Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.
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Artigo de método
Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso. Eles oferecem várias vantagens experimentais, tais como a acessibilidade para inúmeras abordagens de imagem, técnicas eletrofisiológicas e ensaios comportamentais. O sistema olfativo do girino de Xenopus é particularmente adequado para investigar a função das sinapses estabelecido durante o desenvolvimento normal ou reformado após lesão. Aqui, descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas. Nós esboçamos uma combinação de medições in vivo de respostas de cálcio pré-sináptica em glomérulos do bulbo olfatório com ensaios de comportamento olfativo-interativa. Métodos podem ser combinados com a transecção dos nervos olfativos para estudar a religação de conectividade sináptica. Experimentos são apresentados usando animais selvagem-tipo e geneticamente modificados, expressando GFP aos jornalistas em células do sistema nervoso central. Aplicação das abordagens descritas para girinos geneticamente modificados pode ser útil para desvendar as bases moleculares que definem o comportamento de vertebrados.
Introdução
Xenopus girinos constituem um excelente modelo animal para estudar a função normal do sistema nervoso. Transparência, um genoma completamente sequenciado1,2e acessibilidade às técnicas cirúrgicas, eletrofisiológicas e de imagem são propriedades exclusivas de Xenopus larvas que permitem investigar funções neuronais in vivo3 . Algumas das várias possibilidades experimentais deste modelo animal são ilustradas pelos estudos aprofundados realizados em girino sistemas sensorial e motor4,5,
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa animal na Universidade de Barcelona.
Nota: Girinos de X. tropicalis e X. laevis são criados de acordo com os métodos padrão13,14. Água de girino é preparada pela adição de sais comerciais (ver Tabela de materiais) para água obtida por osmose reversa. Condutividade é ajustada para ∼700 µS e ∼1, 400 µS para girinos de X. tropicalis e X. laevis , respectivamente. As larvas podem ser obtidas através de acasalamento natural ou fertilização in vitro....
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Resultados
Neste trabalho, apresentamos uma combinação das duas abordagens complementares para executar na vivo estudo da funcionalidade do sistema olfativo Xenopus girino: eu) um método de imagem pré-sináptica Ca2 + altera em glomérulos de viver girinos usando um indicador fluorescente de cálcio e ii) um odor guiada ensaio comportamental que pode ser usado para investigar a resposta ao específico odorantes transmitidas pela água. Desde que estas abordagens têm sido util.......
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Discussão
Este artigo descreve técnicas que são úteis para investigar a funcionalidade das vias olfativas vivos Xenopus girinos. O protocolo atual é particularmente útil para os laboratórios que trabalham, ou tem acesso a Xenopus; no entanto, também é interessante para aqueles pesquisadores estudando as bases celulares e moleculares de reparação e regeneração neuronal. Resultados obtidos em Xenopus podem ser combinados com dados coletados em outros vertebrados modelos para identificar mecanismos conserva.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por concessões do El Ministerio de Economía y competitividade (MINECO; SAF2015-63568-R) co-financiadas pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), pelo prêmio de pesquisa competitiva do M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, o Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, fundo Laura e Arthur Colwin dotado verão Research Fellowship , a bolsa de Fischbach e o grande fundo de geração do laboratório biológico marinho e o nacional Xenopus recurso RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) onde uma parte deste trabalho foi realizada. Agradecemos também o programa CERCA / Generalitat de Catalunya para apoio institucional. A.L. é um companheiro de Serra Húnt....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sais para aquários (Sal Instantâneo do Oceano) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato) | Pinças Sigma-Aldrich | E10521 | |
| #5 (ponta 0,025 x 0,005 mm) | Instrumentos de Precisão Mundial | 501985 | |
| Tesouras Vannas (ponta 0,015 x 0,015) | Instrumentos de Precisão Mundial | 501778 | |
| Whatman papel de filtro qualitativo | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Cálcio Verde dextrano, Sal de Potássio, 10.000 MW, capilares aniônicos | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| para microinjeção | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1,0 mm., I.D.=0,75 mm. |
| Extrator | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjetor | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Micropipetas World | Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Microscópio vertical | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 estimulador | A.M.P.I. | ||
| Válvulas de solenoide | |||
| Dow Corning graxa do vácuo alto | VWR Câmera científica | Sigma-Aldrich | |
| hidrocloro | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| lente de câmera de software | |||
| Thorlabs | MVL8ML3 | Existem múltiplas possibilidades que devem ser adaptadas ao modelo de câmera usado | |
| Coletor de componentes | de resina | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 | |
| Micromanipulador para entrega local de soluções | Narishige | MN-153 | |
| Mini pinças magnéticas | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Tubulação de polietileno | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
Referências
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. ....
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Reimpressões e permissões
