Aqui, apresentamos um protocolo para isolar a fucoxantina clorofila a/c proteínas obrigatórias (FCP) de diatomáceas e incorporá-las em lipossomas com composições de lipídios naturais para estudar a transferência de energia de excitação sobre as alterações de composição do íon.
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Artigo de método
Isolando e incorporando luz-colheita antenas de diatomáceas Cyclotella Meneghiniana em lipossomas com lipídios tilacoides
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desempenho fotossintético de plantas, algas e diatomáceas depende fortemente do Regulamento rápido e eficiente, a colheita de luz e energia processos de transferência na membrana tilacoides de cloroplastos. A luz da colheita antena de diatomáceas, as proteínas de ligação a/c de clorofila do chamado fucoxantina (FCP), são necessários para a absorção de luz e centros de transferência eficiente para a reação fotossintética também quanto a foto-proteção contra luz em excesso. O interruptor entre essas duas funções é uma questão de longa data de pesquisa. Muitos desses estudos tenham sido realizados com FCP em micelas de detergente. Para estudos de interacção, os detergentes foram removidos, o que levou a uma agregação inespecífica de complexos do FCP. Nesta abordagem, é difícil discriminar entre artefatos e dados fisiologicamente relevantes. Portanto, informações mais valiosas sobre FCP e outro luz de membrana acoplada colheita complexos podem ser obtidas através do estudo de interações da proteína-proteína, transferência de energia e outros recursos espectroscópicos se estão inseridos em seu ambiente nativo de lipídios. A principal vantagem é que os lipossomas têm um tamanho definido e uma proporção de lipídio/proteína definidos pelo qual a extensão do FCP cluster é controlada. Além disso, alterações na composição do pH e íon que regulam a luz colheita na vivo podem ser facilmente simuladas. Em comparação com a membrana dos tilacoides, os lipossomas são mais homogêneo e menos complexo, que torna mais fácil de obter e compreender dados espectroscópicos. O protocolo descreve o procedimento de FCP isolamento e purificação, preparação de lipossomas e incorporação do FCP lipossomas com composição lipídica natural. Resulta de uma aplicação típica são dadas e discutidas.
Introdução
Organismos fotossintéticos como diatomáceas devem lidar com a constante mudança de condições de luz e responder com mecanismos sofisticados de aclimatação que sustentar alta eficiência fotossintética e protegem contra danos foto-oxidativo causado pela luz excessiva. Um processo de luz-protetores principal em eucariontes fotossintéticos é a alta energia têmpera (qE) da luz absorvida que ocorre como a principal contribuição para a não-fotoquímica têmpera (NPQ) sob condições de estresse leve1,2 ,3. Os complexos de antena colheita luz (LHC) estão envolvidos na regulaç....
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Protocolo
Nota: Complexos fotossintéticos como FCPs são altamente vulneráveis à luz e ao calor. Sempre trabalho no gelo e sob uma luz muito fraca.
1. isolamento de FCP de células
-
Isolamento de tilacoides de células de c. meneghiniana
- C. meneghiniana em cinco frascos de 500 mL que cada um preenchido com 300 mL de ASP-médio23,25 e 50 milhões de células de crescer. Conecte os frascos com uma rolha de algodão e permitir que as células a crescer para a fase de crescimento exponencial por aproximadamente uma semana num agitado....
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Resultados
O protocolo descreve o isolamento de fracção FCP total de Cyclotella meneghiniana e incorporação em lipossomas com composição lipídica nativo. O isolamento de tilacoides é altamente reprodutível, mas o rendimento de tilacoides pode mudar. O resultado é aceitável se a mais de 50% de todos os pigmentos são recuperados em etapa 1.1.4. Mais de 80% é o ideal.
A solubilização da contém é uma etapa crítica. Bem solubilized mem.......
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Discussão
Lipossomas FCP com composição lipídica natural fornecem uma ferramenta útil, simples e reprodutível para investigar Propriedades espectroscópicas in vitro. O ambiente de lipídios em lipossomas FCP assemelha-se a situação dentro da membrana tilacoides, dando origem a resultados experimentais que aproximam-se às condições naturais.
Existem várias vantagens de usar c. meneghiniana como um sistema modelo para antena do FCP. Ele cresce relativamente rápido e é mais robusto em comp.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Rana Adeel Ahmad para assistência na purificação do FCP. Prof Claudia Büchel é reconhecido por discussões úteis e ler o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação de pesquisa alemã para LD (DI1956-1/1) e a Fundação Humboldt para uma bolsa de Feodor Lynen para ld.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Frascos de centrífuga de 500 ml centrífuga | |||
| de alta velocidade | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bü hler (edmund-buehler.de)versão | mais recente: Vibrogen-Zellmü hle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µ m | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| Funil de filtro VitraPOR - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| frascos de policarbonato ultracentrifuagtion (30 mL) para T-865 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a.rotor | |
| T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Câmara de Contador de Células Neubauer (melhorada) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| cubetas de vidro óptico (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecil-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Tubos Ultra-Clear 17 ml para AH629 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrana concentrator_Centriprep corte de 30 | kDa Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | ||
| planilha de escritório livre | A fundação do documento | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| cubetas de vidro especiais para fluorescência (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Espectrofluorômetro FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS-tampão de carregamento Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octil β -D-glicopiranosídeo | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosil Diacliglicerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | fazer solução de estoque em clorofórmio |
| Digalactosil Diacilglicerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | fazer solução de estoque em clorofórmio |
| Sulfoquinovosil Diacilglicerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | fazer solução de estoque em clorofórmio |
| L-alfa-Fosfatidilglicerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | fazer solução de estoque em clorofórmio |
| L-&alfa;-Fosfatidilcolina | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | fazer solução de estoque em banho de sonicador de clorofórmio |
| S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extrusora | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Membrana de policarbonato Nuleopore | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| membrana de diálise Visking 14 kDa corte ROTH | (carlroth.com) | 0653.1 | ferva em água destilada antes |
| de usar Biobeads SM2 Adsorvente | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| copolímero de epicloridrina de sacarose - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| (2.7 mL) para TFT 80.4 | Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| material listado em ordem de aparição | Para obter instruções de segurança específicas, consulte as fichas de segurança do material e os respectivos manuais. O material e as substâncias de laboratório padrão não estão listados. |
Referências
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B.
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Reimpressões e permissões
