Estabelecemos uma nova técnica cirúrgica para um modelo de perfusão na vivo único lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para estudar mais na vivo parcial fígado engenharia no futuro.
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Artigo de método
Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Órgão engenharia é uma estratégia nova para gerar substitutos de fígado órgão que potencialmente podem ser usados em transplante. Recentemente, na vivo fígado de engenharia, incluindo no vivo órgão decellularization seguido de repovoamento, emergiu como uma abordagem promissora sobre ex vivo fígado engenharia. No entanto, a sobrevivência pós-operatória não foi alcançada. O objetivo deste estudo é desenvolver uma nova técnica cirúrgica na vivo perfusão seletiva lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para engenharia na vivo hepática. Geramos um bypass do circuito somente através do lóbulo lateral esquerdo. Então, o lobo lateral esquerdo é perfundido com solução salina heparinizada. O experimento é executado com 4 grupos (n = 3 ratos por grupo) com base em tempos diferentes de perfusão de 20 min, 2h, 3h e 4h. sobrevivência, bem como a alteração macroscopicamente visível de cor e histologicamente determinada ausência de células do sangue na Tríade portal e os sinusoides, é tomado como um indicador para um estabelecimento de modelo de sucesso. Após a perfusão seletiva do lobo esquerdo lateral, observamos que o lobo lateral esquerdo, com efeito, tornou-se de vermelho amarelo fraco. Em uma avaliação histológica, sem glóbulos são visíveis no ramo da veia porta, a veia central e os sinusoides. O lobo lateral esquerdo fica vermelho após a reabertura dos vasos bloqueados. 12/12 ratos sobreviveram o procedimento por mais de uma semana. Nós somos os primeiros a relatar um modelo cirúrgico na vivo único lóbulo hepático da perfusão com um período de tempo de sobrevivência de mais de uma semana. Em contraste com o relatório publicado anteriormente, a vantagem mais importante da técnica apresentada aqui é que a perfusão de 70% do fígado é mantido durante todo o processo. O estabelecimento desta técnica fornece uma base em vivo parcial engenharia hepática em ratos, incluindo decellularization e recellularization.
Introdução
As indicações para a transplantação de órgãos estão em constante expansão. Em contraste, taxas de doação de órgãos e qualidade geral dos órgãos estão em declínio, levando a uma crescente demanda por enxertos. O número de candidatos adicionado à lista de espera de transplante de fígado continuou a aumentar (por exemplo, nos Estados Unidos, 11.340 pacientes foram adicionados em 2016, em comparação com 10.636 em 2015)1. Apesar dos esforços consideráveis, o número de órgãos disponíveis não satisfaz necessidades clínicas. Devido o aumento da incidência de doença hepática, muitos pacientes com estágio final morrem de doenças hepáticas na lista de espera de transplante antes um órgão doado se torna disponível. Para atender a enorme demanda por enxertos de doadores de fígado, abordagens alternativas usando o tecido hepático, princípios de engenharia estão a ser activamente prosseguido2. Hoje em dia, uma recém-desenvolvida técnica biológica de fígado engenharia potencialmente poderia superar esta falta.
Engenharia de fígado consiste em duas etapas: a geração de um andaime acelular, seguido de um repovoamento do cadafalso. Para obter um biológico acelular andaime de fígado, o fígado explantado é perfundidos através do sistema vascular com detergentes não iônicos ou iônicos, que pode remover o material celular do fígado. Na maioria dos estudos anteriores, um andaime de fígado acelular biológico foi alcançado por perfusão do fígado com uma combinação de Dodecil sulfato de sódio e TritonX100. Como resultado, todas as células foram removidas, Considerando que foi mantida a estrutura da matriz extracelular. Os andaimes de órgão foram novamente propagados com células maduras, hepatocelular, bem como linhas de células endoteliais e hepatócitos primários com ou sem a aplicação simultânea de células endoteliais ou células-tronco mesenquimais (MSC). Mais foco de pesquisadores em ex vivo fígado engenharia3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. No entanto, na maioria dos estudos anteriores, apenas pequenos pedaços de cubos de andaime repovoado foram transplantados em sites diferentes de implantação heterotópica. Em alguns estudos, andaimes repovoados parciais foram transplantadas como um enxerto de auxiliar. No entanto, o tempo máximo de sobrevivência relatada foi somente 72 h8,14. Tanto quanto sabemos, transplante ortotópico de um enxerto repovoado fígado completo ainda não foi executada ou publicado sobre. A função a longo prazo e a transplantação de órgãos projetados estão ainda em sua infância. Portanto, uma abordagem alternativa para ex vivo fígado engenharia é necessária.
Na vivo fígado engenharia pode representar uma alternativa para estudar o repovoamento hepático sob condições fisiológicas. As vantagens da engenharia na vivo fígado comparado com ex vivo fígado engenharia são múltiplas. Na vivo repovoada parcial fígado cadafalso é submetido a perfusão de sangue fisiológico com temperatura adequada, suficiente oxigênio, nutrientes e fatores de crescimento, em contraste com perfusão ex vivo com meio de cultura artificial. Além disso, o fígado normal parcial restante mantém a função hepática, principalmente permitindo a sobrevivência a longo prazo. Desde que um enxerto fígado implantado ex vivo engenharia é ainda incapaz de sustentar a sobrevivência a longo prazo dos animais experimentais por sua função hepática8, nós encaramos na vivo parcial fígado engineeringwould, finalmente, tornar-se um modelo promissor para um estudo mais aprofundado da evolução da engenharia fígados com observações de sobrevivência mais longos do que ex vivo.
Recentemente, um grupo de pesquisa (Pan e colegas) apresentou, pela primeira vez, uma técnica de fígado na vivo 15de engenharia. Eles alcançaram a perfusão isolada do lóbulo inferior direito fígado em ratos vivos apesar de desafios técnicos e anatômicos. Eles relataram os primeiros resultados no intra-operatório de repovoamento em vivo usando uma linha de celular de hepatócitos primários de rato. No entanto, o modelo de perfusão cirúrgica na vivo de Pan et al tem desvantagens. Eles alcançaram a perfusão único lóbulo hepático em ratos em detrimento de bloquear completamente a veia porta e veia cava inferior, que pode causar danos graves ao animal. Os ratos experimentais foram sacrificados após apenas 6 horas de tempo de observação intra-operatória. Portanto, a técnica de perfusão de fígado lobo na vivo mais precisa de melhoria para alcançar sobrevivência pós-operatória.
Desenvolvemos um modelo de sobrevivência romance na vivo perfusão de fígado lobo, com base em estudos anteriores da anatomia hepática do rato16, a técnica de canulação de veia porta para Monitorização hemodinâmica em ratos17e fígada bioengenharia 18 , 19. as principais etapas para o procedimento estão ilustradas na figura 1A - 1E.
Esta técnica é apropriada para aqueles que querem usar este modelo de perfusão experimental na vivo para a pesquisa básica no tratamento do órgão parcial por infusão com drogas, na vivo decellularization como uma ressecção química para doenças do órgão (por exemplo, , câncer de fígado), na vivo cultura de células em uma matriz de decellularized comparando ex vivo bidimensional e tridimensional de células cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26e na vivo fígado engenharia por decellularization e repovoamento.
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Protocolo
A habitação e todos os procedimentos realizados foram em conformidade com a legislação de bem-estar animal alemão. Todos gaze, coberta de roupas e instrumentos cirúrgicos são autoclavados e preparado antes da operação. Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis.
1. preparação do rato para o procedimento cirúrgico
- Coloque o rato em uma câmara de indução e anestesiar o rato com isoflurano 4% vaporizados e oxigênio a 100% a 0,5 L/min por cerca de 3 min, até que o rato é completamente anestesiado.
- Leve o rato fora da câmara de indução e medir o peso do seu corpo.
- Raspe a pele da região cirúrgica no abdômen.
- Coloque a animal de volta para a câmara de isoflurano para um adicional 2 min para aprofundar a anestesia.
- Coloque o rato em cima da mesa de operação na posição supina.
- Corrigir a máscara de anestesia a região da boca do rato... e manter o animal anestesiado com um fluxo contínuo de gás de 2% vaporizados isoflurano e 100% de oxigênio em uma taxa de fluxo de 0,5 L/min.
- Corrigi os membros com pedaços de fita.
- Aplique pomada de veterinário em ambos os olhos para evitar ressecamento.
- Administrar a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea, para aliviar a dor durante o período de operação.
- Desinfecte o campo cirúrgico do abdome com 3 rodadas de tintura de iodo, seguido por 2 rodadas de álcool a 70%.
- Lugar esterilizado gaze ao redor da área onde será feita a incisão para deixar apenas o campo de operação do abdômen exposto.
- Proceda para executar a operação quando o reflexo de retirada do dedo do pé-pitada do rato está ausente.
2. laparotomia do rato
- Faça uma incisão da pele e o músculo abdominal transversal usando uma tesoura e um Coagulador elétrica.
- Corrigir e puxe o processo xifoide em direção a cabeça usando uma sutura de polipropileno 4-0.
Nota: Atenção ao levantar-se acima do processo xifoide verticalmente para expor melhor o fígado, mas agir com precaução para evitar asfixia e restrição respiratória severa. - Abra a cavidade peritoneal puxando ambos os lados das paredes abdominais na direcção da cabeça com dois ganchos subcostal para expor o fígado.
- Cobrir o duodeno e o intestino na cavidade abdominal com uma gaze umedecida para evitar a secagem.
- Levante os lobos esquerdos e direito medianos usando uma gaze umedecida e segurá-los contra o tórax para expor melhor o Hilo do fígado.
- Coloque o rato sob um estereomicroscópio (ampliação de X 8).
- Larga solução salina morna no abdómen e na superfície do fígado e intestinos cada vários minutos, para evitar a secagem durante todo o processo.
3. estabelecimento de uma passagem de Bypass dentro o lobo Lateral esquerdo
- Dissecar a veia porta esquerda e ligá-lo com uma sutura de seda 6-0 na base (Figura 2A).
- Bloquear a artéria hepática esquerda, ducto biliar esquerdo junto com a veia portal mediana esquerda, artéria hepática mediana esquerda e ducto biliar mediano esquerdo com micro pinças para evitar um fluxo do perfusato ao lóbulo mediano esquerdo (Figura 2B).
- Separe o lóbulo lateral esquerdo cortando os ligamentos circundantes do lobo com micro tesouras.
- Bloquear a veia hepática lateral esquerda, fixando-se na base do lobo lateral esquerdo com pinças micro (Figura 2).
Nota: Certifique-se não fixar a veia porta esquerda também por engano. - Mosquito de uso grampos para prender a ligadura da veia portal esquerda e manter a veia com tensão adequada para canulação mais tarde.
- Cuidadosamente, fazer uma incisão na parede frontal da veia portal esquerda por puncioná-la com um cateter de agulha-moradia-24G ( Figura 3A).
Nota: Para criar um bypass, são necessários pontos de acesso vascular na veia porta esquerda e a veia hepática esquerda. Para esta etapa, é preferido para criar o acesso vascular por perfurar os vasos com uma agulha, ao invés de fazer uma incisão maior com uma tesoura. Isso reduz o risco de sangramento e posteriormente estenose. - Retirar o cateter e tire a agulha do cateter para obter um cateter 24G-agulha-livre.
- Conectar o cateter a um tubo de perfusão, de que o ponto de extremidade se conecta a uma seringa de 20 mL com 15 mL de 40 U/mL heparinizada em uma bomba de perfusão.
- Ligue a bomba para perfusing o tubo para expulsar o ar para fora do tubo e o cateter com agulha-livre.
- Desligue a bomba de perfusão.
- Mais uma vez, inserir o cateter com agulha-livre a veia portal esquerda através da incisão perfurada na veia (Figura 3B).
Nota: Devido ao fato de, há um espaço muito limitado para a fixação do cateter, neste momento não é fixo. Portanto, o cirurgião deve tomar cuidado para evitar o deslocamento do cateter canulado. - Cuidadosamente, fazer uma outra incisão na margem da região exposta da veia hepática lateral esquerda por puncioná-la com um cateter de agulha-moradia de 22 ou 24-G (Figura 3).
Nota: É recomendável que o cateter seja ligeiramente menor do que o navio. - Retirar o cateter e tire a agulha do cateter para obter um cateter livre de agulha 22-G.
- Ligue a bomba de perfusão para perfundir o soro fisiológico heparinizado para o lobo lateral esquerdo através do 24-G canulado livre de agulha cateter da veia portal à esquerda, a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.
- Utilize gaze seca para absorver o líquido resíduos out-fluindo ao redor da área de incisão da veia hepática lateral esquerda.
- Canule a veia hepática lateral esquerda através da incisão perfurada da veia com cateter de agulha-livre de 22-G, para gerar uma saída de fluido para minimizar a contaminação abdominal (Figura 3D).
Nota: É tecnicamente difícil fixar o cateter canulado no lóbulo do fígado. Portanto, o cirurgião deve prestar atenção para evitar o deslocamento do cateter. Como alternativa, sem canulação da veia hepática lateral esquerda com um cateter, resíduos líquidos também podem ser absorvidos na região da incisão da veia apenas com uma gaze seca. - Manter perfusing o lobo lateral esquerdo com soro fisiológico heparinizado para cerca de 20 min (grupo 1) e depois só com soro fisiológico para 2h, 3h ou 4h (grupo 2, grupo 3 e grupo 4, respectivamente).
- Desligue a bomba parar a perfusão.
4. fisiológica reperfusão do lóbulo Lateral esquerdo
- Tire os dois cateteres de veia porta esquerda e veia hepática lateral esquerda.
- Feche a incisão da veia portal esquerda com uma sutura de poliamida 11-0.
- Feche a incisão da veia hepática esquerda lateral com uma sutura de poliamida 11-0 também.
- Desprenda a veia hepática lateral esquerda.
- Desprenda a veia portal mediana esquerda, esquerdo ducto biliar e artéria hepática esquerda.
- Corte a ligadura na veia porta esquerda para reabrir a veia.
5. fechamento da parede Abdominal
- Feche a camada muscular da parede abdominal por sutura interrompida com uma sutura absorvível Poliglactina 910 de 4-0.
- Feche a camada de pele da parede abdominal por sutura interrompida com uma sutura absorvível polydioxanone de 4-0.
- Depois de fechar o abdome, Desinfecte a incisão da pele com álcool a 70%.
6. tratamento pós-operatório do rato
- Coloque o animal em uma almofada de aquecimento para a reanimação por cerca de 10 min e em seguida, colocá-lo em uma gaiola nova.
- Administrar a buprenorfina 0,05 mg/kg por via subcutânea, 2 x por dia para um d 3 consecutivo no pós-operatório liberar a dor.
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Resultados
Doze macho (idade 12 - 13 semanas) ratos Lewis foram utilizados para avaliar o efeito da perfusão seletiva lóbulo hepático. O experimento foi realizado em quatro grupos (n = 3 ratos por grupo). Usando diferentes perfusão os períodos de 20 minutos, 2 horas, 3 horas e 4 horas, seguindo os passos descritos acima, nós com sucesso na vivo perfusão único lobo.
Na Vivo Perfusão do lob...
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Discussão
Através do bloqueio e canulação da veia porta esquerda com um cateter como uma entrada de fluido e a veia hepática lateral esquerda com outro cateter como uma saída de fluido, com êxito geramos na vivo desvio fluido dentro do lóbulo lateral esquerdo, indicando que Embora a técnica é altamente desafiadora devido ao tamanho pequeno dos vasos para canulação e um alto risco de causar hemorragia, é viável. Até os ratos passando por um período longo de perfusão de 4 horas sobreviveram pelo menos 1 semana, mostrando qu...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostaria de agradecer Jens Geiling do Instituto de anatomia eu, Hospital da Universidade de Jena, para produzir os desenhos esquemáticos da anatomia do fígado de ratos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba de Perfusão | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Cateter | ||
| Cateter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74&vezes; 19mm |
| Versatus-W Cateter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9&vezes; Instrumento |
| micro cirúrgico de | |||
| micro tesoura | F· S· L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F· S· L | No.18055-05 | |
| Aplicador de micro grampos | F· S· L | No. 18057-14 | |
| Micro fórceps retos | F· S· L | No. 00632-11 | |
| Micro fórceps curvo | F· S· L | No. 00649-11 | |
| porta-agulha micro | F· S· L | No. 12061-01 | |
| cirúrgicos gerais | |||
| padrão sissors | F· S· L | ||
| grampo de mosquito | F· S· L | ||
| fórceps serrilhado | F· S· L | ||
| pinça dentada | F· S· L | ||
| porta-agulhas | F· S· L | ||
| sutura | |||
| 4-0 eticon | |||
| 4-0 ethicon*II | ethicon | ||
| 6-0 ethicon | |||
| 11-0 ethicon |
Referências
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Reimpressões e permissões
