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Genetics

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

Full-Length individuo proviral sequenziamento (Flip) fornisce un metodo efficiente e ad alta produttività per l'amplificazione e sequenziamento del singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1 (intatto e difettoso) e permette per la determinazione del loro potenziale replica-competenza. Salti mortali supera i limiti delle precedenti analisi progettate per sequenziare il serbatoio latente di HIV-1.

Abstract

Il dosaggio di Full-Length individuali Proviral Sequencing (Flip) è un metodo efficiente e ad alta velocità progettato per amplificare e la sequenza singola, nei pressi di provirus di HIV-1 (intatto e difettoso), full-length. RIBALTA permette di determinare la composizione genetica di HIV-1 integrato all'interno di una popolazione delle cellule. Attraverso l'identificazione di difetti all'interno di sequenze provirale di HIV-1 che si verificano durante la trascrizione d'inversione, come grandi omissioni interne, fermata deleteri codoni/hypermutation, mutazioni frameshift e mutazioni/delezioni in cis elementi sostituti necessari salti mortali, per maturazione del virione, è in grado di identificare integrato provirus incapace di replica. Il dosaggio di salti mortali possa essere utilizzato per identificare provirus di HIV-1 che mancano di questi difetti e sono quindi potenzialmente replica-competente. Il protocollo di salti mortali coinvolge: lisi delle cellule di infezione da HIV-1, nested PCR di vicino a full-length provirus di HIV-1 (utilizzando primers mirati al HIV-1 5' e 3' LTR), purificazione del DNA e quantificazione, preparazione libreria per Next-generation Sequencing (NGS), NGS, Assemblea de novo di contigs proviral e un semplice processo di eliminazione per l'identificazione di provirus replica-competente. Salti mortali fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali metodi progettati per sequenza integrato provirus di HIV-1, come singolo-proviral sequenziamento. Salti mortali amplifica e sequenze vicino a full-length provirus abilitazione competenza di replica deve essere determinato e utilizza anche meno primer di amplificazione, prevenire le conseguenze di mancate corrispondenze primer. Flip è uno strumento utile per la comprensione del panorama genetico dell'integrato provirus di HIV-1, soprattutto all'interno del serbatoio latente, tuttavia, il suo utilizzo può estendere a qualsiasi applicazione in cui è necessaria la composizione genetica di HIV-1 integrato.

Introduction

Caratterizzazione genetica del bacino di HIV-1 latente, che persiste in individui sulla terapia antiretrovirale a lungo termine (arte), è stato fondamentale per la comprensione che la maggioranza di provirus integrato sono difettosi e replica-incompetente1 , 2. durante il processo di trascrizione inversa, gli errori vengono introdotti nella sequenza proviral integrata. Alcuni meccanismi che generano difettosi sequenze proviral includono il soggetta a errori di enzima trascrittasi inversa dell'HIV-13, modello di commutazione4, e/o indotta da APOBEC hypermutation5,6. Due recenti studi hanno trovato che circa il 5% del provirus di HIV-1 isolato da individui sull'arte a lungo termine sono geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente e può contribuire a rimbalzo rapido nei livelli del plasma HIV-1 al momento della cessazione dell'arte 1 , 2 , 7. gli studi precedenti hanno identificato che replica-competente provirus di HIV-1 persistere nelle ingenuo e riposo memoria CD4+ T cell sottoinsiemi (compresi central, transitorio e cellule effettrici T di memoria), che indica l'importanza di targeting per queste cellule in futuro strategie di eradicazione2,8,9.

Primi approfondimenti la distribuzione, la dinamica e la manutenzione del serbatoio latente di HIV-1 sono stati ottenuti attraverso l'utilizzo di metodi di sequenziamento singolo-proviral (SPS) che caratterizzano geneticamente sub-regioni del genoma dell'HIV-110 ,11,12,13. SPS è uno strumento versatile, in grado di sequenziare un singolo provirus di HIV-1 all'interno di una singola cellula infettata. Tuttavia, SPS è in grado di determinare la replica-competenza del provirus, poiché solo sequenze sub-genomica provirus regioni e manca che contengono grandi omissioni all'interno di siti di legame del primer. Uno studio precedente ha dimostrato che SPS sopravvaluta le dimensioni del serbatoio replica-competente di 13 - 17 volte tramite sequenziamento selettivamente intatte regioni sub-genomiche2.

Per affrontare le limitazioni di SPS, Ho et al. 4 e Bruner et al. 1 sviluppato analisi di sequenza vicino a full-length provirus di HIV-1. Questo ha permesso la frequenza di geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente, provirus di HIV-1 in individui sull'arte a lungo termine deve essere determinato. Queste analisi amplificato ed ordinato (via Sanger sequenziamento) regioni sub-genomiche che sono stati poi assemblate per ottenere un provirus di HIV-1 sequenza di (intatto o difettoso). Tre limiti di questo approccio sono: 1) l'uso del primer di sequenziamento più aumenta il rischio di introdurre inavvertitamente difetti nella sequenza proviral, 2) primer disadattamento può impedire l'amplificazione del provirus particolare e 3) spesso i proviral intera sequenza non può essere risolto a causa della tecnicità di questi metodi.

Per superare le limitazioni delle esistenti analisi di sequenziamento proviral HIV-1 Full-Length, abbiamo sviluppato il Full -Length hondividual Proviral Sequencing (Flip) saggio. Flip è un sequenziamento di nuova generazione (NGS)-analisi di base che amplifica e sequenze vicino provirus di HIV-1 (intatto o difettosi) Full-Length in maniera efficiente e ad alta velocità. Salti mortali offre vantaggi rispetto le analisi precedenti, poiché limita il numero dei primer utilizzati; di conseguenza, diminuisce la probabilità di primer disadattamento, che può limitare la popolazione di provirus catturato o involontariamente introdurre difetti in una sequenza virale. Flip è anche tecnicamente meno impegnativo di saggi precedenti e prevede 6 passaggi principali: cellule Lisi 1) di infezione da HIV-1, 2) amplificazione del singolo provirus di HIV-1 tramite nested PCR eseguita a limitare la diluizione usando gli iniettori specifici per altamente conservato HIV-1 5' e 3' U5 LTR regione (Figura 1A), 3) purificazione e quantificazione dei prodotti amplificati, 4) preparazione della biblioteca di provirus amplificato per NGS, 5) NGS e 6) montaggio de novo di provirus in sequenza per ottenere contigs di ciascuno provirus individuali.

Sequenze generate da salti mortali possono subire un processo rigoroso di eliminazione per identificare quelli che sono geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente (Figura 1)2. Provirus geneticamente intatti mancano tutti i difetti noti che provocare la generazione di un provirus replica-incompetente. Questi difetti comprendono: sequenze di inversione, ampie delezioni interne, codoni di stop hypermutation/deleteri, frameshift o mutazioni in 5' imballaggio segnale o principali della giuntura sito donatore (MSD).

Figure 1
Figura 1: fasi critiche nell'analisi di sequenziamento proviral individuali Full-Length (Flip). (A) genoma di HIV-1 DNA con siti di legame del primer 5' e 3' regioni U5 LTR utilizzato da salti mortali per amplificare vicino a full-length provirus di HIV-1 (difettoso e intatto) tramite PCR annidata. (B) Layout di una piastra PCR a 96 pozzetti contenenti 80 pozzetti dei campioni (20 pozzi per ogni diluizione), 4 pozzi di controllo negativo e positivo 1 controllo bene. (C) processo di eliminazione utilizzato per identificare geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente, provirus di HIV-1. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalle commissioni per l'esame istituzionale presso la University of California San Francisco e Sydney locale salute distretto occidentale, che comprende il Westmead Istituto per la ricerca medica.

1. lisi delle cellule infettate da HIV-1

Nota: Le cellule possono essere isolate da sangue periferico, campioni di leucaferesi, biopsia del midollo osseo o la biopsia del tessuto. Popolazioni cellulari possono essere ordinate utilizzando fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS).

  1. Preparare un tampone di lisi contenente 10 mM Tris-HCl, 0.5% Nonidet P–40, 0,5% Tween-20 e 0,3 mg/mL proteinasi K. Per un pellet cellulare, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi per 1 x 106 cellule. Pipettare su e giù per mescolare. Incubare a + 55 ° C 1 ora seguita da 85 ° C per 15 min lisare le cellule e il rilascio di DNA genomico per l'amplificazione di PCR.
    Nota: Lisi cellulare sono sufficiente per ottenere il DNA di genomic per l'amplificazione. Nessun isolamento del DNA o la purificazione è necessaria. Il protocollo può essere sospesa a questo punto e DNA genomico può essere conservato a-20 ° C a tempo indeterminato.

2. amplificazione del singolo HIV-1 DNA provirus tramite PCR annidata

  1. Mescolare i reagenti per la PCR prima rotonda (PCR1) elencati nella tabella 1 (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 38 µ l di master mix 85 pozzetti (80 campioni, 4 controlli negativi, 1 controllo positivo) di una piastra PCR a 96 pozzetti (seguire il layout in Figura 1B). Designare questa piastra 'PCR1'.
Reagente Concentrazione finale Volume per PCR1 piastra (µ l) Volume per PCR2 piastra (µ l)
Forward Primer 1 ΜM 32,3 23,8
Reverse Primer 1 ΜM 32,3 23,8
Buffer (10x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 mM) 2 mM 129.2 95,2
dNTP (10 mM) 0,2 mM 64,6 47,6
DNA polimerasi (5 U / µ l) 0,025 U/Μ l 16,2 11,9
Ultrapura H2O 2632.5 1939.7

Tabella 1: Reagenti e volumi per PCR master mix.

Nota: I primers utilizzati per PCR1 sono:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 posizione 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 posizione 9662-9686)

  1. Dopo aver preparato il mix master, è possibile spostare la piastra PCR1 in un'area pulita destinata per l'aggiunta di DNA genomic.
    1. DNA genomico in serie diluito da 1:3 a 1:81 con Tris-HCl (5 mM, pH 8), preparando 45 µ l per ogni diluizione (sufficiente per 20 pozzi per ogni diluizione). Aggiungere 2 µ l di DNA genomico diluito per ogni campione bene e 2 µ l di Tris-HCl (5 mM, pH 8) per ogni controllo negativo ben (seguire il layout in Figura 1B). Sigillare tutti i pozzetti della piastra PCR1, escludendo il positivo controllano bene, utilizzando un sigillo adesivo trasparente (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Le diluizioni consigliate sopra servono solo come una guida iniziale per determinare la diluizione di punto finale. Diluizioni dipenderà la concentrazione di DNA di HIV-1 integrato all'interno dei campioni.
  2. Spostarsi in un'area designata per l'aggiunta del controllo positivo. Aggiungere 2 µ l di controllo positivo (pNL4-3 diluito a 105 copie / µ l) per il controllo positivo bene della piastra PCR1 e sigillare la piastra. Brevemente girare la piastra PCR1 in un filatore piastra PCR o centrifuga (400 x g per 10 s a temperatura ambiente) per tirare giù qualsiasi contenuto residuo dai lati dei pozzi.
  3. Eseguire la piastra PCR1 in un termociclatore: 94 ° C per 2 min; quindi a 94 ° C per 30 s, 64 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 61 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 58 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 21 cicli; quindi la 68 ° C per 10 min (in totale 30 cicli). Tenere a 4 ° C.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e la piastra PCR1 conservati a 4 ° C fino a 2 giorni.
  4. Mescolare i reagenti per il secondo turno della PCR (PCR2) elencati nella tabella 1. µ L 28 85 pozzetti (80 campioni, 4 controlli negativi, 1 controllo positivo) di una nuova piastra PCR a 96 pozzetti (seguire il layout in Figura 1B). Designare questa piastra 'PCR2'.

Nota: Il primer usati per PCR2 sono:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 posizione 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 posizione 9650-9676)

  1. Brevemente girare la piastra PCR1 in un filatore piastra PCR o centrifuga (400 x g per 10 s a temperatura ambiente) per tirare giù qualsiasi contenuto residuo dai lati dei pozzi. Aggiungere 80 µ l di Tris-HCl (5 mM, pH 8) in ciascun pozzetto della piastra PCR1.
    1. Trasferire 2 µ l della piastra PCR1 alla piastra PCR2 usando una pipetta multicanale. Garantire i campioni sono trasferiti bene per bene (cioè, 2 µ l da ben A1 di PCR1 piastra viene trasferito alla piastra di A1 di PCR2 bene). Sigillare la piastra di PCR2 con un sigillo adesivo trasparente (Vedi Tabella materiali).
    2. Brevemente girare la piastra di PCR2 in un filatore piastra PCR o centrifuga (400 x g per 10 s a temperatura ambiente) per tirare giù qualsiasi contenuto residuo dai lati dei pozzi. Sigillare la piastra PCR1 con una pellicola per la conservazione a lungo termine a-20 ° C di termosaldatura (Vedi Tabella materiali).
  2. Eseguire la piastra di PCR2 in un termociclatore: 94 ° C per 2 min; quindi a 94 ° C per 30 s, 64 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 61 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 58 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 3 cicli; 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 68 ° C per 10 min per 31 cicli; quindi la 68 ° C per 10 min (40 cicli totali). Tenere a 4 ° C.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e la piastra di PCR2 conservato a 4 ° C fino a 2 giorni.
  3. Brevemente girare la piastra di PCR2 in un filatore piastra PCR o centrifuga per tirare giù qualsiasi contenuto residuo dai lati dei pozzi. Aggiungere 60 µ l di Tris-HCl (5 mM, pH 8) ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale.
    1. Eseguire 15 µ l di ciascun pozzetto 2 x 48 pozzetti prefabbricati 1% gel di agarosio contenente etidio bromuro (0.1\u20120.3 µ g/mL, Vedi Tabella materiali). Utilizzare una scala con una gamma fino a 10 kb (Vedi Tabella materiali). Visualizzare per identificare i pozzetti contenenti il prodotto amplificato e loro dimensioni approssimative. Salvare l'immagine del gel.
      Nota: Assicurarsi che il controllo positivo contiene ben prodotto amplificato. Se i pozzetti di controllo negativo contengono prodotto amplificato, considera la contaminazione e ignorare la piastra.
  4. Determinare la diluizione alla quale non oltre il 30% dei pozzi sono positivi per prodotto amplificato.
    Nota: Questa è la diluizione di end-point in cui una maggioranza (80%) dei pozzetti contengono prodotto amplificato da un singolo modello. Questa diluizione dovrebbe essere preparata e utilizzata in PCRs successivo per ottenere ulteriori proviral ampliconi. Registrare la dimensione approssimativa di ogni prodotto amplificato.

3. quantificazione e purificazione di DNA

  1. Brevemente girare la piastra di PCR2 in un filatore piastra PCR o centrifuga per tirare giù qualsiasi contenuto residuo dai lati dei pozzi. 40 µ l di trasferimento dai pozzetti contenenti prodotto amplificato (o inferiore la diluizione di End-Point) di una nuova piastra 96 pozzetti midi (con un volume ben 0,8 ml, Vedi Tabella materiali).
    Nota: Annotare l'originale e nuova ben posizione di ciascun prodotto amplificato in un foglio di calcolo come un record di ogni prodotto amplificato da sequenziare.
  2. Purificare l'amplificato prodotti del DNA usando una purificazione di PCR di biglie magnetiche basata kit (Vedi tabella materiali) per rimuovere il primer, nucleotidi, enzimi, oli e sali. Prima di iniziare, portare biglie magnetiche a temperatura ambiente e preparare fresco 80% etanolo. Utilizzare nuovi puntali per pipette quando appropriato per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA.
    1. Biglie magnetiche vortice affinché che essi sono accuratamente risospese. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 40 µ l di perline per la 40 µ l di prodotto amplificato nella piastra 96 pozzetti midi 0,8 mL. Pipettare delicatamente su e giù per 10 volte per mescolare. In alternativa, è possibile miscelare la soluzione sigillando la piastra poi agitazione su un agitatore per micropiastre a 1.800 giri/min per 2 min. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    2. Posizionare la piastra su un supporto magnetico supporto (Vedi Tabella materiali) per 2 min. rimuovere e gettare surnatante.
    3. Lavare perline aggiungendo 200 µ l di etanolo di 80% ad ogni pozzetto con la piastra sul cavalletto. Incubare a temperatura ambiente per 30 s. rimuovere e gettare il supernatante. Ripetere una volta. Usando una pipetta multicanale con estremità sottili, rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso dopo il secondo lavaggio. Con la piastra sul cavalletto, lasciare asciugare per 15 min le perline per aria.
    4. Togliere la piastra dal cavalletto. Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto. Pipettare delicatamente su e giù per 10 volte per mescolare. In alternativa, è possibile miscelare la soluzione sigillando la piastra poi agitazione su un agitatore per micropiastre a 1.800 giri/min per 2 min. Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
    5. Collocare la piastra su un supporto magnetico per 2 min. usando una pipetta multicanale, trasferire 25 µ l di supernatante (DNA purificato) una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. Garantire che i campioni sono trasferiti pozzetto a altro (cioè, il surnatante del pozzetto A1 in 0,8 mL targa viene trasferito a pozzetto A1 della nuova piastra a 96 pozzetti).
      Nota: 5 uL del campione eluito è lasciato alle spalle per non garantire alcun trasferimento di perle di purificazione residua.
  3. Determinare e registrare la concentrazione approssimativa di ogni prodotto di DNA amplificato dopo purificazione utilizzando uno spettrofotometro (assorbanza alla lunghezza d'onda di 260 nm).
    Nota: Misurare la concentrazione approssimativa di ogni prodotto amplificato, è necessario in questa fase per garantire nessun campioni vengono persi durante le fasi di purificazione e che la concentrazione approssimata è all'interno della gamma della curva standard utilizzata nella prossima fase ( 0,001 – 1 ng / µ l DNA in 100 µ l di volume). Il protocollo può essere messo in pausa qui e puliti campioni possono essere conservati a-20 ° C fino a 6 mesi.
  4. Quantificare la concentrazione del DNA di ogni prodotto purificato mediante una quantificazione di dsDNA kit (Vedi tabella materiali).
    Nota: Questo comporta l'uso di una curva standard per determinare la concentrazione di dsDNA in un campione. Il kit comprende buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), lamda dsDNA standard e una tintura fluorescente. Conservare tutti i reagenti sul ghiaccio. Coprire le provette con il colorante con stagnola per evitare l'esposizione alla luce. Misurare la concentrazione di ogni prodotto amplificato in triplice copia.
    1. Buffer di diluire a 1x in dnasi gratuito H2O. aggiungere 99 µ l di tampone sterile per un congruo numero di pozzi vuoti (3 volte il numero dei prodotti amplificati da misurare, Vedi tabella 2 per un esempio di disposizione) di una piastra di coltura del tessuto di fondo piatto. Aggiungere 100 µ l di tampone di 3 pozzi vuoti.
    2. Per ogni prodotto amplificato da misurare, aggiungere 1 µ l di DNA purificato (dal punto 3.2.5) in triplice copia a ciascun pozzetto contenente tampone (Vedi tabella 2 per un esempio di disposizione).
    3. Per preparare gli standard, diluire lamda dsDNA 10 volte da 2 ng / µ l a 0.002 ng / µ l. aggiungere 100 µ l di ogni dsDNA standard a 3 pozzi.
      Nota: In seguito passo 3.4.4, la concentrazione finale delle norme sarà compreso tra 1 e 0,001 ng / µ l
    4. Diluire 1: 200 tintura fluorescente con buffer. Rapidamente aggiungere 100 µ l di ciascuna contenente ben campione, spazi vuoti e gli standard. Mescolare in su e giù con una pipetta. Coprire la piastra con un foglio per evitare il contatto con la luce.
    5. Leggere su un lettore di micropiastre l'emissione di fluorescenza (eccitazione a 480 nm, emissione a 520 nm). Risultati record in un foglio di calcolo.
    6. Determinare la concentrazione di dsDNA in ciascun campione utilizzando le misure di fluorescenza registrate. Sottrarre la fluorescenza misurata in pozzetti del bianco dal campione e standard. Determinare la fluorescenza media per ogni campione e standard dalle triplici copie. Disegnare una curva standard sulla base delle misure di fluorescenza degli standard. Determinare la concentrazione dei campioni rispetto gli standard.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) In bianco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL di tampone
B Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) In bianco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL di tampone
C Standard (1 ng/mL) Standard (0,1 ng/mL) Standard (0,01 ng/mL) Standard (0,001 ng/mL) In bianco
100 mL 100 mL 100 mL 100 mL 100 mL di tampone
D Esempio 1: Esempio 2: Esempio 3: Esempio 4: Esempio 5: Esempio 6: Esempio 7: Esempio 8: Esempio 9: Esempio 10: Esempio 11: Esempio 12:
1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone
E Esempio 1: Esempio 2: Esempio 3: Esempio 4: Esempio 5: Esempio 6: Esempio 7: Esempio 8: Esempio 9: Esempio 10: Esempio 11: Esempio 12:
1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone
F Esempio 1: Esempio 2: Esempio 3: Esempio 4: Esempio 5: Esempio 6: Esempio 7: Esempio 8: Esempio 9: Esempio 10: Esempio 11: Esempio 12:
1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone 1 mL DNA + 99 mL di tampone
G
H

Tabella 2: Schema di esempio di piastra a 96 pozzetti per la quantificazione di dsDNA.

  1. Diluire ciascun prodotto purificato (ottenuta al passaggio 3.2.5) con H2O a 0,2 ng / µ l.

4. sequenziamento libreria preparazione

  1. Preparare DNA provirale amplificato e purificato per utilizzando una preparazione di biblioteca del DNA NGS NGS kit (Vedi Tabella materiali). Seguire le istruzioni del produttore per tutti i tagmentation, l'amplificazione di PCR e operazioni di pulitura [tranne per il fatto che i volumi di reazione compreso ingresso DNA (dal punto 3.5) possono essere dimezzati per estendere l'uso di reagenti preparazione libreria].
  2. Normalizzare le librerie manualmente utilizzando una quantificazione di libreria basata su qPCR NGS kit (Vedi Tabella materiali) per determinare la concentrazione individuale del provirus. Combinare singoli provirus librerie in quantità equimolari a una concentrazione finale di 4 nM, o come specificato dal fornitore del servizio di sequenziamento.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e la libreria pool conservati a-20 ° C.
  3. Quantificare la libreria pool finale utilizzando lo stesso kit di quantificazione di dsDNA utilizzato al punto 3.4. Seguire le istruzioni del produttore. Determinare le lunghezze medio frammento eseguendo 1 µ l della biblioteca riunita in un sistema di elettroforesi automatizzata utilizzando un apposito kit (Vedi la Tabella materiali). Utilizzare la concentrazione ed il frammento medio lunghezze per determinare la molarità della biblioteca in pool.
  4. 5 µ l della libreria pool si combinano con 5 µ l di 0,2 N NaOH per denaturare la libreria. Aggiungere 5 µ l di 200 mM Tris-HCl a neutralizzare. Diluire la libreria finale a 12:05 con tampone di ibridazione refrigerati (disponibile con kit di preparazione di DNA libreria) immediatamente prima del sequenziamento.
  5. Eseguire l'ordinamento di 2 x 150 del nucleotide (nt) accoppiato-fine su una piattaforma adeguata di NGS (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Quando 96 provirale librerie vengono indicizzate per corsa, questo produce circa 20 milioni accoppiato-fine letture per corsa o 200.000 al Biblioteca del provirus individuali per l'analisi di seguito de-multiplexing. Punti 4.4 e 4.5 vengono in genere eseguite da un centro di sequenziamento.

5. montaggio del De Novo di sequenziata provirus di HIV-1

Nota: Per ottenere la sequenza genetica di ogni amplificato provirus, contigs sono assemblati de novo da fine accoppiato letture. Molte piattaforme (ad esempio, CLC Genomics Workbench14), permettono la progettazione di flussi di lavoro personalizzati per il montaggio de novo . Altri software open source come FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17e FLASH18 può essere utilizzato anche per letture di elaborazione, nonché strumenti come Bowtie219 e picche20 per lettura mappatura e de novo assembly. I passaggi per l'assemblaggio de novo di HIV-1 contigs utilizzando una piattaforma commerciale specifica (Vedi la Tabella materiali) sono descritte di seguito (Figura 2). File di flusso di lavoro personalizzato è disponibile su richiesta.

  1. Importare sequenze e controllare la qualità: importa la sequenza associata legge (in formato fastq.gz) nel software, che verrà poi combinato come insieme unico di letture accoppiate. Generare una sequenza report CQ ed esaminare la qualità dei vostri dati.
  2. Controllo di qualità
    1. Eseguire la rimozione di lettura secondo il rapporto QC. Rimuovere qualsiasi scheda sequenze e ambigui nucleotidi. Tagliare quindici 5' e due nucleotidi terminali 3'. Scartare legge meno di 50 nucleotidi di lunghezza. Utilizzare un limite di qualità rigorosi di 0,001 corrispondente a un punteggio di phred QC di 30.
  3. L'Unione di coppie sovrapposte
    1. Formano singole letture estese unendo accoppiati in avanti e retromarcia letture con le regioni di sovrapposizione.
  4. Assemblea de novo
    1. Utilizzare l'assembler nativo del de novo CLC genomics con una dimensione di parola (o k-mer) di 30 nt e una dimensione massima bolla di 65 nt per assemblare un sottocampione casuale di 10.000 letture accoppiati non sovrapposte. La copertura prevista per il contig de novo assemblato è ~ 200 x per una sequenza di ~ 9 kb.
      Nota: Questo sottocampionamento può ridurre l'onere computazionale, tale che la maggior parte dei computer desktop in grado di gestire l'assemblaggio e l'analisi e dato il clonality di ogni provirus (una libreria è un provirus), questo non limita la diversità.
  5. Rieseguire il mapping di tutte le letture di contigs
    1. Per ottenere la sequenza di consenso di maggioranza finale di ogni provirus, mappare la lettura completa impostata il contig de novo assemblati. Accettare solo contigs con una copertura media minima di 1.000 x e garantire che la lunghezza finale contig corrisponde alla dimensione della band sull'originale gel di agarosio (passo 2.8.1). Salvare la sequenza di consenso di maggioranza finale come file. fasta.
      Nota: la maggior parte contigs può essere assemblato utilizzando la procedura descritta sopra. Tuttavia, in alcuni casi, per un singolo provirus, contigs multipli con una copertura simile sono assemblati. In queste circostanze, contigs sono allineati a un vicino Full-Length (~ 9 kb) sequenza di consenso dallo stesso partecipante e assemblati manualmente in un singolo contig. Tutte le letture vengono quindi mappate al contig assemblato manualmente e il consenso finale accettato se leggere copertura è anche durante l'Assemblea e no single nucleotide polymorphisms (SNPs) > 40% sono presenti.
  6. Ulteriore controllo di qualità
    1. Per garantire ogni contig rappresenta un singolo provirus e non è dovuto l'amplificazione del provirus multipli all'interno di un singolo pozzo, schermo leggere copertura e variante chiamata il contig finale.
    2. Più modelli proviral presenti durante la PCR sono spesso identificati da copertura per saperne molto irregolare (a causa della co-amplificazione di provirus di diverse dimensioni) quando il mapping a un full-length consenso dal partecipante stesso, o dalla presenza di SNPs con un frequenza di > 40% (Vedi risultati rappresentativi, Figura 4). Ignorare le popolazioni miste nelle analisi successive.
  7. Allineamento
    1. Importare il consenso finale di ogni sequenza proviral in sequenza software come genetica evolutiva molecolare analisi (MEGA) 721di visualizzazione. Allineare ogni sequenza manualmente per la sequenza di riferimento HXB2. Tagliare il 5' e 3' finisce per posizioni 666-9650 di HXB2 per rimuovere le sequenze dell'iniettore.
    2. Esportare l'elenco di sequenza in formato fasta e quindi allineare utilizzando MAFFT versione 722, con modifica manuale ove necessario ottenere l'allineamento finale.
      Nota: Se le sequenze non sono allineate, inverso prima completare la sequenza. Se la sequenza non è ancora allineata eseguire una ricerca BLAST per assicurare che la sequenza è HIV-1. È possibile amplificare modelli non-HIV-1 e questi possono essere identificati in questa fase. Se le sequenze sono HIV-1 ma non sono allineate, considera la presenza di inversioni (vedere punto 6.1).

6. determinazione della potenziale replica competenza delle sequenze Proviral di HIV-1

Nota: Per identificare sequenze di geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente, provirus di HIV-1 che è un rigoroso processo di eliminazione seguita (Figura 1). Proviral sequenze carente inversioni, ampie delezioni interne, deleteri stop codoni / hypermutation, mutazioni frameshift, e/o difetti del segnale di sito o imballaggio di MSD sono considerati geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente.

  1. Inversioni
    1. Durante la fase di allineamento, identificare inversioni. Le inversioni sono regioni dove la sequenza non è allineata al riferimento HXB2 a meno che la regione è invertire completato.
      Nota: A seconda dell'applicazione dei dati, sequenze contenenti inversioni debba essere omesso da un'ulteriore analisi.
  2. Ampie delezioni interne
    1. Identificare contigs con ampie delezioni interne (> 600 bp) in fase di allineamento. A meno che la cancellazione si siede all'interno di nef, la sequenza può essere definita come difettoso.
      Nota: Tutte le sequenze con le omissioni interne < 600 bp saranno identificati da Gene Cutter (punto 6.3.1) come avendo sequenze geniche incompleta.
  3. Codoni di stop deleteri, frameshift mutazioni e delezioni
    1. Verifica tutti i contigs di lunghezza > 8400 nucleotidi per la presenza di codoni di stop deleteri, frameshift e sequenze geniche incompleta utilizzando il Los Alamos National Laboratory HIV sequenza Database Gene Cutter strumento23.
      Nota: Lo strumento Gene Cutter divide la sequenza proviral in geni gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env e nefe li traduce agli aminoacidi. Gene Cutter poi schermi per la presenza di mutazioni frameshift (a causa di inserimenti o eliminazioni) e codoni di stop. Contigs contenenti codoni di stop o retromutazione in qualsiasi gene, escluse nef24, sono classificati come difettoso. Gene Cutter identifica anche sequenze geniche incompleta e qualsiasi provirus con un'omissione < 600 bp in un gene diverso da nef può essere riclassificato come difettoso a causa di una grande omissione interna.
  4. Hypermutation
    1. Generare un consenso delle restanti sequenze full-length provirale usando il Los Alamos National Laboratory HIV sequenza Database consenso Maker strumento (creatore di consenso semplice)25. Aggiungere la sequenza di consenso nella parte superiore di un tracciato contenente solo le restanti sequenze provirale full-length. Utilizzando questo allineamento e il Los Alamos National Laboratory HIV sequenza Database Hypermut strumento26 per identificare indotta da APOBEC G-A ipermutazione nelle restanti sequenze provirale full-length.
  5. Difetti nella MSD e segnale di imballaggio
    1. Ispezionare tutte le rimanenti contigs per difetti di MSD e il segnale di imballaggio (HXB2 regione 670-810) che rendono la sequenza proviral difettoso4. Cercare una mutazione di punto nel sito MSD (sequenza GT, HXB2 744-745) o qualsiasi omissione in quattro cicli del segnale imballaggio del gambo (SL1 SL2 (HXB2 691-734), (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779) e SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

Il dosaggio di FLIPS amplifica e sequenze singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1. Il protocollo prevede 6 passaggi per ottenere vicino a sequenze proviral integrali. Tali passaggi includono: lisi delle cellule, la PCR annidata del provirus HIV-1 Full-Length (intatto e difettoso), la purificazione del DNA e la quantificazione, sequenziamento preparazione libreria, NGS, infette e sequenziato Assemblea de novo del provirus. Alla fine di ogni passo può essere considerata un checkpoint in cui la qualità del prodotto (ad es. amplificati del DNA, DNA purificato, biblioteca di sequenziamento o sequenza) può essere valutata prima del passaggio successivo. Una panoramica della valutazione effettuata alla fine di ogni passaggio e i risultati attesi è descritto di seguito.

In seguito la PCR annidata, prodotti amplificati vengono eseguiti su un gel di agarosio 1% (Figura 3). La qualità iniziale del PCR può essere determinata mediante ispezione dei controlli positivi e negativi. Pozzetti di controllo negativo contenente prodotto amplificato indicano contaminazione e pozzetti di controllo positivo assente del prodotto amplificato indicano insufficiente amplificazione. Successivamente, pozzetti contenenti prodotto amplificato sono selezionati per il sequenziamento. Per evitare pozzetti contenenti miscele di più amplificato provirus, solo pozzetti contenenti prodotto amplificato eseguita alla diluizione di End-Point sono considerati per il sequenziamento. Secondo la distribuzione di Poisson, la diluizione di End-Point si trova quando il 30% dei pozzi sono positivi per prodotto amplificato. A questa diluizione, c'è un 80% probabilità questi pozzetti contengono un singolo provirus amplificato. Inoltre, pozzetti contenenti più amplificato provirus di lunghezze diverse possono essere visualizzati in questa fase come bande multiple apparirà sul gel. Questi pozzi non devono essere selezionati per la sequenziazione (Figura 3).

Dopo purificazione del provirus amplificato selezionato per il sequenziamento, quantificazione garantisce che nessun DNA provirale è perso durante la fase di purificazione. Se la concentrazione di DNA di un provirus amplificato è < 0,2 ng / µ l, il restante campione in PCR2 piastra può essere purificato. Un simile punto di arresto si verifica dopo la preparazione della biblioteca, in cui ogni singola biblioteca è quantificato. In questo modo provirus individuali sono stati opportunamente frammentato, etichetta e amplificato prima del sequenziamento. Provirale singole librerie sono in pool in quantità equimolari a una concentrazione finale di biblioteca di 4 nM (o come specificato dal provider di sequenziamento). Se la concentrazione di una singola libreria proviral è troppo bassa, può essere escluso dal pool di biblioteca di sequenziamento, o la singola biblioteca preparato ancora una volta. Prima del sequenziamento insieme confermando le lunghezze medio frammento viene eseguito un controllo finale della concentrazione della biblioteca in pool.

Passaggi di controllo di qualità prima della fase di assemblaggio del de novo assicura la qualità del legge utilizzato per assemblare il contig proviral finale. Tali passaggi includono: rimozione delle sequenze di adattatore, taglio 5' e 3' nucleotidi, un limite di qualità rigorosi e trascurando brevi letture. CLC Genomics Workbench può fornire report di controllo di qualità che può essere utilizzato prima di valutare la qualità iniziale delle letture e impostazioni della Guida di taglio e poi dopo per determinare se l'operazione di taglio sarebbe stato sufficiente per rimuovere aree di bassa qualità. Inoltre, per l'assemblaggio de novo , la qualità della contigs assemblato può essere valutata per profondità sufficiente (> 1000 X) e uniformità di copertura (Figura 4A). Popolazioni miste possono essere identificati anche in questa fase. Miscele di più Full-Length (~ 9 kb) provirus vengono identificate attraverso la presenza di SNPs multipli con una frequenza superiore al 40%, considerando che miscele di short (contenente una grande omissione interna) e full-length provirus possono essere identificate da irregolare leggere la copertura dopo il mapping a un full-length di riferimento dal partecipante stesso (Figura 4B).

A seconda dell'applicazione, l'allineamento finale possa essere visualizzato utilizzando strumenti come ggtree disponibile come pacchetto in "r: A linguaggio e ambiente per il calcolo statistico"27. In uno studio recente, salti mortali è stato utilizzato per provirus di HIV-1 sequenza da ingenuo, centrale, transitorio ed effettrici memoria CD4+ T cellule isolate da individui sull'arte a lungo termine, con lo scopo di identificare se sottoinsiemi a cellula particolare ha mostrato maggiore proporzioni di geneticamente intatti e potenzialmente competenti replica HIV-12. Qui, la rappresentazione visiva delle sequenze isolato da uno dei partecipanti di questo studio (partecipante 2026) è presentato (Figura 5). In questo partecipante, la maggioranza (97%) delle sequenze era difettosa, con intatti sequenze trovate effettrici e transitorio memoria CD4+ T cellule. Questo strumento di visualizzazione è utile per mostrare il numero di sequenze con le grandi omissioni interne e la loro posizione nel genoma. Possono essere annotata ulteriormente per indicare sequenze con codoni di stop deleteri, frameshift mutazioni e delezioni/mutazioni nel sito MSD e/o segnale di imballaggio.

Una applicazione del dosaggio FLIPS è l'identificazione di geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente provirus di HIV-1. In un recente studio di 531 sequenze isolate da CD4+ T cellule da 6 partecipanti sull'arte a lungo termine, 26 (5%) geneticamente intatti provirus di HIV-1 sono stati identificati2. Il restante provirus difettoso incluso quelli con sequenze di inversione (6%), grandi delezioni interne (68%), fermata deleteri codoni/hypermutation (9%), mutazioni frameshift (1%) e difetti del segnale di imballaggio e/o mutazioni nel sito MSD (11%) .

Figure 2
Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro per il montaggio del de novo del provirus di HIV-1. i principali passaggi del flusso di lavoro includono: 1) sequenza leggi di controllo di qualità, 2) Unione di coppie sovrapposte, 3) Assemblea de novo e 4) rimappatura e costruzione del consenso è state colorate di rosso, blu, verde e arancio, rispettivamente. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: esempio gel dell'agarosi del PCR amplificato provirus di HIV-1. Pozzetti 1, 2, 3, 6, 9 e 10 contengono amplificato provirus di HIV-1. Ben 10 contiene un provirus con una grande omissione interno, ben 2 contiene co-amplificazione di due provirus di HIV-1 di diverse lunghezze (miscela), e contiene ben 12 controllo positivo. Nota la percentuale di pozzetti contenenti prodotto amplificato è 60%, che è di sopra della percentuale richiesta per isolare i singoli modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempio di output di lettura mappatura. (A) esempio che illustra anche la copertura per l'amplificazione di un singolo full-length provirus di HIV-1. A seguito di Assemblea de novo , tutte le letture vengono mappate a del contig assemblati per produrre una sequenza di consenso. La piattaforma software consente le letture mappate da ispezionare per sufficiente e anche la copertura. (B) esempio dimostrando co-amplificazione di due provirus di HIV-1 di diverse lunghezze (miscela). Per determinare le miscele, letture sono mappate a una sequenza di riferimento Full-Length (~ 9 kb) dal partecipante stesso e leggere mappatura ispezionato. La presenza di copertura irregolare indica una miscela. Questa figura è riprodotto con permesso da Qiagen14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Esempio di visualizzazione delle sequenze proviral di HIV-1 isolato da CD4+ T cell sottoinsiemi da un individuo sull'arte a lungo termine. Proviral sequenze individuali HIV-1 sono rappresentati da linee orizzontali. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il dosaggio di salti mortali è un metodo efficiente e ad alta resa di amplificazione e sequenziamento singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1. I fattori multipli e passaggi critici nel protocollo che influenzano il numero e la qualità delle sequenze ottenute sono state identificate. In primo luogo, il numero delle cellule e la frequenza di infezione di HIV-1 della popolazione cellulare influenzano il numero di provirus amplificato. Ad esempio, in una precedente pubblicazione, circa la metà come molte sequenze sono state ottenute dallo stesso numero di ingenuo CD4+ T cellule rispetto alla memoria effettrici CD4+ T cellule. Questo è perché le cellule naive in genere hanno una frequenza più bassa di infezione che di cellule effettrici memoria2. In secondo luogo, la lisi cellulare sono preferibile ai metodi di estrazione basata su colonne per l'ottenimento del DNA genomico non c'è alcun rischio di perdere del DNA nel processo di estrazione. Infine, come con qualsiasi analisi PCR-basata, impedendo la contaminazione è fondamentale. Zone separate pulite dovrebbero essere designate per la preparazione di mix master, manipolazione del DNA di genomic, aggiunta di controlli positivi, purificazione del DNA e quantificazione e preparazione di biblioteca. Ciò è particolarmente importante per singola copia saggi come quello qui presentato.

Implementazione del dosaggio FLIPS prima dovrebbe includere in esecuzione di un controllo positivo ad esempio plasmidi pNL4-3 piuttosto che campioni partecipanti. Questo permetterà per qualsiasi risoluzione dei problemi prima che l'uso di cellule positive del HIV-1, come le sequenze ottenute possono essere paragonate alle sequenze di riferimento disponibili per questi plasmidi. Quando si utilizza cellule positive del HIV-1, è importante considerare il sottotipo di HIV-1 (primer disegnati per salti mortali sono specifici al sottotipo B) e la frequenza di infezione della popolazione cellulare se poco o nessun provirus vengono amplificato. Sequenze dell'iniettore possono essere per volta/ridisegnato per abbinare altri sottotipi. Inoltre, un bene che contiene un controllo positivo dovrebbe essere incluso in ogni PCR eseguita.

Salti mortali ha superato i limiti della precedente analisi di sequenziamento, compreso SPS. FLIPS, attraverso amplificazione e sequenziamento vicino a full-length provirus di HIV-1, è in grado di determinare la potenziale replica-competenza del provirus di HIV-1. Questo non era possibile utilizzando SPS, che solo regioni sub-genomiche in sequenza e quindi selezionati per le sequenze con siti di legame del primer intatto. Inoltre, FLIPS supera i limiti associati all'utilizzo più amplificazione e primer di sequenziamento, come è stato impiegato da precedente full-length sequenziamento saggi1,4. Attraverso due cicli di PCR indirizzando le regioni LTR di HIV-1 combinate con NGS, FLIPS diminuisce il numero e la complessità degli iniettori richiesto. Salti mortali è quindi meno suscettibile alle conseguenze del primer disadattamento, vale a dire l'identificazione erronea del provirus difettoso e un'incapacità di amplificare alcune provirus all'interno di una popolazione. Il protocollo di FLIPS è anche più efficiente e consente un throughput più elevato del sequenziamento rispetto ai metodi precedenti.

Evidentemente, FLIPS fornisce vantaggi rispetto ai metodi esistenti che determinano la composizione genetica di provirus di HIV-1. Tuttavia, è importante riconoscere i limiti di lanci. In primo luogo, il dosaggio di salti mortali non è stato sviluppato come uno strumento per misurare le dimensioni del bacino di HIV-1 latente, come analisi per determinare se FLIPS amplifica ogni provirus di HIV-1 presenti in una popolazione delle cellule non sono state completate. Salti mortali è invece utile per effettuare confronti relativi della composizione del serbatoio tra cellulari differenti popolazioni2. In secondo luogo, la replica-competenza del intatta provirus di HIV-1 non può essere determinata con certezza senza analisi in vivo , ad esempio quelle eseguite da Ho et al. 4. in terzo luogo, salti mortali non è progettato per determinare il sito di integrazione del provirus di HIV-1.

Piccole variazioni al protocollo FLIPS possono aumentare la sua applicazione. Ad esempio, le variazioni di primer sequenze possono consentire diverse e molteplici sottotipi di HIV-1 ad essere amplificato ed ordinato. Sequenziamento dei virions del plasma HIV-1 è possibile attraverso l'aggiunta di sintesi del cDNA prima del PCR annidata. Futuro utilizzo dei metodi di sequenziamento di singola molecola eliminerà la necessità per l'assemblaggio de novo .

Sequenziamento genetico di integrato provirus di HIV-1 ha aumentato la nostra comprensione del bacino latente di HIV-1. Flip è uno strumento importante per gli studi futuri delucidando la composizione e la distribuzione del serbatoio latente. Tuttavia, l'applicazione di lanci può estendersi oltre il serbatoio. Gli studi futuri possono utilizzare i salti mortali per determinare obiettivi particolari per tecnologia CRISPR-Cas, o contribuire all'identificazione di codifica e regioni non codificanti, che rendono il virus più reattivo alla latenza agenti di retromarcia. Ricombinazione virale può essere meglio compresa guardando i siti di giunzione di ampie delezioni interne.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato Delaney AIDS ricerca Enterprise (DARE) per trovare una cura (1U19AI096109 e 1UM1AI126611-01); un amfAR Consorzio di ricerca su HIV eradicazione (ARCHE) Collaborative Research Grant della Fondazione per la ricerca sull'AIDS (amfAR 108074-50-RGRL); Australian Centre for HIV ed epatite virologia ricerca (ACH2); UCSF-GIVI centro per la ricerca sull'AIDS (P30 AI027763); e l'Australian National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Vorremmo ringraziare Dr. Joey Lai, genomica Facility Manager presso l'Istituto di Westmead ricerca medica per la sua formazione in libreria preparazione e uso del suo impianto e il centro di Ramaciotti per genomica (Università del New South Wales, Sydney, Australia) per lo svolgimento di sequenziamento. Riconosciamo con gratitudine i partecipanti che hanno donato i campioni per questo studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

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Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

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