Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.
Artigo de método
Este protocolo descreve uma técnica usando splenocytes rato para descobrir padrões moleculares associados patógeno que alteram a expressão de gene do relógio molecular.
De comportamento de expressão gênica, ritmos circadianos regulam quase todos os aspectos da fisiologia. Aqui, apresentamos uma metodologia para desafiar splenocytes de rato com o lipopolissacarídeo (PAMPs) de padrões moleculares associados patógeno (LPS), ODN1826 e calor-matou Listeria monocytogenes e examinar seu efeito sobre o molecular circadian pulso de disparo. Anteriormente, estudos têm focado a analisar a influência dos LPS do relógio molecular, usando uma variedade de abordagens in vivo e ex vivo de uma variedade de modelos (por exemplo, rato, rato e humanos). Este protocolo descreve a isolação e o desafio de splenocytes, bem como a metodologia para avaliar a expressão de gene de relógio pós-desafio através de PCR quantitativo. Esta abordagem pode ser usada para avaliar não só a influência de componentes microbianos do relógio molecular mas também outras moléculas que podem alterar a expressão do relógio. Esta abordagem poderia ser utilizada para arreliar distante o mecanismo molecular de como interação de PAMP-Toll-like receptor influencia a expressão do relógio.
O pulso de disparo mestre em mamíferos, que coordena as oscilações de 24h para quase todos os aspectos da fisiologia e comportamento, está localizado dentro do núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo1,2. Além de processos biológicos a nível de regulação, o pulso de disparo mestre também sincroniza periféricos relógios celulares em todo o corpo,3,4,5. Enquanto as máquinas de relógio molecular consiste de pelo menos três loops de feedback transcriptional-translacional interligadas, o núcleo é composto do período....
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Durante o estudo, tratamento e cuidados com animais cumprido com a política do National Institutes of Health, estavam em conformidade com as orientações institucionais e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal institucional Animal Universidade de Hartford.
1. o arrastamento de animais
Nota: Vinte semanas masculino B6129SF2/J os ratos são usados no estudo.
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Os ratos foram sacrificados em ZT13, splenocytes foram isoladas e desafiou ex vivo com o LPS PAMPs, ODN1826 ou HKLM. Depois de 3 h, RNA foi isolado, e qPCR foi usada para avaliar os níveis de expressão relativa dos genes relógio molecular relógio, Per2, Dbp e Rev-erbα em comparação com células de controle sem contestação. Após o desafio PAMP, níveis de expressão de relógio não foram significativamente diferentes do que a expressão nas .......
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Neste protocolo, um espectrofotômetro microvolume pode ser usado para quantificar e avaliar a pureza do RNA sendo usado para determinar a expressão do gene. Ácidos nucleicos absorvem UV luz em 260 nm, proteínas normalmente absorvem luz em 280 nm, enquanto outros contaminantes potenciais usados durante um procedimento de extração de RNA (por exemplo, fenol) são detectáveis em 230 nm. Portanto, avaliando a absorvância (A) relação em 260/280 nm (RNA à proteína) e 260/230 nm (RNA de contaminantes não proteico) a qua.......
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O autor não tem nada para divulgar.
Este trabalho foi apoiado pela pesquisa de faculdade concede do escritório da faculdade de artes e Ciências do reitor na Universidade de Hartford.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas foscas | Fisher | 12-550-343 | |
| Filtros de células | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolissacarídeo | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 ou 74106 | |
| Conjunto DNase livre de RNase | Qiagen | 79254 | |
| Placa de cultura de células de 6 poços | Denville | T1006 | |
| Tubos de 50 mL | Corning | 352070 | |
| Tubos de 15 mL | Corning | 352097 | |
| Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Ensaios de expressão gênica b-actina | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| Ensaios de expressão gênica TaqMan Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| Ensaios de expressão gênica TaqMan Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| Ensaios de expressão gênica TaqMan Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| máquina de qPCR StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços (0,1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Software de Análise Estatística | Prism 7.0a |
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