma elevada taxa de sucesso.
  13. Altere a solução do banho para Hanks normal contendo 2 mM Ca2 + (ver tabela 1) a 37 ° C. Normalmente, isso provoca um ligeiro estreitamento a arteríola e a formação de um selo apertado à volta da cânula de pressurização. A pipeta de auxiliar então pode ser movida longe do navio.
  14. Permitir que um selo apertado desenvolver durante 15 min. ver o vaso utilizando uma câmera USB (e software de aquisição de imagem) anexado ao microscópio e ajustar o foco para maximizar o contraste entre os limites do navio e os espaços externos e intraluminal (ver Figura 2B). Imagem do navio no 0,5 - 5 frames/s.
  15. Após 1 min de gravação no 0 mmHg, aumentar a pressão intraluminal até o nível desejado, fechando a torneira de 3 vias ligada à cânula de pressurização (ver figura 1B) e aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao sistema através da seringa. Observe a pressão alterar no manómetro.
    Nota: Pressão pode ser adicionado de forma sábia passo até 100 mmHg ou a um valor por exemplo 40 mmHg (aproximando-se da retina pressão arteriolar na vivo)23. O navio deve rapidamente dilatar confirmando sucesso canulação. Por favor note, vasoconstrição induzida por pressão (ou seja, a resposta miogênico) posteriormente irá desenvolver ao longo de um período de 15 min, mas por causa do pequeno tamanho desses navios, este não pode sempre ser visualmente detectável.
  16. Monitore cuidadosamente o navio durante a pressurização inicial para vazamentos óbvios. Fontes de vazamento podem se originar de ramos laterais entalhadas ou selagem inadequada da cânula no interior da arteríola.
    1. Relógio para conteúdo intraluminal, deixando o navio. Menores, menos óbvios vazamentos podem tornar-se aparente ao longo do tempo como uma queda na pressão no manómetro. Se possível, obstrua a abertura com deslizamentos de fio de tungstênio adicional tomando cuidado para não perturbar a cânula. Exclua preparações com escapamento óbvia de uma análise mais aprofundada.
  17. Aplicar a droga de interesse abluminally o vaso antes de, ou seguinte, pressurização de 15 min, dependendo dos objectivos do experimento (a primeira permite que efeitos sobre o desenvolvimento do tônus miogênico para ser determinado, enquanto o último permite a análise dos efeitos em Tom miogênico de estado estacionário). Um sistema de entrega de drogas típico é retratado na Figura 3A.
    1. Posicione a tomada de entrega perpendicular à parte do navio de interesse (conforme ilustrado na Figura 1), a uma distância ~ 500 µm longe do navio de interesse, tendo o cuidado de garantir que a saída é otimamente angulado para totalmente superfuse a área (ver Figura 3B). Certifique-se de que alterações na perfusão não perturbe fisicamente o navio.
  18. Após a conclusão de um experimento, aplique uma solução de 0Ca2 + Hanks' contendo 10 µM wortmannin (inibidor de quinase de cadeia leve de miosina) para màxima dilate o vaso para determinar o diâmetro passivo.
    Nota: A força do selo canulação pode ser testada no final do experimento, elevando a pressão intraluminal de > 100 mmHg. A maioria dos navios permanecerá presa mesmo com essa alta pressão indicando um selo apertado.
  19. Realizar análise off-line usando detecção de bordas para controlar as alterações no diâmetro arteriolar (ver Tabela de materiais para o software sugerido). Normalize o diâmetro da arteríola ao diâmetro do passivo para comparação entre os vasos.

3. Ca2 + imagens

Nota: Arteríolas retina isoladas estão preparadas para convencional (microfluorimetry) e confocal Ca2 + imagem como segue (usando equipamento detalhado na Tabela de materiais).

  1. Prepare homogenates da retina em um tubo de ensaio de vidro de 5 mL, conforme descrito na seção 1. A 1 mL de retina homogenate adicionar Fura-02:00 (microfluormetric Ca2 + gravação) ou Fluo-04:00 (confocal Ca2 + imagem) para dar uma concentração final de 5 µM (proteger da luz); indicadores de tintura preferencialmente carreguem em células musculares lisas.
  2. Manter à temperatura ambiente no escuro por 2 h, passando rapidamente do lado do tubo a cada 15-20 min para re-suspender o tecido da retina. Depois disso, dilua o homogenate 1:4 com solução LCH para reduzir ainda mais tintura de carregamento.
    Nota: Os navios permanecem viáveis por até 6 h (quando armazenadas a 4 ° C e no escuro); no entanto é recomendável que as experiências são iniciadas logo que possível para reduzir o impacto da compartimentalização do corante em organelas internas ou extrusão do corante ao longo do tempo.
  3. Transferi 1-2 mL de retina homogeneizado para uma câmara de gravação com fundo de vidro (parcialmente preenchida com LCH) montada no palco de um microscópio invertido, conectado a um sistema de microscopia confocal ou Ca2 + microfluorimetry.
    1. Ancorar arteríolas perpendiculares à direção do fluxo através da câmara de gravação, com deslizamentos de fio de tungstênio (50 µm de diâmetro, 2-4 mm de comprimento) espaçada ~ 100-200 µm separados ao longo do comprimento do navio (ver Figura 3) usando uma técnica semelhante ao descrito na etapa 2.3.
  4. Perfundir o banho com solução normal Ca2 + Hanks a 37 ° C. Posição tomada de entrega de drogas, como retratado na Figura 3 e aplicar drogas aos navios, conforme descrito na etapa 2.17.
  5. Para convencional Ca2 + tratamento de imagens, iluminar o navio com luz de 340/380 nm através de um objectivo de imersão UV de óleo (por exemplo, 100 X, at 1.3) e recolher a fluorescência emitida em 510 nm, através de um fóton contando tubo fotomultiplicador (PMT).
  6. No final de cada experimento, medir a fluorescência de fundo por extinguendo o vaso com uma solução contendo MnCl (ver tabela 1). Usar rácios de fluorescência fundo-corrigido (R-F340/F380) para análise ou converter para intracelular Ca2 + ([Ca2 +]i) usando Rmin emáx medições de R (ver tabela 1; aplicado antes da têmpera 24) e a equação de Grynkiewicz25.
  7. Para confocal Ca2 + tratamento de imagens, excitar os navios carregados de Fluo-4 em 488 nm e capturar as emissões de fluorescência resultante em 490-535 nm em qualquer linha de digitalizar modo (xt) ou modos de varredura xyt (512 x 512 pixels; sugerido pinhole 300 nm). Normalizar as medições para a fluorescência gravado no tempo t = 0s (F/F0). Avalie as alterações em [Ca2 +]i durante aplicações de drogas ou pressurização off-line em determinadas regiões de interesse (ROIs) usando software de análise de imagem.
  8. Se necessário, execute Ca2 + imagem com pressão miografia.
    Nota: As descrições acima foram otimizadas para navios não pressurizados; no entanto, é possível combinar Ca2 + imagem com pressão miografia como segue.
    1. Isole as arteríolas conforme seção 1. Carregar com Ca2 + indicador corantes como por passo 3.1-3.2. As arteríolas de transferência para a câmara de gravação e Canule acordo com o ponto 2. Tome cuidado para limitar a exposição à luz durante o procedimento de montagem.
    2. Medir Ca2 + conforme passo 3.5 ou 3.7 acima. Pressurizar o navio e repita a medição de Ca2 +. Medição simultânea do diâmetro do vaso é dependente do modo de medição de Ca2 + e equipamentos utilizados.
      Nota: Para confocal Ca2 + medição pode ser necessário a imagem regiões separadas pré e pós-pressurização devido ao descoramento do corante durante longas exposições à luz.

4. Patch-Clamp eletrofisiologia

Nota: A gravação de células inteiras e single-channel é possível de células de músculo de liso arteriolar individuais ainda incorporadas dentro de suas arteríolas do pai da seguinte maneira (usando equipamento detalhado na Tabela de materiais).

  1. Isolar e ancorar arteríolas retina na câmara de gravação, como descrito nos passos 1, 2,3 e 3,3. Para a gravação da remendo-braçadeira, o fio de tungstênio deslizamentos são espaçados 200-800 µm separados ao longo do navio.
  2. Remover a lâmina basal em torno da arteríola e desacoplar eletricamente as células adjacentes de músculo liso e células endoteliais subjacentes antes da fixação do remendo. Para fazer isso, superfuse o navio com uma série sequencial de soluções de enzima (tabela 1) a 37 ° C durante o período necessário.
    Nota: A duração da exposição de enzima é otimizada para as arteríolas retina do rato (protease, ~ 8 min; colagenase, ~ 12 min) e depende da taxa de fluxo do sistema de entrega de droga (~ 1 mL/min na nossa configuração) e as atividades da unidade do lote de enzimas sendo usado.
  3. Avaliar o nível de digestão na separação visual de endotelial e camadas de músculo liso durante a colagenase passo como mostrado na Figura 4. Uma vez que a separação entre as camadas de células é observada (como mostrado na Figura 4B), aplicar DNAse eu solução (~ 4 min) então encerrar a digestão por substituição da solução de banho com solução normal Ca2 + Hanks.
  4. Remova quaisquer fios restantes da lâmina basal e/ou periférica neuropile varrendo cuidadosamente as pontas fechadas de pinça fina ao longo da superfície do navio.
  5. Puxe e polonês capilares de vidro (Tabela de materiais), encha-a com solução de pipeta (tabela 1) e coloque firmemente no suporte do headstage remendo-braçadeira pipeta. Posição da pipeta em um ângulo de 45° em relação à câmara de gravação e avançá-lo para o navio usando a configuração de grosseira em um micromanipulador motorizado.
  6. Selecione uma célula de músculo liso, saliente da parede do vaso e cuja a superfície é livre de sujidade visível (veja Figura 4B). Posicione a ponta da pipeta remendo verticalmente sobre a célula de interesse e diminuir gradualmente, usando o movimento fino/lento do micromanipulador para fazer contato com a membrana do músculo liso.
    1. Avaliar o contato entre a célula e pipeta visualmente do movimento da célula e uma mudança na resistência pipeta medida usando o protocolo do teste de membrana (selo) do software de aquisição (passo negativo de 5-10 mV de 0 mV, frequência de 25 KHz; ver Figura 5A(i)) .
  7. Quando aumentou a resistência do selo 5-fold (por exemplo, passando de 2 para 10 MΩ; Figura 5A (ii)) Aplique pressão negativa transitoriamente na parte de trás do titular da pipeta através de um conector em y, torneira de 3 vias, seringa e tubos ligados ao titular da pipeta (montado em uma maneira similar ao usado na pressurização de arteríolas, ver figura 1B).
  8. Repita aplicações de pressão negativa até um gigaseal (> 1 resistência GΩ; conforme indicado pelo teste do software de aquisição de membrana) é formado (Figura 5A(iii)). Note que este processo pode demorar de 1 a 5 min. Se um gigaseal não forma, escolha uma célula diferente a braçadeira do remendo usando uma pipeta de remendo fresco.
  9. Aplica uma exploração potencial à célula através do software de aquisição conforme o experimento sendo executado (normalmente 0, -40 ou -80 mV).
  10. Estudar a atividade de canal único (na célula) na configuração do presente. Alternativamente, gere patches de dentro para fora rapidamente, retraindo a pipeta de remendo de superfície celular após a formação de gigaseal.
    1. Como as extremidades livres da membrana podem re-anneal nestas condições retire a pipeta do banho através de rápido movimento vertical do manipulator (Ajuste grosseiro). Rapidamente retorne através do menisco para remover a membrana reformada, deixando apenas o patch para dentro a ponta da pipeta.
  11. Definir a frequência de amostragem sobre o software de aquisição a 5kHz e activar o modo de gravação contínua, a atividade de registro de canal. Aplica quaisquer alterações de tensões, se necessário através do software ou do amplificador.
  12. Se necessário, aplica drogas para patch de navio/membrana conforme descrito na etapa 2.17.
  13. Se o estiramento da membrana é necessário, aplique pressão negativa para a parte posterior da pipeta usando a seringa anexada a um manómetro através de uma torneira de 3 vias e derivação.
  14. Analise as gravações de único canal para probabilidade aberta e condutância unitária, em conformidade com os procedimentos padrão26.
  15. Para toda célula atual gravação pull e polonês pipetas conforme a Tabela de materiais, encher com solução de pipeta contendo anfotericina B (adicionar 3 mg de anfotericina B para 50 µ l de DMSO; adicionar 3-6 µ l isto a 1 mL de solução de células inteiras pipeta; proceda à sonicação para misturar) e formar um selo como por etapas 4.6-4.9.
  16. Devido à inclusão de anfotericina B não há nenhuma necessidade de romper a membrana dentro a ponta da pipeta para acessar a célula inteira. Monitorar o acesso, que será adquirido aos poucos, usando o protocolo do teste de membrana do software de aquisição (etapa de mV-20-40 mV, frequência de amostra 25 KHz; ver Figura 5B).
  17. Instalação automatizada de capacitivas transientes em algum software produz medições em tempo real de acesso resistência e capacitância de célula (Alternativamente o declínio relativo dos transientes pode ser avaliado pelo olho). Uma vez que a resistência de acesso cai para < 15 MΩ, realize as compensações de resistência de série (Figura 5) usando os mostradores de parâmetro de células inteiras (resistência série e capacitância) do amplificador.
    1. Para fazer isso, use os valores de montagem automatizada para definir inicialmente os mostradores (consulte a Figura 5(ii)), em seguida, aumentar o mostrador de compensação de resistência série (previsão e correção se disponível do amplificador) re-ajustar as compensações de toda célula reduzindo a corrente capacitiva (consulte a Figura 5(iii)).
    2. Tomando cuidado para não mais de compensar (como mostrado na Figura 5(iv)). Normalmente, é possível compensar a resistência série com 75% em modo patch perfurada (requer compensação de atraso a ser definido no máximo).
  18. Se nenhum encaixe automático está disponível, Comece definindo os parâmetros de célula inteira disca para pF 15 e 15 mΩ (valores típicos para estas células) e ajuste para produzir as saídas como mostrado na Figura 5(ii). Aumentar o dial de compensação série resistência ~ 75% e reajustar os mostradores de células inteiras parâmetros conforme a Figura 5(iii).
  19. Antes de iniciar a experimentação Observe a medição de capacitância de célula a primeira adaptação automatizada ou de marcação após compensação manual.
    Nota: Esse valor é usado para normalizar as correntes ao tamanho da célula. Compensação por resistência série pode precisar ser ajustada durante a experimentação como acesso pode continuar a melhorar devido à incorporação de anfotericina B para o patch.
  20. Aplica drogas aos navios, conforme descrito na etapa 2.17. Aplica os protocolos de tensão (degraus ou rampas) como por exigências experimentais.
    Nota: Tensão típica passo os protocolos, 0,1 - 1 s de duração, são aplicadas na exploração potencial em 10-20 mV incrementa a cada 5-10 s para produzir uma família de correntes de tensão está ativado. Como alternativa, usar protocolos de rampa para medir correntes em uma série de tensões em uma 'varredura' por aumentar a tensão lentamente (100-200 mV/s) de , por exemplo, -80 a + 80 mV (aplicado a cada 5-10 s) com amostragem off-line da corrente em 10 intervalos de mV durante a rampa.
  21. É possível combinar imagens de Ca2 + com remendo-braçadeira gravação como segue. Isole as arteríolas conforme seção 1. Carregar com Ca2 + indicador corantes como por etapas 3.1-3.2. Montagem da câmara de gravação de acordo com o ponto 4. Tome cuidado para limitar a exposição à luz durante estes procedimentos.
    Nota: Até à data, não foi possível combinar remendo-braçadeira com estudos miografia de pressão devido à perda da membrana basal e integridade da embarcação durante o processo de dissociação enzimática

Resultados

A figura 6A mostra um desenho esquemático do árvore vascular da retina do rato. Os intervalos de diâmetro da (30-45 µm) de primeira ordem, segunda ordem (20-30 µm) e arteríolas pré-capilares (8-20 µm) foi confirmada experimentalmente em nosso laboratório por imagiologia confocal de rato retinal todo-montagem de preparações immunohistochemically rotulado para actina de músculo liso-α (Figura 6B). A dissociação da retina, arteríolas primárias, secundárias e pré-capilares podem ser identificadas com base no seu calibre e o arranjo das células de músculo liso vascular. As arteríolas de primeira e segunda ordem aparecem visualmente semelhantes sob microscopia de campo claro, mas podem ser distinguidas com base em seu tamanho (Figura 6). As arteríolas pré-capilares são os menores vasos arteriais na preparação e são facilmente reconhecíveis devido a sua disposição mais escassa de fibras de músculo liso vascular. As arteríolas isoladas podem ser claramente diferenciadas capilares e vênulas dentro do isolamento. Os capilares são aparentes como uma malha de vasos de pequeno calibre (4-10 µm de diâmetro), enquanto vênulas são finas paredes e falta de cobertura de celular do músculo liso (Figura 6). Primárias, secundárias e pré-capilares arteríolas são adequadas para pressão miografia, Ca2 + imagem e remendo-braçadeira estudos.

A Figura 7 mostra um experimento miografia de pressão, onde uma arteríola retinal primária rato tem sido canulada e a pressão intraluminal aumentada para 40 mmHg. A arteríola é então mantida esta pressão para permitir o desenvolvimento do tônus miogênico antes da adição de 0Ca2 + Hanks contendo 10 µM wortmannin para obter o diâmetro passivo do vaso. Figura 7A mostra fotomicrografias da arteríola em vários pontos de tempo durante o curso do experimento. Um recorde de tempo integral-curso mostrando as mudanças no diâmetro dos vasos ao longo do tempo têm sido plotados na Figura 7B usando personalizado feito-detecção de bordas software27. Imediatamente após a pressurização do recipiente dilata, que é seguida por uma constrição miogênico ativa que atinge um nível de estado estacionário após 15 min. adição de 0Ca2 + Hanks'/ wortmannin solução dilata o navio de volta a um nível semelhante ao observa-se imediatamente após a etapa de pressão inicial. Conforme descrito acima, drogas podem ser aplicadas aos navios antes ou pressurização seguir para investigar os mecanismos subjacentes a desenvolvimento e manutenção do tônus miogênico destes vasos. Usando essa abordagem, anteriormente mostramos que trecho ativado transitória do Receptor potencial Vanilloid 2 (TRPV2) canais e tipo L e T dependente de voltagem Ca2 + desempenham um papel central para facilitar o desenvolvimento de Tom miogênico em primeiro e segunda ordem rato arteríolas retina20,21,22. Também informamos que Ca grande-condutância2 + ativados canais de potássio (canais de BK)19,28 e Kvcontendo 1 dependente de voltagem K+ canais ato se opor miogênico atividade em estes vasos, desde que a adição de inibidores específicos para cada um destes canais provoca vasoconstrição (Figura 7).

A Figura 8 mostra exemplos de convencional e confocal Ca2 + imagem em arteríolas retina antes e exposição seguinte para o peptídeo vasoconstritor, endotelina-1 (Et-1). Em convencionais baseados em fura-2 gravações (Figura 8A), Et-1 (10 nM) provoca um aumento de bifásico em [Ca2 +]eu na camada de músculo de liso arteriolar retiniana, composto de um componente transiente inicial seguido por um menor sustentou componente. Nós anteriormente têm caracterizado os componentes transitórios e sustentados como sendo devido a Ca2 + lançamento do retículo endoplasmático e Ca2 + influxo do espaço extracelular, respectivamente de29. Baseado em fluo-4 confocal Ca2 + imagem fornece uma imagem mais detalhada dos efeitos de Et-1 a nível celular. Nesses experimentos, é evidente que o liso classificados mudanças no global [Ca2 +]eu observado em nosso resultado de estudos microfluorimetry de Et-1 estimulando a ativação de repetitivas assíncrono [Ca2 +]eu oscilações nas células da retina arteriolar liso músculo vizinhas ao longo da parede do vaso (Figura 8B, C; 30).

A Figura 9 mostra exemplos de gravações de braçadeira monocanal e células inteiras patch de células de músculo de liso arteriolar retiniana. Até à data, efetuamos ambos na célula e avesso canal único remendo braçadeira gravações22,28. Figura 9A, B por exemplo, mostrar uma braçadeira do remendo na célula de gravação antes de e o seguinte trecho de membrana (gerado pela aplicação de pressão negativa para a pipeta de remendo). Este patch específico contém dois canais que são ativados por estiramento mecânico. Demonstramos anteriormente que estas correntes podem ser inibidas utilizando TRPV2 canal bloqueio dos poros anticorpos22. A condutância unitária dos canais (249,71 picosegundo) também é consistente com estas correntes sendo mediadas por TRPV231.

Correntes de tensão-ativado de células inteiras podem ser evocadas usando protocolos de passo da tensão. A Figura 9 mostra uma família de tensão está ativado as correntes de tipo K+ gravado usando essa abordagem. Estas correntes se tornam evidentes quando outras correntes grandes presentes nestas células (por exemplo, BK e Ca+-ativado Cl– correntes) são bloqueados usando agentes farmacológicos específicos32,33. Correntes através de canais iónicos dependentes de voltagem de non - ou fracamente normalmente são examinadas usando protocolos de rampa de tensão. Nós usamos esses protocolos para identificar e caracterizar as correntes TRPV2 ativadas por hipotônica estiramento22 e canal agonistas (Figura 9) nas células da retina arteriolar liso músculo.

A Figura 10 mostra a dupla pressão miografia e confocal Ca2 + imagem aplicada em uma arteríola retinal primária de rato. Pressurização desencadeia aumento da frequência de [Ca2 +]i oscilações nas células individuais de músculo liso similares àqueles observados com Et-1. Mostramos anteriormente que estas oscilações são acionadas pelo somatório de Ca2 + faíscas (localizadas Ca2 + lançamento eventos) e contribuir para a geração de Tom miogênico20.

figure-results-1
Figura 1 . Instalação experimental para pressão miografia em arteríolas retina rato. A) equipamento Experimental incluindo microscópio invertido, em linha aquecedor para banho perfusato, 3 eixos mecânicos e micromanipuladores, manómetro, titular da cânula e mesa de ar. B) diagrama esquemático mostrando a disposição ideal dos cannulating pipeta e vaso de interesse na câmara de gravação. Este diagrama ilustra também a instalação básica do equipamento de pressurização. C) diagrama esquemático mostrado o processo de ancoragem e movendo a nave usando deslizamentos de fio de tungstênio adicional realizados em pinça fina. (i) gota 1st deslizamento para ocluir o vaso. (ii, iii) Use boletos adicionais para ajustar a oclusão deslizamento (sentido indicado pela seta) e que acompanham a embarcação para a orientação ideal mostrada em (iv). D) diagrama esquemático mostrando um posicionamento óptimo da oclusão deslizamento do fio de tungstênio, pipeta de auxiliar e cânula em relação a embarcação, conforme combinado antes da canulação. A saída do sistema de entrega de droga está posicionada a uma distância de ~ 500 µm do navio para reduzir artefatos de movimento durante a aplicação da droga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 . Processo de canulação para pressão miografia. A) fotomicrografias mostrando uma arteríola retinal escorada para baixo na câmara de gravação antes (i), durante (ii)-(v) e canulação seguinte (vi). Seta azul indica a direção do movimento da cânula enquanto a seta verde indica a direção do movimento da pipeta auxiliar. B) Fotomicrografia mostrando a região ideal para a gravação da atividade miogênico durante a pressurização, como destacado em vermelho. Observe, ajuste de luz e foco para aumentar o contraste das paredes dos vasos permite melhor acompanhamento das bordas de navios para análise automatizada. Barra de escala indica 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 . Entrega de drogas. A) equipamentos utilizados para a entrega de drogas mostrando reservatórios de solução, ligados a um colector multicanal controlado por torneiras de 3 vias e conectado a um manipulador de 3 eixos mecânico. B) diagrama mostrando a um posicionamento vertical da entrega drogas múltiplas em relação à câmara de gravação. C) fotomicrografia de um navio ancorado para baixo na câmara de gravação mostrando o posicionamento ideal da saída de entrega de drogas. Barra de escala representa 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4 . Digestão enzimática das arteríolas retina braçadeira do remendo para gravação. Micrografias de uma arteríola retinal antes (A) de luz e após digestão enzimática (B). Observe a separação física (indicada pelas setas) das células musculares lisas (SMCs) de células endoteliais subjacentes (ECs). Células de músculo liso apropriadas para remendo de aperto são indicadas com um asterisco. Barra de escala representa 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 . Único canal e a gravação de grampo celular patch. A) ilustração das correntes de teste observada durante o protocolo de 'teste do selo' quando: (i) pipeta remendo insere o meio banho externo, (ii) a ponta da pipeta entra em contato com a membrana de plasma da célula de músculo liso vascular e (iii) a sucção é aplicado na parte de trás da pipeta para permitir a formação de gigaseal. Após compensação de capacitância pipeta usando o amplificador de braçadeira do remendo, correntes de canal único agora podem ser gravadas na configuração na célula ou um remendo da membrana pode ser extirpado retirando rapidamente a pipeta para criar um patch 'inside-out'. B) alterações atuais associadas com o desenvolvimento do acesso elétrico para o interior da célula, durante a aplicação de células inteiras a anfotericina B perfurada remendo braçadeira técnica (i): (ii) como acessar partições de anfotericina B na membrana, resistência a quedas e transientes de capacitância eliciadas durante hiperpolarização passos de tensão (de -40 a -60 mV) se tornam maiores; (iii) uma vez que a resistência de acesso (Rum) caiu para < 15 MΩ, que normalmente leva 5-10 min após a formação de gigaseal, experimentação é possível. C) antes da gravação de células inteiras, acesso resistência e capacitância da célula devem ser compensado usando os mostradores relevantes do amplificador de braçadeira do remendo. Valores da capacidade de resistência e célula de acesso fornecido por funções automatizadas no software da remendo-braçadeira pode ser usada para ajudar a orientar este processo: (i) mostra a capacitância transitória antes da compensação retirada a região realçada em b; (ii) mostra a redução na capacitância transiente normalmente observado quando o acesso resistência e capacitância são compensados; (iii) compensação de resistência a série então deve ser corrigida para 75% e acesso a resistência e as compensações de capacitância aperfeiçoá-lo tal que a corrente resultante deve ser relativamente igual amplitude acima e abaixo do nível do platô da corrente durante o passo. (iv) deve ter cuidado para garantir que a resistência de acesso não é mais compensada (indicado pela presença de 'toque' do transitório), que pode ocorrer às vezes se acesso continua a melhorar no decorrer do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6 . Identificação das arteríolas retina isolado de rato. A) ilustração mostrando a disposição da árvore microvascular da retina de ratos. B) imagens Confocal de rato da retina arteríolas e vênulas dentro montagem plana preparações coradas para αSMA (vermelho; núcleos são manchados de azuis; escala barras representam 50 µm). C) luz micrografias de isolado 1 °, 2 ° e arteríolas pré-capilares, uma rede capilar e Vénula (escala barras representam 10 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7 . Miografia gravações pressão arteriolar. A) imagens de um mostrando arteríola retinal canulado (i) descansando de diâmetro (cerca de 35,6 µm), (ii) a dilatação com pressurização, (iii) desenvolvimento de vasoconstrição miogênico e (iv) dilatação devido a adição de 10 µM wortmannin em 0Ca2 + Solução de hanks. Escala barra representa 10 µm. B) trama do curso de tempo do diâmetro do vaso para o experimento completo apresentado na (amostrada em 2,5 quadros/s). C) diâmetro traçar de uma arteríola diferente sob estado estacionário miogênico Tom (µm de diâmetro 38,7) mostrando os efeitos da Kv1 canal inibidor correolide (10 µM) e o BK canal inibidor iberiotoxin (100 nM) (amostrados em 0,5 quadros/s). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-8
Figura 8 . Efeitos de Et-1 em [Ca2 +] eu sinalização de atividade em arteríolas da retina de ratos. A) convencionais baseados em fura-2 gravação mostrando os efeitos de Et-1 (10nM) na global [Ca2 +]eu. Basal [Ca2 +]eu era 82 nM na arteríola 1 °. B) xt confocal Fluo 4-com base em imagens, mostrando os efeitos de Et-1 em [Ca2 +]eu a nível celular. C) trama da intensidade de fluorescência normalizados (F/F0) medido em células como marcado na B. Esta figura foi modificada em Tumelty et al 30 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9 . Canal único e gravações de células inteiras remendo-braçadeira de células de músculo de liso arteriolar retiniana de rato. A, B) gravações de canal único em células da mesma membrana patch antes (A) e durante (B) a aplicação da pressão negativa (-45 mmHg) para o patch Pipetar. Dois canais estão presentes no patch (unitário atual 12.81 pA; condutância unitário 249.71 picosegundo) que apresentam um aumento substancial de ativação em condições de estiramento. Regiões selecionadas dos painéis superiores (i) são mostradas em um tempo mais rápido base nos painéis inferiores (ii). C) família das correntes do canal de tipo K+ (i) gravado em modo de célula inteira na presença de inibidores de BK e Ca2 +-ativado inibidores de canal de Cl– , suscitou em resposta a 20 incrementos de passo da tensão mV entre -80 mV para + 80 mV (ii). D) correntes de célula inteira (i) eliciadas rampas de tensão entre -80 mV e + 80 mV antes (linha preta) e durante a aplicação (linha vermelha) do TRPV2 canal agonista delta-9-tetrahidrocanabinol (THC-Δ9). O protocolo de rampa de tensão usado é mostrado no painel inferior (ii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10 . Ca2 + confocal imaging antes e após a pressurização de uma arteríola retinal rato. Não pressurizadasm representante xt confocal scans (i) de células de músculo de liso arteriolar retiniana (A) e (B) pressurizado condições obtidas em regiões separadas do mesmo navio. (ii) alterações na fluorescência normalizada (F/F0) gravado em células individuais-e, como indicado em (i), plotado contra o tempo. Asteriscos indicam individual subcellular Ca2 + faíscas que aumentam em frequência após a pressurização e sintetizar para provocar oscilações de Ca2 + celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Composto (mM)Baixa de Ca2 + Hanks0Ca2 + HanksHanks normalEnzima de isolamento ProteaseEnzima de isolamento colagenaseEnzima de isolamento DNAseSaciar a soluçãoRmin soluçãoRMAX soluçãoCelular ligado a solução extracelularCelular anexado a solução da pipetaCélula inteira solução extracelularSolução de células inteiras pipeta
Pureza de água (resistência)MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15MΩ.cm ≥ 15≥18 MΩ.cmMΩ.cm ≥ 15≥18 MΩ.cm
NaCl140140140140140140140140140140
kCl6666666666138
D-glicose555555555555
MgCl2 1.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31
HEPES10101010101010101010101010
CaCl2 0.120.10.10.1102220.2
EGTA40,5
MnCl10
Ionomycin0.01
KOH140130
Ácido D-glucónico130130
NaOH10
Penitrem A0,00010,00010,0001
4-aminopiridina10
Nimodipina0.010.01
Fluoxetine0.1
ácido 9-anthracenecarboxylic1
Anfotericina BΜg de 300-600 mL-1
Tipo de protease XIV~0.01% (0,4-0,6 mg/40 mL)
Colagenase tipo 1A0,1% (6) mg/60 mL
DNAse eu20 KU (20 μL de 1 MU/mL caldo em 20 mL)
pH7.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.2
titulada comNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHTrisTrisNaOHKOH

Tabela 1. Composição das soluções utilizadas em experimentação, incluindo exemplos de externa e pipetar soluções utilizados para canal único (TRPV2) e celular (tipo) correntes.

Discussão

Os protocolos descritos acima requerem prática, mas devem ser alcançáveis com mínimo de solução de problemas. Em um dia médio nós obter arteríolas utilizáveis de 6-8 do isolamento e alcançar experiências bem sucedidas de 3-4. Se forem encontrados problemas, no entanto, existem algumas etapas que podem ser tomadas para ajudar a melhorar as taxas de sucesso. Ocasionalmente encontramos, particularmente quando usando ratos mais jovens (< 8 semanas), que o rendimento das arteríolas pode ser baixo. Para contornar este problema, sugerimos que a centrifugação o tecido da retina (s 10-30 a 500 x g) entre cada um da trituração passos em passos 1.12-1.14. Isso geralmente ajuda a melhorar o rendimento dos navios, mas também aumentará a quantidade de detritos de célula dentro da preparação.

Quando a canulação de vasos para estudos miografia de pressão é importante verificar as arteríolas cuidadosamente para qualquer lado-filiais que podem ter sido clivadas próximo ao local de bifurcação. Isto representa uma causa comum de vazamento e perda de pressão durante a experimentação. O principal problema que pode surgir com os [Ca2 +]eu protocolos é o nível de carregamento de corante. Carregamento de tintura pobre leva a baixos índices de sinal-ruído, enquanto sobrecarga resulta na interrupção da normal Ca2 + homeostase. Para reduzir a probabilidade de qualquer destas questões, uma pequena alíquota do homogenate retinal pode ser removida, e vasos isolados verificada periodicamente durante o protocolo de carregamento. Quando a empresa remendo-braçadeira experimentos, a taxa de sucesso de formação gigaseal é altamente dependente de como bem a lâmina basal tem sido digerida. Quando inicialmente testando este protocolo ou usando novos lotes de enzimas pode ser necessário ajustar a concentração/duração da digestão enzimática. Monitorar cuidadosamente a separação das camadas endoteliais e musculares lisas garantirá a digestão suficiente para remover suficiente basal laminais para obter acesso. Cuidadoso monitoramento também é necessário evitar excesso de digestão, que pode se manifestar como o navio começa a constrição. Se isso ocorrer, as células de músculo liso são muitas vezes demasiado frágil para gravação de braçadeira do remendo. Quando a aplicação de enzimas, é importante incluir DNAse I para assegurar a remoção dos filamentos de DNA libertados de células danificadas durante o processo de isolamento. Fragmentos de DNA são pegajosos e causar o fórceps a aderir a arteríola durante os estágios finais do processo de limpeza (etapa 4.4), muitas vezes resultando em perda de navio. Limpeza dos vasos é tecnicamente difícil e é melhor executada em alta ampliação (20 X) com suaves movimentos arrebatadoras de pinça fechada do diâmetro da ponta possível melhor. Entre varreduras, limpe a pinça com rolo de laboratório.

Como destacado anteriormente, uma chave motivação por trás do desenvolvimento dos protocolos descritos neste manuscrito foi entender melhor por que o fluxo sanguíneo é interrompido durante doenças vasculares da retina. A maioria do nosso trabalho para data centrou-se na doença de olho diabético28,33. As arteríolas podem ser isoladas de retinas de modelos experimentais de roedores de diabetes usando os métodos descritos na secção 1. Quando experimentando em arteríolas retina isoladas de animais diabéticos, é importante tentar intimamente replicar as condições hiperglicêmicos experimentadas pelo vasos na vivo. Por esta razão, nós normalmente aumentaria os níveis de D-glicose em nosso isolamento e soluções experimentais de 25 mM. Espessamento das membranas vasculares do porão é um fenômeno bem reconhecido nos vasos da retina durante a diabetes34,35. Ao utilizar animais com diabetes prolongada (> 1 meses de duração doença), concentrações de enzima aumentada ou tempos de digestão são muitas vezes necessários para permitir a aplicação dos métodos de gravação de remendo-braçadeira.

Uma limitação importante do uso de ex vivo isolado da retina arteríolas para estudar fisiologia vascular da retina e fisiopatologia é a perda do neuropile circundante da retina. Embora a remoção das células neuronais e gliais da retina permite o acesso fácil às células da retina músculo liso vascular para estudos de fisiologia celular, a resposta dos vasos para os mediadores vasoativas pode mudar dramaticamente na ausência e presença de retina tecido. As ações de adenosina tri-fosfato (ATP), por exemplo, fornecem uma boa ilustração desse ponto. Em isolado rato arteríolas retina, adição de ATP disparadores uma robusta constrição dos vasos36, enquanto na presença de um neuropile intacta, os vasos dilatam37. Portanto, sempre que possível, geralmente tentamos validar as principais conclusões de nossos preparativos arteríola isolado usando ex vivo retinal todo-montagens e medições em vivo do navio diâmetro e sangue fluxo16,37 . Digno de nota, novos métodos surgiram recentemente para estudar pequenas arteríolas e capilares na retina porcina toda perfundidos ex vivo38,39. Tais preparações são susceptíveis de melhorar significativamente a nossa compreensão de como a retina neuropile regula Tom arteriolar e capilar da retina e como alterações na hemodinâmica da retina modulam a atividade neuronal na retina.

Embora os procedimentos descritos neste artigo concentram-se na utilização de arteríolas retina de rato isolado de fisiologia de célula compreensão arteriolar músculo liso, estamos atualmente desenvolvendo protocolos para habilitar também o estudo da função da célula endotelial em estes vasos. No trabalho preliminar, temos sido bem sucedidos em modificar a digestão enzimática dos segmentos arteriolar retiniano para produzir tubos de células endoteliais viáveis que são passíveis de Ca2 + imagens e patchclamp estudos de gravação. Canulação das arteríolas isoladas em ambas as extremidades, permitindo intraluminal entrega de drogas, no futuro poderia também habilitar endotélio-dependente respostas vasodilatadoras para ser investigado destes vasos.

Divulgações

Dr. Joanna Kur agora é funcionária da Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, EUA), o presente trabalho não conflite com isso aqui apresentados.

Agradecimentos

Desenvolvimento dos protocolos descritos neste trabalho foi apoiado por bolsas de agências de fomento seguintes: BBSRC (BB/I026359/1), luta para vista (1429 e 1822), a Fundação de pesquisa de Diabetes juvenil (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), Fundação britânica do coração (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) e MRC (MC_PC_15026).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CoposFisherbrand15409083Ou qualquer produto equivalente
Tesoura CurvadaFisher Scientific50-109-3542Ou qualquer produto equivalente
Pipeta/ transferência de plástico descartávelSarstedt86.11746mL é o melhor, mas outros tamanhos são aceitáveis; remova a ponta para ampliar a abertura
Microscópio de dissecaçãoBrunel Microscopes LTDOu qualquer produto equivalente
FórcepsWorld Precision InstrumentsDumont #5 14095Qualquer pinça fina equivalente
Pipeta PasteurFisherbrand11546963Fogo polido para reduzir o atrito, mas não o suficiente para estreitar a ponta
Placa de PetriSigma-AldrichP7741Ou qualquer produto equivalente de 10cm
Pipeta tetinaFisherbrand12426180Ou qualquer produto equivalente
Abastecimento de água purificadaSistemaPurificação de Água Integral Merek Milli-QOu qualquer sistema equivalente
Tubo de ensaio de fundo redondoFisherbrand14-958-10 B5 mL; qualquer produto equivalente
Pinça SerattedFisher Scientific17-467-230Ou qualquer produto equivalente
Lâminas de borda únicaAgar ScientificT585Ou qualquer produto equivalente
SylgardDow Corning184Ou qualquer superfície flexível 
Suporte para tubos de ensaioFisherbrand Derlin10257963Ou qualquer produto equivalente
Manipulador mecânico de 3 eixos por miografia
ScientificaLBM-7 x2 (ou qualquer produto equivalente)
Torneiras de 3 viasCole-ParmerUY-30600-02Ou qualquer produto equivalente
Mesa de arTechnical Manufacturing Corporation Bancada limpaOu qualquer produto equivalente
Software de análise Imagem Jhttps://downloads.imagej.net/fiji/Software de imagem gratuito
Plugin de análiseMyotraker https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002Plugin personalizado para imageJ Disponível gratuitamente para download
Pipeta de canulação de vidroMundo Percision instrumentosTW150F-4Ou qualquer produto equivalente
ComputadorDellOptiplex 7010Ou qualquer produto equivalente
Termômetro digitalRS206-3722Ou qualquer produto equivalente
Fluo-4-AMThermo Fisher ScientificF14201Faça 1 mM de estoque em DMSO
ForcepsWorld Precision InstrumentsDumont #7 14097Qualquer fórceps fino equivalente
Fura-2-AMThermo Fisher ScientificF1221Faça 1 mM de estoque em DMSO
Câmara de gravação com fundo de vidroWarner Instruments64-0759Ou qualquer produto equivalente
Copode pipeta auxiliarInstrumentosIB150F-3Ou todo
o calefator em linhaEquilavent comercial feito-à-medida SH-27B Solução In-Line calefator do instrumento de Harvard
Instrumentos SutterP97Ou qualquer produto equivalente
Microforge +  Microscópio Olympus CX 31GlassworksFine Point F-550Ou qualquer produto equivalente
MicromanipuladorInstrumentos SutterMP-285Ou qualquer produto equivalente
Manifold de entrega multicanal Lápis dePerfusãoAutomatizado Ou qualquer produto equivalente
Enchimento de pipetas BD Plastipak1mLSeringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta
Suporte de pipetaDispositivos Moleculares1-HL-UOu qualquer produto equivalente
Bomba de sucçãoInterpetAP1Bomba de aeração convertida por fole reversível
SeringaBD Plastipak20mL Luer-lokOu qualquer produto equivalente
Fio de tungstênioAdventoW55881875μ m de diâmetro
Tygon TubingVWRdiversos tamanhosOu qualquer produto equivalente
Câmera USB  A Logitech HD Pro Webcam C920Ou qualquer produto equivalente
Software de captura de vídeoHypercamversão 2.28.01Ou qualquer produto equivalente
Banho mariaGrantSub Aqua 12 PlusOu qualquer produto equivalente
lente x20Nikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17Ou qualquer produto equivalente
lente x4Nikon4x/0.10, WD 30, ∞/-Ou qualquer Conectores
Y de produtos equivalentesWorld Percision Instruments14012Ou qualquer produto equivalente
Patch clamping
torneiras de 3 viasCole-ParmerUY-30600-02Ou qualquer manipulador
mecânico de 3 eixosequivalentes ScientificaLBM-7 Ou qualquer produto equivalente
Mesa de arTechnical Manufacturing Corporation Bancada LimpaOu qualquer produto equivalente
Anfotericina BSigma-AldrichA24113 mg dissolvido diariamente em 50 μ L de DMSO (sonicado para dissolver)
AmplificadorMolecular DevicesAxopatch 200aOu qualquer produto equivalente
Conversor digital analógicoAxonDigidata 1440AOu qualquer produto equivalente
Colagenase Tipo 1ASigma-AldrichC9891 0,1 mg / mL em LCH
ComputadorDellOptiplex 7010Ou qualquer produto equivalente
Termômetro DigitalRS206-3722Ou qualquer produto equivalente
DNAse IMillipore260913Estoque de trabalho 1 MU mL-1 (10 MU diluído em 10 mL LCH) 
Gaiola de FaradayFeito-à-medidaAlgum produto comercial equivalente
Pinça finaDumontNo. 7Qualquer pinça superfina
Câmara de gravação com fundo de vidroWarner Instruments64-0759Ou qualquer produto equivalente
HeadstageMolecularDevices CV203BUOu qualquer produto equivalente
Aquecedor em linhaFeito sob medidaSolução equivalente comercial SH-27B Aquecedor em linha do aparelho Harvard
Microscópio invertidoNikonEclypse TE 300Ou qualquer produto equivalente
Extrator de microeletrodosInstrumentosSutter P97Ou qualquer produto equivalente
Microforge +  Microscópio Olympus CX 31GlassworksFine Point F-550Ou qualquer produto equivalente
MicromanipuladorInstrumentos SutterMP-285Ou qualquer produto equivalente
Manifold de entrega multicanal Automatize o LápisPerfusãoCientífica Ou qualquer produto equivalente
Software de PatchingMolecular DevicesPclamp v10.2Ou qualquer produto equivalente
Enchimento de pipetas BD Plastipak1mLSeringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta
Suporte de pipetaDispositivos Moleculares1-HL-UOu qualquer produto equivalente
Protease Tipo XIVSigma-AldrichP5147 0,01 mg / mL em LCH
Pipeta de vidro de canal únicoInstrumentos de precisão mundialIB150F-3Ou qualquer produto equivalente
Bomba de sucçãoInterpetAP1Bomba de aeração convertida por fole reverso
SeringaBD Plastipak20mL Luer-lokOu qualquer produto equivalente
Fio de tungstênioAdventoW55741850μ m de diâmetro
Tygon TubingVWRdiversos tamanhosQualquer produto equivalente para se ajustar à
câmera USB  A Logitech HD Pro Webcam C920Ou qualquer produto equivalente
Banho-mariaGrantSub Aqua 12 PlusOu qualquer produto equivalente
Vidro de pipeta de célula inteiraWarner InstrumentsGC150TF-7.5Ou qualquer produto equivalente
lente x20Nikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17Ou qualquer produto equivalente
lente x4Nikon4x/0.10, WD 30, ∞/-Ou qualquer produto equivalente
lente x40Nikon40x / 0.55, WD 2.1, Y / 1.2Ou qualquer produto equivalente
Y - conectores WorldPercision Instruments14012Ou qualquer produto equivalente
Ca2 + < / sup> imaging
3 vias torneirasCole-ParmerUY-30600-02Ou qualquer produto equivalente
3 eixos manipulador mecânicoScientificaLBM-7 Ou qualquer produto equivalente
Software de aquisição Cairn Pesquisa Ltda.Motor de Aquisição V1.1.5Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria
Air tableTechnical Manufacturing Corporation Bancada LimpaOu qualquer produto equivalente
Software de análise para imagem confocalImagem Jhttps://downloads.imagej.net/fiji/Software de imagem gratuito
ComputadorDellOptiplex 7010Ou qualquer produto equivalente
Microscópio confocalLeica GeosystemsSP5 Ou algum produto equivalente; confocal
Termômetro digitalRS206-3722Ou qualquer produto equivalente
Pinça finaDumontNo. 7Qualquer pinça superfina
Câmara de gravação com fundo de vidroWarner Instruments64-0759Ou qualquer produto equivalente
Aquecedor em linhafeito sob medidaAquecedor em linha do aparelho de Harvard
invertido microscópioNikonEclipse TE2000Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria
Monocromador Cairn Pesquisa Ltda.OptoscanOu qualquer produto equivalente; microfluorimetria
Manifold de entrega multicanal Lápis dePerfusãoAutomatizado Ou qualquer produto equivalente
Enchimento de pipetas BD Plastipak1mLSeringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta
Software para microscópio confocalLeica GeosystemsLAS-AF versão 3.3.Ou algum produto equivalente; confocal
Bomba de sucçãoInterpetAP1Bomba de aeração convertida por fole reverso
SeringaBD Plastipak20mL Luer-lokOu qualquer produto equivalente
Fio de tungstênioAdvent W55741850μ m diâmetro
Tygon TubingVWRdiversos tamanhosQualquer produto equivalente para caber
banho-mariaGrantSub Aqua 12 PlusOu qualquer produto equivalente
x100Nikonx100 N.A. 1.3 óleoOu qualquer produto equivalente; microfluorimetria
x20 lenteNikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria
lente x20Leica GeosystemsHCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/DOu qualquer produto equivalente; lente confocal
x4Nikon4x/0.10, WD 30, ∞/-Ou qualquer produto equivalente; lente de microfluorimetria
x63Leica GeosystemsHCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/EOu qualquer produto equivalente; conectores Y confocais
World Percision Instrumentos14012Ou qualquer produto equivalente
Pipetas<strong>Especificações e configurações para fabricação de pipetas para experimentação
Helper pipetaWorld Percision instrumentsIB150F-3Diâmetro interno: 0,86 mm
Rampa: 261
Pressão: 300
Calor: 280
Puxar : 0
Velocidade: 56
Tempo: 250
Nº de ciclos: 4
Diâmetro da ponta: 0,5-2 μ m
Polimento: sim
Resistência Final: >10 MΩ
Pipeta de canulaçãoInstrumentos World PercisionTW150F-4Diâmetro interno: 1,17 mm
Rampa: 290
Pressão: 300
Calor: 280
Tração: 0
Velocidade: 58
Tempo: 150
Nº de ciclos: 4
Diâmetro da ponta: 3-10 μ m
Polimento: no
Resistência Final: < 1 MΩ
Instrumentos de remendo na célulaWorld PercisionIB150F-3Diâmetro interno: 0,86 mm
Rampa: 261
Pressão: 300
Calor: 280
Tração: 0
Velocidade: 56
Tempo: 250
Nº de ciclos: 4
Diâmetro da ponta: 0,5-2 μ m
Polimento: sim
Resistência Final: >5 MΩ
Patch de célula inteiraWarner InstrumentsGC150TF-7.5Diâmetro interno: 1,17 mm
Rampa: 296
Pressão: 200
Calor: 287
Tração: 0
Velocidade: 50
Tempo: 250
Número de ciclos: 4
Diâmetro da ponta: 2-3 μ m
Polimento: útil mas não necessário
Resistência Final: 1-2 MΩ
de de pressão de Percision do mundo equivalente do produto Microscópio invertido Nikon Eclypse TE 300 Ou todo o produto equivalente Manômetro Riester LF1459 Ou todo o produto equivalente Extrator do microelectrodo Científica de produtos de Aquecedor comercial SH-27B Científica em lente

Referências

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