Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus girinos constituem um excelente modelo animal para estudar a função normal do sistema nervoso. Transparência, um genoma completamente sequenciado^1,2e acessibilidade às técnicas cirúrgicas, eletrofisiológicas e de imagem são propriedades exclusivas de Xenopus larvas que permitem investigar funções neuronais in vivo³ . Algumas das várias possibilidades experimentais deste modelo animal são ilustradas pelos estudos aprofundados realizados em girino sistemas sensorial e motor^4,5,6. Um circuito neuronal particularmente bem adaptado para estudar muitos aspectos do processamento no nível das sinapses de informações é o girino de Xenopus sistema olfativo⁷. Em primeiro lugar, sua conectividade sináptica é bem definida: neurônios olfactory do receptor (ORNs) projeto para o bulbo olfactório e estabelecer contatos sinápticos com dendritos de células mitral/adornou dentro glomérulos para gerar mapas de odor. Em segundo lugar, suas ORNs são continuamente gerados pelo neurogênese durante toda a vida para manter a funcionalidade dos caminhos olfativos⁸. E em terceiro lugar, porque o sistema olfativo mostra uma grande capacidade regenerativa, os girinos Xenopus são capazes de reformar inteiramente seu bulbo olfatório após ablação⁹.

Neste trabalho, descrevemos a abordagens que combinam imagens de glomérulos olfativos em girinos vivos com experimentos comportamentais para estudar a funcionalidade das vias olfativas. Os métodos detalhados aqui foram usados para estudar a recuperação funcional de conectividade glomerular no bulbo olfatório depois de transecção do nervo olfatório¹⁰. Dados obtidos em girinos Xenopus são representativos dos vertebrados desde processamento olfativo é evolutivo conservada.

Os métodos descritos são exemplificados usando X. tropicalis , mas eles podem ser facilmente implementados em X. laevis. Apesar do maior tamanho de adulto X. laevis, ambas as espécies são notavelmente semelhantes durante a fase de girino. As principais diferenças residem no nível do genoma. X. laevis exibe pobre rastreabilidade genética, determinada principalmente pelo seu genoma allotetraploid e tempo de geração longo (aproximadamente 1 ano). Em contraste, x. tropicalis é mais passível de modificações genéticas, devido ao seu menor tempo de geração (5-8 meses) e o genoma diploide. Os experimentos representativos são ilustrados por animais selvagem-tipo e três diferentes linhas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).

As metodologias descritas no trabalho atual devem ser consideradas juntamente com a genética avança no campo Xenopus . A simplicidade e a fácil implementação das técnicas apresentadas torna particularmente útil para avaliar mutantes já descrito¹¹, bem como linhas de Xenopus geradas pelo CRISPR-Cas9 tecnologia¹². Também descrevemos um procedimento cirúrgico utilizado para transecto nervos olfativos que podem ser implementados em qualquer laboratório tendo acesso para girinos de Xenopus . As abordagens utilizadas para avaliar as respostas de cálcio pré-sináptica e comportamento olfativo guiadas exigem equipamentos específicos, embora disponível a um custo moderado. Metodologias são apresentadas em uma forma simples de promover seu uso em grupos de pesquisa e poderiam definir as bases dos ensaios mais complexos implementando melhorias ou pela associação a outras técnicas, ou seja,, abordagens histológicas ou genéticas.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa animal na Universidade de Barcelona.

Nota: Girinos de X. tropicalis e X. laevis são criados de acordo com os métodos padrão^13,14. Água de girino é preparada pela adição de sais comerciais (ver Tabela de materiais) para água obtida por osmose reversa. Condutividade é ajustada para ∼700 µS e ∼1, 400 µS para girinos de X. tropicalis e X. laevis , respectivamente. As larvas podem ser obtidas através de acasalamento natural ou fertilização in vitro,¹⁴. Os embriões são dejellied com 2% de que l-cisteína preparado em 0.1 x Marc modificado Ringers (MMR). 1 x MMR contém (em mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO₄, 2 CaCl₂, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. As larvas são transferidas após 2 – 3 dias (fase 25) para tanques de 2 L com água de girino. Quando os girinos chegarem fase 40 dos critérios Nieuwkoop-Faber (NF)¹⁵, eles são colocados em tanques de 5 L e mantidos em uma densidade de 10 animais/L. temperatura é mantida constante a 23 – 25 ° C e 18 – 20 ° C para X. tropicalis e X. laevis girinos, respectivamente. Os animais encontrados em fases 48 – 52 dos critérios NF são utilizados para experimentos.

1. a transecção dos nervos olfativos

1. Preparar uma solução de anestésica de 0.02% MS-222 em 50 mL de água de girino à temperatura ambiente.
2. Prepare um pequeno tanque (1-2 L) com girino água para permitir a recuperação dos animais após a cirurgia.
3. Corte em pedaços retangulares de papel de filtro qualitativo da celulose (4 cm x 3 cm, consulte Tabela de materiais).
4. Molhar 2 pedaços de papel de filtro qualitativo celulose em 0,02% MS-222 solução e colocá-los no âmbito de dissecação.
5. Escolher um girino do tanque e mergulhá-lo na solução de anestésico. O animal para de nadar dentro de 2 – 4 min e não reage a estímulos mecânicos aplicados a nível de cauda usando uma pinça.
6. Coloque os pedaços retangulares de papel de filtro, o girino anestesiado. Posicione o animal com seu lado dorsal virado para cima, para que estruturas cerebrais podem ser visualizadas.
   1. Usando a tesoura vannas (ver Tabela de materiais), corte um ou ambos os nervos olfativos (dependendo do tipo de ensaio a ser realizado). Transecto de um único nervo para experimentos que exigem um controle interno de lesão do nervo.
   2. Para experimentos comportamentais, transecto ambos os nervos para suprimir todas as informações de odorante chegam ao bulbo olfactory. A eficiência do corte dos nervos olfativos pode ser facilmente observada sob o escopo de dissecação; no entanto, posição de pigmentação ou animal pode ser fatores limitantes.
      Nota: (Opcional) A melhor maneira de certificar a validade do procedimento é usar transgênicos girinos que expressam fluorescentes repórteres em seu sistema nervoso (ver resultados representativos). Para este objectivo, é necessário usar um escopo de dissecação equipado com fluorescência (Figura 1). Se apenas animais selvagem-tipo estão disponíveis, o rastreamento com CM-diI pode ser empregado. Segui o protocolo 2 (veja abaixo) para injetar uma solução de 0,5 mg/mL de CM-diI preparado em 0,3 M de sacarose na cápsula nasal. Ver ¹⁶ para obter detalhes sobre a preparação e armazenamento de CM-diI. Vazamento de tinta fora da cavidade principal deve ser minimizar. Para este objectivo, é necessário alterar a pressão de injeção e a abertura de micropipetas. Fluorescência no nível da camada glomerular do bulbo olfatório torna-se óbvio 24 h após aplicação do CM-diI. O presente trabalho utiliza a rotulagem com CM-diI só para certificar o procedimento de transecção; no entanto, esse método também pode ser usado para obter informações morfológicas dos glomérulos olfativos usando procedimentos histológicos convencionais.
7. Transferi os animais para o tanque de recuperação. Girinos devem recuperar natação normal dentro de ~ 10 min realizar uma inspeção cuidadosa para a presença de hemorragia, que são esperados em ~ 1% dos animais submetida a cirurgia.
8. Eutanásia em animais feridos em uma solução de MS-222 de 0,2%.

2. rotulagem de neurônios Olfactory do Receptor com indicadores de cálcio fluorescente

1. Preparar uma solução contendo 12% cálcio verde-1-dextrano (ver Tabela de materiais), 0,1% Triton X-100 e 1 mM de NaCl¹⁷. Armazene a solução a-20 ° C ou a-80 ° C, se não é para ser usado dentro de um mês.
2. Prepare-se para microinjection usando um extrator de micropipeta pipetas de vidro com ponta aberturas ~ 1-2 µm (diâmetro similar para microeletrodos usado para experiências de remendo-braçadeira) (ver Tabela de materiais).
3. Calibre o volume de microinjeções. Usando água destilada, ajustar o tempo de injeção e pressão para obter volumes de injeção de 0,15-0,3 µ l.
   Nota: Um procedimento simples consiste na contagem do número de pulsos necessários para esvaziar uma pipeta cheia de 1 µ l de água. Parâmetros típicos são uma pressão de 30 psi e 50 ms tempo de injeção.
4. Coloque uma pipeta no microinjector e carregá-lo com ~ 2 µ l da solução de dextran verde-1 de cálcio.
5. Prepare um girino seguindo passos 1.1 a 1.6.
6. Mova a ponta da pipeta na cavidade principal da cápsula nasal.
   Nota: Consulte a Figura 2A , descrevendo a localização das vias olfativas um girino Xenopus.
7. Usando configurações obtidas no ponto 2.3, entrega um par de sopros. Restringir a presença do corante da cápsula nasal.
8. Deixe o girino descansar por 2-3 min. com uma pipeta Pasteur, despeje gotas de solução de MS-222 0,02% nas partes mais caudais do animal para evitar a secagem.
9. Transferi o animal para o tanque de recuperação.
   Nota: Ele deve recuperar natação normal dentro de ~ 10 min. manipulação dos animais pode causar ferimentos.
10. Eutanásia em girinos que não recuperar natação normal comportamento 15 min após a injeção usando uma solução de MS-222 de 0,2%.
11. Observe a fluorescência no nível da camada glomerular do bulbo olfatório no dia após a injeção.

3. preparação dos girinos para geração de imagens ao vivo das respostas pré-sináptica

1. 24 – 48 h antes de realizar o experimento, casaco 4 – 6 caixas de Petri de 35 mm de diâmetro com elastómero de silicone (por exemplo, Sylgard). Uma vez que o elastômero tem polimerizado, fabrica um poço Retangular para caber o girino.
   Nota: Dimensões típicas para girinos de X. tropicalis encontrados em fases NF 48 – 52 são 10 x 4 mm.
2. Prepare 100 mL de um 160 µM a solução de ácido aminado 1mm agindo como um estímulo de odorante para girinos. A solução pode conter uma mistura de vários aminoácidos: metionina, leucina, histidina, arginina e lisina. Diluir os aminoácidos em solução de Ringer Xenopus , composta por (em mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl₂, 2 MgCl₂, glicose 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Certifique-se de que o pH é mantido em 7,8.
3. Encha um reservatório elevado com 20 mL da solução de ácido aminado. Conecte o reservatório com polietileno tubos para um tubo capilar de 28 G (ver Tabela de materiais) colocado acima da cápsula nasal.
   Nota: O tubo capilar é montado sobre um micromanipulador (ver Tabela de materiais). Bolhas de ar devem estar ausentes do sistema de perfusão.
4. Conseguir a precisão temporal em aplicar a solução de ácido aminado usando o transistor-transistor logic (TTL) controle das válvulas de solenoide pitada (ver Tabela de materiais). Um estimulador é usado para gerar pulsos TTL (ver Tabela de materiais). Verificar a precisão temporal para entregar a solução de odorante, alterando a duração de pulsos TTL, i.., 0,1 a 1 s.
5. Encha o reservatório elevado outra com 100 mL de solução de Ringer Xenopus .
6. Anestesiar um girino e colocá-lo no âmbito de dissecação (passos 1.1 a 1.6).
7. Prepare-se para a imagem latente um girino. Se os girinos albinos estão disponíveis avance para o passo 3.9, caso contrário, retire a pele acima do bulbo olfatório porque ele contém melanócitos que afectar a imagem (passo 3.8).
   Nota: Existem duas maneiras de realizar o experimento dependendo da pigmentação do animal. É preferível usar animais albinos. Cepas de Albino estão disponíveis para X. laevis e linhas de X. tropicalis albino recentemente foram geradas pelo CRISPR-Cas9 ¹² ou TALENs¹⁸.
8. Usando uma tesoura vannas, faça uma incisão lateral na pele girino na borda do sistema nervoso central. Faça o corte deve ser feita a nível do bulbo olfatório e nunca alcançando a posição de tectum, que pode ser facilmente identificada pela localização do nervo óptico.
9. Beliscar a pele corte usando uma pinça e puxe-o sobre o sistema nervoso. Verifique se a remoção bem sucedida pela ausência de melanócitos acima do bulbo olfatório. Manter o animal úmido, derramando gotas de solução de MS-222 de 0,02% com uma pipeta Pasteur.
10. Coloque o girino dentro do poço do prato revestido (ver Tabela de materiais). Coloca uma lamela de vidro revestida com graxa de vácuo elevada acima do animal. Posicione a lamela para cobrir a parte superior do tectum à extremidade da cauda.
11. Certifique-se de que o bulbo olfatório e placoides permanecem expostos ao meio extracelular. Manter o girino imóvel durante a imagem latente. Encher o prato de Petri com tubocurarina µM Xenopus Ringer solutioncontaining 100 (consulte Tabela de materiais) para evitar as contrações musculares.
    Nota: Tubocurarina é armazenada em alíquotas a-80 ° C não é mais do que 6 meses.
12. Coloque o prato segurando o girino sob um microscópio vertical. Conecte o reservatório contendo solução de Ringer Xenopus com o prato usando tubos de polietileno (ver Tabela de materiais) para perfusão contínua de solução de Ringer Xenopus para manter o animal vivo para > 1 h.
    Nota: Mini grampos magnéticos (ver Tabela de materiais) são muito úteis para estàvel Conecte o tubo ao prato. Tubos de sucção e perfusão devem estar localizados no ângulo ~ 180°.
13. Comece a perfusing solução de Ringer Xenopus . Manter o nível da solução em constante durante todo o experimento do prato. Continuamente avalie a viabilidade de girino, observando a circulação de sangue através dos vasos.

4. viver por imagem da pré-sináptica Ca^{2 +} alterações em glomérulos olfativos

Nota: O procedimento da imagem latente é descrito para a microscopia de campo amplo, mas pode ser facilmente adaptado a um microscópio confocal, ajustando as configurações de aquisição. Imagem latente deve efectuar-se em um microscópio vertical montado sobre uma mesa de antivibração.

1. Visualizar o girino com um objetivo de ampliação baixa, por exemplo, 5 x.
2. Mova os eixos micromanipulador para colocar o capilar, entregando a solução odorante no topo de uma cápsula nasal, formando um ângulo de 90 ° com o nervo olfativo. O fluxo da solução odorant acima do bulbo olfatório deve ser evitado porque pode causar turbulências que distorcem a imagem.
3. Encontrar o bulbo olfatório, localizado ipsilaterally da cápsula nasal (sujeito a estimulação) usando uma alta ampliação, distância de trabalho longa, objectivo de imersão de água: 60Xx, 0,9 N.A.
4. Verificar a emissão de fluorescência pelo olho. Estruturas glomerulares devem ser óbvio (Figura 2B).
5. Realize a aquisição ao vivo com uma câmera apropriada para a imagem latente de cálcio. Defina uma caixa contendo o bulbo olfativo inteiro, normalmente de 256 x 256 ou 512 x 512 pixels. Conjunto a aquisição de taxa de quadro de aquisição de 20 – 40 Hz. ajustar o ganho, para que os valores de fluorescência basal são ~ 20% de saturação. Adquira um vídeo s 5.
6. Visualize o filme. Verifica o foco da imagem, a ausência de artefatos de movimento e regiões que contêm pixels saturados. Valores de fluorescência típica das regiões glomerulares devem ser de 20.000 – 5.000 u.a., se usando uma câmera de 16 bits. Prossiga para a etapa seguinte se imagem as condições forem ideais. Repita a etapa 4.6 se necessário para melhorar a qualidade da imagem ou ajustar as configurações de ganho.
7. Começa uma aquisição de lapso de tempo para gravar respostas evocadas por estímulos olfactory.
   Nota: Aplicação precisa da solução odorant é controlada por estímulos TTL. Um experimento típico contém um período inicial de 4 s, seguido de estimulação vezes variando de 0,1 a 0,5 s e um período de recuperação de 6 a 10 s.
8. Realizar estimulações repetitivas de odorantes para intervalos de tempo > 2 min. definir a taxa de fluxo de 1-1.5 mL·min^-1. Desde que a perfusão global está no durante todos os experimentos, localmente aplicados aminoácidos são lavados para fora.
   Nota: O volume de solução no prato é ~ 3 mL.
9. Análise de imagem
   1. Deteção de respostas
      1. Exporte filmes para ImageJ.
         Nota: O objetivo é detectar a presença de regiões glomerulares, respondendo a estímulos.
      2. Transforme a sequência primas de imagens de fluorescência para um filme de₀ ΔF/F. Medir as mudanças relativas na fluorescência basal de acordo com a seguinte relação: (F-F₀) f₀, onde F₀ indica basais de fluorescência.
      3. Desenhar as regiões de interesse (ROI) em torno das áreas apresentando fluorescência putativo aumenta durante a estimulação e gravar a sua posição no Gerenciador de ROI(Figura 2). Desenhe um ROI para detectar níveis de fluorescência de fundo em uma área desprovida de estruturas glomerulares.
   2. Quantificação das respostas.
      1. Coloque o ROIs definido na sequência cru de imagens de fluorescência. Obter o valor de cinza médio de ROIs selecionados para cada quadro. A sequência dos valores obtidos para um programa de análise de transferência (por exemplo., Igor Pro).
      2. Subtrair a fluorescência de fundo e em seguida, calcular as mudanças de₀ ΔF/F para cada ROI (Figura 2F). Traça os aumentos em ΔF/F₀ para cada um do ROIs selecionado. Calcule o desvio padrão de ΔF basal/F₀ (antes de estimulação).
         Nota: Uma resposta positiva é considerada se aumenta em ΔF/F₀ obtidos durante estimulação são maiores do que 2 desvios-padrão dos valores basais.

5. ensaio de comportamento olfativo-guiado

Nota: Um diagrama esquemático da configuração para a realização do ensaio é mostrado na Figura 3.

1. Fazer pequenos furos para encaixar o tubo de 1,14 mm ID OD x 1,57 mm na parte superior de cada poço de um prato de 6-poços. Inserir o tubo e selar usando um adesivo epóxi (ver Tabela de materiais).
   Nota: O prato modificado possa ser reutilizado muitas vezes, após a lavagem exaustiva com água destilada.
2. Prepare-se 50 mL de uma solução de aminoácido metionina, leucina, histidina, arginina e lisina (consulte a etapa 3.2 para detalhes). As concentrações podem variar de 160 µM a 1 mM. Coloca 20 mL da solução em um reservatório elevado.
3. Não alimente os girinos pelo menos 12 h antes do ensaio. Pegue 6 girinos de seu tanque de habitação e colocá-los em 2 L de água limpa girino para minimizar a exposição a odores.
4. Coloque o prato de 6 poços modificados em um LED branco-transiluminador (Figura 3).
5. Casal das entradas de perfusão para o reservatório que contém a solução de ácido aminado usando um tubo colector (ver Tabela de materiais). Verificar o sistema de perfusão e eliminar as bolhas de ar. Preencha os 6 poços simultaneamente. Ajustar a altura do reservatório para permitir a entrega de ≥ 5 mL da solução de odorante dentro de ~ 30 s.
   Nota: Cada um bem 4 vezes com água bidestilada lave após a exposição à solução odorante.
6. Encha cada um com 10 mL de água de girino. Coloque 1 girino/bem. Deixe descansar por > 3 min.
7. Configure a aquisição de imagens. Use uma câmera CCD convencional que pode adquirir imagens em ≥ 5 Hz. conecta a câmera a um computador. Aqui, use uma câmera de Zeiss MRC5 controlada pelo software de Zen, mas outras configurações equivalentes podem ser usadas. Se for necessário aumentar a taxa de quadros, aplica pixel binning. Imagens devem mostrar o prato inteiro 6-poços.
8. Começar a aquisição de imagens que contêm filmes basal (30 s), estímulo (25 – 35 s) e períodos de recuperação (30-60 s).
9. Animais retorno do prato 6 poços para tanques após a imagem.
10. Analise filmes no ImageJ usando plugins como wrMTrck^19,20 que fornecem vários parâmetros associados à motilidade.
11. Para preparar imagens para análise, primeiro selecione um poço desenhando um ROI retangular de 35 x 35 mm(Figura 4). Obter uma imagem de fundo, calculando-se a projeção máxima de toda a sequência. Ele deve exibir uma imagem do bem sem o girino.
12. Subtrai a projeção máxima do filme cru. Executar limiarização no filme 32 bits gerado e aplicar o plugin wrMTrck. Ajuste os parâmetros de WrMTrck para confiantemente controlar movimentos de animais. Transferir o obtidas coordenadas X, Y em um programa de análise.
13. Coordenadas X-Y utilizando, calcular a distância euclidiana para a fonte de odorante (entrada de perfusão no poço), aplicando-se a seguinte equação:
    
    onde so indica a posição da fonte de odor e tad indica a posição de girino, em um determinado momento. Consulte a Figura 4para obter detalhes .

Neste trabalho, apresentamos uma combinação das duas abordagens complementares para executar na vivo estudo da funcionalidade do sistema olfativo Xenopus girino: eu) um método de imagem pré-sináptica Ca2 + altera em glomérulos de viver girinos usando um indicador fluorescente de cálcio e ii) um odor guiada ensaio comportamental que pode ser usado para investigar a resposta ao específico odorantes transmitidas pela água. Desde que estas abordagens têm sido utilizadas para avaliar a recuperação do processamento olfativa após lesão10, um método simples para cruza os nervos olfativos também é descrito.

Transecção de caminhos olfativos em Xenopus girinos
Há duas maneiras para certificar a validade do procedimento. Ambos dependem da visualização dos nervos olfativos usando repórteres fluorescentes. Um método é baseado em girinos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em seu sistema nervoso. Duas linhas recomendadas que expressam GFP sob um promotor neuronal β-tubulina são X. laevis tubb2b-GFP e X. tropicalis NBT-GFP (Figura 1, ver Tabela de materiais). Se apenas animais selvagem-tipo estão disponíveis, CM-diI pode ser usado (ver passo 1.8). A Figura 1 mostra imagens de girinos de X. laevis de tubb2-GFP. Imagens são de quatro animais diferentes, onde um único nervo olfatório foi seccionado. O corte deve ser óbvio no âmbito de dissecação. A vantagem de usar linhas transgénicas é que a reforma do nervo olfatório pode ser seguida por um período de tempo. Quando se faz observações sequenciais, é recomendável para minimizar a exposição à luz fluorescente para evitar Fotodano. Corte de um único nervo olfatório é útil quando um controle interno é necessário, como, por exemplo, para comparar unidades glomerular normalmente desenvolvidos vs religados. Seccionamento de ambos os nervos olfativos deve ser aplicada quando o objetivo é completamente suprimindo a transmissão de informações.

Viver a imagem latente de pré-sináptica respostas aos estímulos olfativos
A rotulagem correta do ORNs com dextran verde-1 de cálcio pode ser observada a nível do bulbo olfatório (Figura 2A) usando microscopia widefield. Glomérulos são óbvias (Figura 2B) e devem aparecer distribuídos em diferentes camadas, movendo o plano de foco. A morfologia das estruturas glomerulares pode ser melhor resolvida se um microscópio confocal é usado em vez disso (Figura 2C). O número de glomérulos rotulados depende de absorção de corante no nível do epitélio olfatório. Portanto, este procedimento não permite a visualização de todas as unidades glomerulares. Animais, apresentando uma coloração mais intensa de fluorescência da região glomerular devem ser selecionados antes de realizar experimentos de imagem, desde que eles contêm mais ORNs rotulados. Esta manobra é altamente recomendada para aumentar a taxa de transferência experimental e deve ser realizada sob um escopo dissecar equipado com uma lâmpada de fluorescência. Rejeite os animais que não apresentem unidades glomerulares rotuladas ou que mostrar fluorescência restringida a áreas específicas da camada glomerular. Pré-sináptica Ca 2 + respostas podem ser observadas logo que 1 dia após o carregamento de tinta. Para a realização de experimentos de imagem é desejável usar objectivos da abertura numérica elevada, tipicamente ≥0.9.

Aumentos dos níveis de cálcio pré-sináptica podem ser evocados expondo dendríticas botões de ORNs de aminoácidos. É importante posicionar o capilar, entregando a solução odorant acima a cápsula nasal. Deve ter cuidado para evitar o contato, porque isso poderia obstruir a ponta do capilar e/ou causar estimulação mecânica de ORNs. Aumentos transitórios nos níveis de cálcio pré-sináptica podem ser observados por estímulos ≥0.1 s (Figura 2D) e são indicativos de uma correta transdução olfativa. Também é importante Visualizar os níveis de cálcio basal com câmera de baixo ganho. Pré-sináptica terminais de ORNs exibir alta fluorescente aumenta e é essencial para evitar a saturação do sinal. Alta resolução temporal pode ser conseguida com widefield microscopia. Por exemplo, usando uma câmera CCD multiplicado por elétrons, é possível atingir taxas de quadros de 50 Hz ou superior. Uso da microscopia confocal reduz a resolução temporal, mas permite uma melhor definição das estruturas glomerulares.

A alta afinidade de cálcio verde para ligação de cálcio (190 nM) é particularmente útil para detectar pequenas respostas. Aumentos transitórios de cálcio intracelular detectados na camada glomerular são variáveis. Algumas regiões glomerulares mostram alterações no ΔF/F0 ≥0.2, enquanto processos vizinhos poderá não responder mesmo (Figura 2D). Os seguintes fatores contribuem para a variabilidade da resposta das unidades glomerulares: i) o número total de glomérulos rotulados, ii) a concentração intracelular de cálcio verde e iii) a selectividade de ORNs para detectar aminoácidos. Desde que um número muito baixo de glomérulos rotulados pode impedir observando as respostas, é absolutamente necessário realizar estas experiências com animais que contenha muitos rotulado ORNs quanto possível.

Comportamento olfativo-interativa
Análise de dados
Comportamento olfativo-interativa é estudado usando um sistema custom-built. A Figura 3 mostra um desenho esquemático do equipamento utilizado para realizar o ensaio. O teste é baseado na capacidade de girinos para detectar a presença de aminoácidos, que atuam como odorantes. Uma solução que combina cinco diferentes aminoácidos (metionina, leucina, histidina, arginina e lisina) é usada para estimulação. A solução é entregue localmente durante 30 s para uma 35mm bem contendo um girino livres. A resposta imediata de girinos para a solução de entrada é um aumento da mobilidade. Movimentos aleatórios que ocorram durante o s ∼5 – 10 inicial do aplicativo de solução são seguidos por um mergulho direto para a fonte de odores. Girinos permanecem por vários segundos, nas proximidades do bico durante a entrega de aminoácidos e recuperar gradualmente a motilidade em direções aleatórias (veja complementar vídeos 1, 2).

Condições experimentais descritas permitem a natação normal das fases de girinos X. tropicalis 48-52; no entanto, deve ser levado em conta que a motilidade dos animais maiores pode ser restringida em poços de 35 mm. Girino movimentos são gravados com uma câmera CCD. Atração para a solução de odorante pode ser detectada como uma redução da distância euclidiana separar entrada de perfusão de posição girino (Figura 4). Acompanhamento das posições de cabeça girino dentro de uma área de 35 x 35 mm (ou o equivalente tamanho em pixels) permite a obtenção de uma análise quantitativa do comportamento olfativo guiadas(Figura 4). Parcelas individuais dos movimentos de girino são construídas usando as coordenadas X-Y, obtidas por análise de imagem (Figura 4B). As parcelas de motilidade extraído devem reproduzir fielmente a imagens de vídeo.

Existem dois métodos possíveis de interpretar experimentos de comportamento olfativo-interativa. A primeira abordagem é inspirada em um estudo anterior usando zebrafishes21. Medição do tempo gasto nas proximidades do bico entregando odorantes evidencia a presença de um tropismo positivo. Uma região de interesse de 8,75 mm de raio (correspondente a ¼ do diâmetro do bem) centrado sobre a entrada da solução que é usado para classificar a proximidade dos animais para a fonte de odorante (Figura 4A, 4C). Binning o tempo despendido pelos girinos nas proximidades do bico durante os períodos definidos, ou seja, 15 intervalos de s, permite identificar a capacidade de detectar soluções de aminoácidos (Figura 4-D). O comportamento global de uma população de girinos pode ser obtido através da representação gráfica da distribuição dos dados individuais (Figura 5A). Um tropismo positivo pode ser detectado quando a solução de metionina, leucina, histidina, arginina e lisina é preparada no 1 mM ou 160 μM (Figura 5A e 5B). Os animais não respondem à aplicação de água (Figura 5(C), assim, descartando a participação de mecanismos mechanosensitive. Teste de diferenças entre tempo intervalos definidos em cada grupo experimental podem ser estabelecidos usando não paramétricas medidas repetidas ANOVA com comparações múltiplas de Dunn. A desvantagem de binning dados em intervalos de tempo de 15 s é uma resolução temporal reduzida.

Uma maneira de aumentar a informação temporal da resposta comportamental é fazendo médias parcelas de distâncias euclidianas da fonte de odor. Embora os movimentos de girino mostram uma variabilidade intrínseca, a motilidade média de uma população de animais (normalmente ≥ 40) mostra o comportamento olfativo-interativa. Para realizar esta análise é necessário posições animais do grupo antes do início da estimulação. Desde que os girinos são encontrados em locais diferentes, quando a solução de odorante entra no poço é necessário para definir a distância euclidiana para 0 antes de estimulação (Figura 6A, consulte também os critérios de inclusão na Figura 7). Valores negativos e positivos, portanto, indicam uma atração ou uma repulsão da fonte de odor, respectivamente. Uma atração para odores é bem descrita por um ajuste linear com ≥0.9 de coeficientes de regressão. Se a água é entregue, as alterações líquidas de distância euclidiana são distribuídas em torno de 0... e não é possível encaixar uma linha durante a estimulação de odorante, indicando assim a ausência de um comportamento olfativo guiadas (Figura 6B). Comparação de parcelas médias de distâncias euclidianas para soluções de ácido aminado preparadas em 1 mM e 160 µM sugerem diferentes atrasos na resposta olfativa guiadas (comparar figura 6A e C). O intervalo de tempo necessário para iniciar o movimento em direção a fonte de odores é menor quando os aminoácidos são aplicados em uma maior concentração. A falta de comportamento olfativo guiadas é observada em girinos com ambos os nervos olfativos seccionados (Figura 6D).

Uma limitação do ensaio comportamental olfativo guiadas descrito é o estabelecimento de plumas de fluidos complexos. Isto pode ser visto se a solução de aminoácido é substituída por um corante, tais como Fast Green, ao configurar o sistema. O uso de soluções coloridas verifica a formação de plumas e mostra que fluvial odorantes atingir qualquer região do poço dentro de 5 s. turbulências causadas pela entrega da solução provavelmente é detectada pela linha lateral de girinos e provavelmente contribuem para a variabilidade observada na mobilidade do animal, mas não interferem com o comportamento guiado olfativo. Controle de experiências realizadas com o uso de água em vez de soluções de ácido aminado revelam que os girinos são capazes de discriminar olfativa de estímulos mecânicos. A estimativa de tempo gasto em uma região de interesse (Figura 5) e o enredo médio da distância euclidiana (Figura 6) são dois métodos complementares para descrever a resposta olfativa guiadas de girinos.

Critérios de inclusão
Critérios de inclusão também devem ser levados em consideração para análise de dados. Alguns girinos mostram um movimento ressonante, que é ilustrado por meio da montagem da trama da distância euclidiana para uma função sinusoidal (Figura 7A). Girinos exibindo esse comportamento devem ser descartados de todas as análises.

A exclusão dos animais que, no início da aplicação das soluções de odorante, são no máximo (> 30 mm Figura 7B) ou uma mínima distância euclidiana (< 5mm, Figura 7C) do bocal permite diminuir a variabilidade dos lotes de médios. O exemplo ilustrado na Figura 7B mostra um tropismo positivo para a solução de aminoácido. O girino está localizado a uma distância máxima de entrada de solução no início da estimulação. Portanto, esta posição relativa só pode revelar uma atração para a fonte de odor. Figura 7 C mostra a situação oposta. Aqui, um girino está localizado nas proximidades do bocal, oferecendo a solução de aminoácido. Quantificação do tempo gasto perto da fonte de odor mostra uma resposta (método usado na Figura 5); no entanto, ele não pode mostrar um movimento líquido em direção a entrada.

Em resumo, o ensaio proposto de comportamento olfativo guiadas define um teste binário. Esse método pode ser usado para detectar a capacidade de um grupo experimental de girinos de responder a odorantes. Mais melhorias são necessárias se o objectivo é estabelecer diferenças entre respostas complexas olfativo-interativa, como por exemplo, determinar as preferências para dada odores.

Figura 1: Transecção dos nervos olfativos. Imagens representativas de girinos de X. laevis de tubb2-GFP obtidos após a transecção de um único nervo olfatório (setas). Nervos de girinos tubb2-GFP exibem forte fluorescência. Transecção do nervo é óbvia imediatamente após a cirurgia (D0). Regeneração do nervo olfatório é evidentes 4 dias após o corte (D4). Oito dias após a cirurgia (D8) lá é pouca diferença entre controle e nervos reformados. Os girinos foram anestesiados em 0,02% MS-222 para coletar imagens. Bulbo olfatório (obstetra), nervo olfatório (O.N.), cápsula nasal (N.C.), tectum (Tec), nervo óptico (Op.N.). As setas indicam a localização do nervo necrosante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Rotulagem de neurônios olfactory do receptor com dextran cálcio verde e visualização do influxo de cálcio pré-sináptica após estimulação com aminoácidos. (A) imagem de luz transmitida de um girino, mostrando a localização do epitélio olfatório, os nervos olfativos e a camada glomerular do bulbo olfatório. (B) a imagem de um bulbo olfactory visualizada por microscopia widefield (wf). Os neurônios foram rotulados pela aplicação do dextrano verde-1 de cálcio na cápsula nasal. A fluorescência observada corresponde aos terminais pré-sináptica de neurônios olfactory do receptor formando glomérulos. . N: nervo olfatório; E.L.: bulbo olfatório. (C) seção Confocal localizada dorsalmente a partir da entrada do nervo olfatório ao bulbo. O componente pré-sináptica de glomérulos olfativos foi rotulado usando dextrano verde-1 de cálcio, como em B). (D) terminais pré-sináptica transitoriamente aumentam seus níveis de cálcio após a exposição do epitélio olfatório para uma solução contendo cinco diferentes aminoácidos. Mudanças relativas na fluorescência de cálcio obtidos antes, durante e após a estimulação de s 1. (E) distribuição de 10 diferentes regiões de interesse (ROIs) usado para quantificar as alterações de0 ΔF/F. ROI11 está fora a camada glomerular e é usado para definir níveis de fluorescência. (F) ΔF/F Individual0 respostas para ROIs definidos em mi). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Ensaio de comportamento olfativo guiadas. (A) diagrama esquemático mostrando o equipamento utilizado no ensaio. (B) exemplo de motilidade faixas gravadas mais de 90 s. Cada círculo representa um bem que contém um único animal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Rastreamento de comportamento olfativo guiadas. (A) exemplo mostrando um poço usado para o ensaio comportamental. Azuis linhas pontilhadas indicam o local do X, Y coordenadas (em mm) usado para controlar os movimentos de girino (Veja também complementar vídeo 1). A elipse verde representa a posição de entrada de solução. A linha preta pontilhada indica a área proximal ao tubo de entregar a solução de aminoácido (veja texto para detalhes). (B) motilidade da larva mostrada na) durante o ensaio comportamental. Traços codificados por cores indicam a posição do animal antes (cinza) e após a estimulação olfativa (violeta). Movimentos durante a aplicação da solução odorant são ilustrados em um gradiente de cor temporal (30 s, vermelho para azul). (C) usando o X, Y posições de girino é possível calcular as alterações na distância euclidiana da cabeça de girino para a entrada da perfusão. Distâncias inferiores a 8,75 mm correspondem à área proximal do bocal. (D) parcela do tempo gasto pelos girinos na região definida pela linha pontilhada na). Cada ponto indica um período de 15 s. O animal é atraído pela solução odorante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Girinos são atraídos por aminoácidos. (A) tempo gasto pelos girinos na proximidade da fonte de odor. Cada bin é composto por um período de 15 s. Parcelas de caixa representa a mediana (linha horizontal preta), quartis 25 a 75% (caixas) e intervalos (bigodes) de dados. Entrega de uma solução de ácido aminado 1mm atraiu girinos para a fonte de odor. (B) os girinos foram atraídos pela solução odorant quando a concentração de aminoácidos foi reduzida para 160 μM. (C) fornecimento de água não modificar comportamento animal. Medidas repetidas ANOVA com Dunn o teste de comparações múltiplas, p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Resposta temporal de girinos a odorantes. (A) plotagem da média da distância euclidiana para a fonte de odor em função do tempo. A distância euclidiana foi definida para 0 antes de estimulação em cada traço individual. Valores positivos e negativos indicam uma diminuição e um aumento da distância à fonte de odor, respectivamente. Atração para a fonte do odor pode ser descrita por um ajuste linear (r2= 0,98). (B) fornecimento de água não modifica a distância à fonte de odor. Girinos (C) respondem a aplicação de uma solução de 160 μM de aminoácidos, como revelado por um ajuste linear (r2= 0,96). (D) os girinos com ambos os nervos olfativos seccionados não respondem aos aminoácidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : Critérios de inclusão para o ensaio de comportamento olfativo guiadas. Movimento (A), alguns girinos mostrar um ressonante. Esse comportamento é revelado por ataque bem sucedido de uma função sinusoidal para o enredo da distância euclidiana para a fonte de odor. Girinos exibindo essa atividade devem ser excluídos do teste. (B, C) Uma maneira de reduzir a variabilidade na resposta média temporal de odores (Figura 6) é, excluindo animais localizados no máximo (B) ou uma distância mínima (C) euclidiana no início da estimulação. Linhas pontilhadas vermelhas indicam o valor de limiar (30 mm e 5 mm). A distância euclidiana, antes do início da estimulação (seta, deixada parcelas) é definido como "0" para relatório comportamentos atraentes ou repulsivos como negativo ou positivo valores (certa parcelas), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Video 1: comportamento olfativo guiadas desencadeado pela entrega de uma solução de ácido aminado. O filme mostra um girino nadando livremente um 35 mm bem. A elipse azul indica a posição do bocal de fornecimento da solução de odorante. O início e o fim do estímulo são indicados por pontos verdes e vermelhos, respectivamente. A Figura 4 mostra a análise do comportamento observado. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Suplementares vídeo 2: motilidade girino durante a entrega de água. O filme mostra um girino nadando livremente um 35 mm bem. A elipse azul indica a posição do bocal liberando água MQ. O início e o fim da entrega de água são indicados por pontos verdes e vermelhos, respectivamente. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Os autores não têm nada para divulgar.