O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Summary

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

Abstract

Autofagia em massa caracteriza-se por sequestro de grandes porções do citoplasma nas estruturas de duplo/multi-membrane denominado autophagosomes. Aqui um protocolo simples para monitorar este processo é descrito. Além disso, o típicos resultados e validação experimental do método sob condições indutoras autofagia em vários tipos de células de mamíferos cultivadas são fornecidos. Durante autofagia em massa, autophagosomes sequestrar citosol e desse modo também proteínas citosólica solúveis, juntamente com outras cargas autophagic. LDH é estável e altamente solúvel, abundante enzima citosólica que não seletivamente é sequestrada em autophagosomes. A quantidade de sequestro de LDH, portanto, reflete a quantidade de sequestro de autophagic em massa. Para eficiência e precisão determinar o sequestro de LDH em células, nós empregamos um protocolo baseado em electrodisruption de fracionamento que efetivamente separa sedimentáveis LDH citosólica, seguido de medida da atividade enzimática em sedimentáveis fracções contra amostras de células inteiras. Sequestro de autophagic é determinado subtraindo-se a proporção de sedimentáveis LDH em células não tratadas do que em células tratadas. A vantagem do ensaio do sequestro de LDH é que dá uma medida quantitativa da autophagic embargo da carga endógena, ao contrário de outros métodos que também envolvem expressão ectópica de sondas de sequestro ou semi-quantitativa de protease análises de proteção de marcadores de autofagia ou receptores.

Introduction

Autofagia (do grego para "Self comendo") é um processo evolutivo e conservado pela degradação vacuolar/lysosomal do material intracelular. Após a descoberta de genes relacionados com autofagia ("ATG"), que são importantes para a autofagia no fermento e seres humanos, e a realização que autofagia desempenha um papel significativo na saúde e na doença (reconhecido por 2016 Prêmio Nobel de medicina ou fisiologia de Yoshinori Ohsumi), autofagia rapidamente se tornou um dos processos mais intensamente estudados na célula biologia^1,2.

Macroautophagy (doravante referida como "autofagia") é....

Protocol

1. célula semeadura e tratamento

1. Células aderentes de cultura em frascos de cultura de tecidos de² 75 cm numa incubadora umidificado com 5% CO₂ a 37 ° C, usando o meio de cultura preferido para o tipo de célula em questão. Permitir que as células a crescer até atingir uma camada de célula perto confluente.
   Nota: Use RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS) para LNCaP, HEK293, rato embrionários fibroblastos (MEFs), BJ, MCF-7 e as células de RPE-1.
   1. Lave as células com 3ml 37 ° C fosfato salino (PBS), pH 7,4. Substitua a PBS 3 mL 0,25% (p/v) tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar o fr....

Results

Usando o protocolo descrito aqui, a atividade de autophagic de sequestro em massa em um número de linhas de células de mamíferos diferentes, incluindo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, capnografia, H3122, Hec1A, MCF-7 T47D, U2OS, PC3, G361, mouse embrionários fibroblastos (MEFs), RPE-1, Células HEK293, BJ e LNCaP foi medido. Sequestro foi avaliado em condições basais (em médio completo, rico em nutrientes), ou em células agudamente faminta de soro e aminoácidos (uma bona fide indu.......

Discussion

Em resumo, o protocolo descrito aqui representa um método confiável e amplamente aplicável para monitorar a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. Em comparação com o original método de^12,16, ter removido um número de etapas desnecessárias, simplificamos várias das etapas restantes e introduziu uma substancial redução de escala. Como resultado, o protocolo é muito melhorado em relação ao custo e tempo-eficiência, e a mesma quantida.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e 2 mL	Placas de	211-2130 e 211-2120
	Solução	de
Accumax	Tecnologias Celulares Inovadoras	A7089	Mantenha as alíquotas em -20   C por anos, e na geladeira por alguns meses
Bafilomicina A1	Enzo	BML-CM110-0100	Dissolver em células DMSO
BJ	ATCC	CRL-2522	usar na passagem < 30
Albumina de soro bovino (BSA)	VWR	422361V
Câmara de contagem de Burker	Fisher Scientific	139-658585
Lâminas de câmara de contagem de células Countess	ThermoFisher Scientfic	C10228
Contador de células automatizado Countess II	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Tampa de vidro para a câmara	de contagem de BurkerFisher Scientific	139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26 poços, 15 e micro; L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x C)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Solução salina balanceada de Earle (EBSS)	Gibco	24010-043	contém 0,1% de glicose
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Cubeta de eletroporação (4 mm)	Bio-Rad	1652088
Eletroporador de onda de decaimento exponencial	BTX Harvard Aparelho	EMC 630
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma	F7524	10% de concentração final em células médias HEK1640
HEK293	RPMI	1640 ATCC CRL-1573
Imidazol	Sigma-Aldrich	56750	Autoclave uma solução de 65 mM e mantenha na geladeira por meses
Incubadora; Incubadora de CO2 de calor direto IR Autoflow	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Reagente de transfecção	ThermoFisher	13778150
células LNCaP	ATCC	CRL-1740	uso na passagem < 30
3-Metil Adenina (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	Estoque 100 mM em RPMI em -20 °C.  Aqueça o caldo a 65 graus; C por 10 min, e use a 10 mM de concentração final
Microcentrífuga Refrigerada	Beckman Coulter Life Sciences	368831
Microcentrífuga Refrigerada com função soft-mode	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 cloridrato (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	inibe a atividade da quinase ULK. Dissolva em DMSO.
Instrumento multianalisador MaxMat	Erba Diagnostics	PL-II
Células MCF7	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM Soro Reduzido Meio	ThermoFisher	31985062
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	20012-019
Ponteiras de pipeta 3 (0.5-20 µ L)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART Pontas de barreira Ponteiras
de pipeta (1-200 µ L)	VWR	732-2207	Pontas de barreira Thermo Fischer ART
Ponteiras de pipeta (100-1.000 µ L)	VWR	732-2355	Pontas de barreira Thermo Fischer ART
Pipetas	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP Kit
Poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	Faça uma solução estoque de 1 mg/mL em H2O. Esta solução é estável a -20 &graus; C por pelo menos 1 ano.
Células Pyruvate	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	Inibe a fosfoinositídeo 3-quinase classe III (PIK3C3). Dissolva em DMSO.
Controle Negativo de Seleção de Silenciador #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
siRNA de segmentação ATG9 (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	s35504
SiRNA de segmentação FIP200 (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	s18995
SiRNA de segmentação ULK1 (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silencer Select siRNA direcionado a ULK2 (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silencer Select SIRNA direcionado a GABARAP (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silencer Select siRNA direcionado a GABARAPL1 (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silencer Select siRNA direcionado a GABARAPL2 (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	s22387
Fosfato de sódio monobásico di-hidratado (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado (Na2HPO4 • 2H2O)	Prolabo	28014.291
Sucrose	VWR	443816T	10% de concentração final em água; filtrar através de 0,45 µ m filtra e mantém na geladeira por meses
Thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033	Inibe a bomba SERCA ER Ca2+. Dissolva em DMSO.
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	1% final
Trypan Blue mancha 0,4%	Sondas Moleculares	T10282
Tripsina-EDTA (0,25% com tripsina)	Gibco	25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287	0,01% final