Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários

Resumo

O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.

Resumo

Neurodegeneração de motoneurônios da coluna vertebral (MNs) está implicada em um grande espectro de doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscular espinhal, que são todos associados com atrofia muscular. Culturas primárias de MNs espinhais têm sido usadas amplamente para demonstrar o envolvimento de genes específicos em tais doenças e caracterizar as consequências celulares de suas mutações. Esta cultura de modelos um primário MN protocolo derivada do trabalho seminal de Henderson e colegas há mais de vinte anos. Primeiro, detalhamos um método de dissecar os cornos anteriores da medula espinhal de um embrião de rato e isolando os MNs de vizinhas células usando um gradiente de densidade. Em seguida, apresentamos uma nova forma de forma eficiente transfecting MNs com plasmídeo de expressão usando magnetofection. Finalmente, ilustramos como corrigir e delgados primário que MNS. usando mutações de Neurofilamento que causam a doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo demonstra uma abordagem qualitativa para expressar proteínas de interesse e estudar o seu envolvimento em Crescimento de MN, manutenção e sobrevivência.

Introdução

Doenças neuromusculares englobam uma variedade de patologias clinicamente e geneticamente distintas que caracterizam-se pela alteração do músculo e/ou o sistema nervoso. Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento, centenas de genes responsáveis por estas doenças raras foram identificadas durante a última década (lista disponível no centro de doença Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). A variedade de mutações identificadas indica que diferentes mutações em um único gene podem causar diferentes fenótipos e doenças^1,2,3 e que mutações em genes dif....

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aceites pelo Comité de ético da instituição.

1. preparação da solução

1. Prepare-se 10 mL de 4% de que BSA diálise no meio de L-15.
   1. Dissolva o pó de albumina de soro bovino em 4% (p/v) em 10 mL de meio de L-15.
   2. Adicione a solução para uma gaveta de diálise de 20 mL com um disco de corte 20 kDa. Dialize contra 500 mL do meio de L-15 por 3 dias sob agitação a 4 ° C. Altere o meio de L-15 todos os dias.
   3. Filtre a solução através de um 0,22 µm membrana e alíquota em tubos de 15 mL. Armazenar os tubos a-20 ° C.
      Nota: Este protocolo utiliza as seguintes refer....

Resultados

Depois de 24 horas na cultura, motoneurônios (MNs) já devem mostrar significativo crescimento axonal (pelo menos 6 vezes mais do que o tamanho da soma). Nos dias seguintes, axônios devem continuar a crescer e exibir ramificação (Figura 2). Vai haver diferentes morfologias devido às especificidades do subtipo. Por exemplo, coluna mediana MNs que inervam músculos axiais têm axônios mais curtos e mais ramificados do que a coluna lateral motor MNs que inervam o m.......

Discussão

Um dos pontos críticos no presente protocolo é que os embriões de rato são dissecados em uma janela de tempo preciso durante o desenvolvimento (E12.5) para otimizar a quantidade de MNs obtidos no final. Além disso, para um rendimento ideal, a dissecação deve ser realizada pela manhã ou no início da tarde. Antes de E12.5 (por exemplo, em E11.5), a dissecação é difícil, principalmente no que tange a eliminação das meninges. Depois de E12.5, o número de MNs obtidos cai significativamente. Para controlar a fase embr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material
Prato de dissecação	silicone Instrumentação de sistemas vivos	DD-90-S-BLK-3PK	Sylgard
lamínula redonda	NeuVitro, vidro Knittel	GG-12-Pre	12 mm
Slide a Lyzer	ThermoFisher Scientific	66030	20.000 MWCO ; 30 mL
Unidade de filtro	Filtros	Millipore SCGVU02RE
GP	Millipore	SLGP033RS
placa de 4 poços	ThermoFisher Scientific	167063	Nunclon Delta pinça de placa tratada
	FST por Dumont	11252-20	#5 pinça
tesoura	FST por Dumont	14060-10	de tesoura fina
	FST por Dumont	10035-20
bisturi	FST by Dumont	10316-14	bisturi de microfaca
Placa de Petri	Greiner	663102	ø x h = 100 x 15 mm
Tubo de polipropileno de 15 mL	Papel	352096
	Watman	1001125	125 mm de diâmetro
	Lab-Tek	154526	4 câmaras
Plasmídeo pCAGEN	Addgene	#11160
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soluções e meios
Albumina	de soro bovinoSigma-Aldrich	A9418
L-15 médio	ThermoFisher Scientific	11415056
L-15 médio, sem fenol vermelho	ThermoFisher Scientific	21083027
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634
Putrescina	Sigma-Aldrich	P5780
Conalbumina	Sigma-Aldrich	C7786
Selenito de sódio	Sigma-Aldrich	S5261
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783
Poli-DL-Ornitina	Sigma-Aldrich	P8638
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
tripsina 2,5%, 10x	ThermoFisher Scientific	15090046
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
PBS sem Ca Mg	ThermoFisher Scientific	14190144	sem Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonato	ThermoFisher Scientific	25080094
Meio de cultura de células neuronais	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus
HBSS	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
HEPES tampão 1 M	ThermoFisher Scientific	15630056
Densidade meio radiante	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep
suplemento médio	ThermoFisher Scientific	A3582801	B-27 Plus
Soro de cavalo inativado por calor	ThermoFisher Scientific	26050-088
L-Glutamina 200 mM	ThermoFisher Scientific	25030024
2-mercaptoetanol	ThermoFisher Scientific	31350010
penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122	10.000 U/mL
Nome	Empresa	Número de Catálogo<	strong>Comentários
Immuno fluorescência
PBS, 10x	ThermoFisher Scientific	X0515	sem Mg2+ Ca2+
Paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich	441244
soro de cabra normal	Sigma-Aldrich	G6767
glicina	Sigma-Aldrich	G7126
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Colina Acetil Transferase (CHAT)	Chemicon	Ab144P
Neurofilamento H não fosforilado (SMI32)	Biolegends	SMI-32P	IF em 1/1000
Ilhota-1	DSHB	40.2D6
Ilhota-2	DSHB	39.4D5
Hb9	DSHB	81.5C10
Meio de montagem Vectashield	Vector Lab	H-1000
Beta3 tubulina (clone Tuj1)	Biolegends	801201	IF a 1/1000
Lc3b	Cell Signaling Technology	#2775	IF a 1/200

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