Method Article

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

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Aqui, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) usando um substrato de DNA modificado site-specifically λ e um ponto quântico rotulado de proteína.

Abstract

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A microscopia de fluorescência fez grandes contribuições em dissecando os mecanismos de complexos processos biológicos a nível da molécula. Em ensaios de molécula para o estudo das interações da proteína-ADN, existem dois fatores importantes para a consideração: o substrato de DNA, com comprimento suficiente para observação fácil e marcando uma proteína com uma sonda fluorescente apropriada. DNA de λ 48,5 kb é um bom candidato para o substrato de DNA. Pontos quânticos (Qdots), como uma classe de sondas fluorescentes, permitem a observação de longa data (minutos a horas) e aquisição de imagens de alta qualidade. Neste trabalho, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína no nível único-molécula, que inclui preparar um site-specifically modificado λ DNA e marcando uma proteína alvo com streptavidin-revestido Qdots. Para uma prova de conceito, podemos escolher ORC (complexo de reconhecimento de origem) em leveduras brotamento como uma proteína de interesse e visualizar sua interação com um ARS (sequência de replicação autônoma) usando TIRFM. Comparado com outras sondas fluorescentes, Qdots tem vantagens óbvias em estudos única molécula devido a sua alta estabilidade contra fotobranqueamento, mas note que esta propriedade limita sua aplicação em ensaios quantitativos.

Introduction

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Interações entre proteínas e DNA são essenciais para muitos processos biológicos complexos, tais como a replicação do DNA, reparo do DNA e transcrição. Apesar de abordagens convencionais têm lançar luz sobre as propriedades destes processos, muitos mecanismos chaves são ainda pouco claras. Recentemente, com as técnicas de molécula em rápido desenvolvimento, alguns dos mecanismos foram abordados1,2,3.

A aplicação da microscopia de fluorescência de único-molécula na visualização de interações proteína-ADN em tempo real principalmente depende do desen....

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Protocol

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1. preparação do substrato de DNA λ-ARS317

  1. Embalagem e construção de substrato DNA
    1. Digerir o DNA nativo λ usando Xhoeu enzima; amplificar um rolamento fragmento de DNA bp 543 ARS317 partir do DNA genômico de brotamento fermento usando cartilhas contendo 20 bp homóloga sequências de montante e a jusante da Xhoeu site de enzima no ADN do lambda. Adicionar 100 ng de Xhoeu digerido DNA λ e 10 ng de DNA do fragmento de 10 µ l do sistema de reação do recombination homologous e incubar a reação a 37 ° C por 30 min.
    2. Para o DNA de λ de recombinação do pacote, adicione 25 µ l dos extratos de embalagens lambda para o produt....

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Results

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Para visualizar a interação entre ORC Qdot-rotulados e o ARS, construímos primeiro o substrato de DNA λ-ARS317. Um fragmento de DNA contendo ARS317 foi integrado em Xhoeu site (33,5 kb) de DNA nativo λ por recombinação homóloga (figura 1A). O produto de recombinação foi empacotado usando extratos e as partículas do fago embalados foram cultivadas em placas LB (figura 1B). A placa positiva do fago foi projectada por PCR e.......

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Discussion

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Aqui, apresentamos um protocolo para observar a interação entre a Qdot-etiquetou a proteína e o DNA de λ site-specifically modificada usando o TIRFM em uma célula de fluxo. Os passos necessários incluem modificação site-specific do substrato DNA, DNA biotinylation, lamela limpeza e functionalization, preparação de fluxo-célula e único-molécula imagem. Existem dois pontos-chave que devem ser observados. Primeiro, todas as etapas envolvidas com DNA λ devem ser manipuladas com cuidado para diminuir qualquer possível dano, <.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos o Dr. Hasan Yardimci e Dr.Sevim Yardimci do Instituto Francis Crick de tipo ajudar nas experiências de único-molécula, Dr. Daniel Duzdevich do laboratório do Dr. Eric C. Greene, da Universidade de Columbia, Dr. Yujie Sun da Universidade de Pequim e Dr. Chunlai Chen de Universidade de Tsinghua para discussão útil. Este estudo foi suportado por Nacional Natural Science Foundation da China 31371264, 31401059, equipe de inovação interdisciplinar CAS e o Fellowship Newton avançado (NA140085) da Royal Society.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Loja Lambda DNANew England BiolabsN301125 μ L alíquotas a -20 ºC.
XhoI enzimaThermo Fisher ScientificFD0694
Kit de clonagem de fusão rápidaBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Embalagem Extratos		EpicentroMP5110A cepa bacteriana LE392MP
está incluída neste pacote.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Qualquer marca é aceitável.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical funcionaN / AQualquer marca é aceitável.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AQualquer marca é aceitável.
NZ-aminaAmrescoJ853-250G
Casamino ácidosSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Aparelho de agitação magnéticaIKAKMO2 básico
15 mL Eppendorf tubo Eppendorf3012215115 mL, estéril, a granel, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Primers biotiniladosThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Tampão de Reação (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Hidróxido de potássio (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetonaThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891ácido sulfúrico
H2O2< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% de peróxido de hidrogênio
MetanolSigma-Aldrich322415-2L
Ácido acéticoSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(metoxi-polietilenoglicol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotina-PEG
(biotina-polietilenoglicol)		LysanBiotina-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Dessecador a vácuoTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Seladora a vácuoMAGIC SEALWP300
Escriba de vidro com ponta de diamanteCIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA70036
Vela deslizante de vidroMarca7101
Tubulação de entradaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2diâmetro interno 0,38 mm; diâmetro externo 1,09 mm.
Tubulação de saídaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4diâmetro interno 0,76 mm; diâmetro externo 1,22 mm.
Fita dupla faceSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpóxiLEAFTOP9005epóxi de cinco minutos
EstreptavidinSigma-AldrichS4762
Microscópio de FluorescênciaOlympusIX71
Infusão/retirada
bomba programável		Aparelho Harvard70-4504
Laser de 532 nmCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD CameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
óptica de divisão		Hamamatsu fotônica K.K.de A12801-01
TIRF
Objetiva TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Quad-edge laser dicroico
divisor de feixe		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Filtro passa-banda quad-bandSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Divisor de feixe dicróicoSemrockFF649-Di01-25x36
Filtro de emissãoChroma Technology CorpET585/65m
Filtro de emissãoChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck, lâmina de teste de microscópio, lâmina de teste #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX LaranjaThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Estreptavidin ConjugadoThermo Fisher ScientificQ10163MPStore em 4 º C, não congele.
ATPAmresco0220-25GPrepare a solução de ATP 200 mM, usando ddH2O, ajuste o pH para 7,0 e armazene 10 μ L alíquotas a -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPrepare a solução de 1 M usando ddH2O, e armazene 10 μ l alíquotas em -20 ºC.
Sistema de iluminação Olympus IX2-RFAEVA2 60×

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

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Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

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