Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Summary

A identificação das interações físicas entre genes e dos elementos reguladores é um desafio, mas tem sido facilitada pelos métodos de captura de conformação de cromossomo. Esta modificação no protocolo de 4C-seq atenua o viés PCR, minimizando a amplificação excessiva de modelos PCR e maximiza o mappability de leituras, incorporando um passo de digerir adição da enzima de restrição.

Abstract

A identificação dos elementos reguladores para um gene determinado alvo constitui um desafio técnico significativo devido à variabilidade nos tamanhos de posicionamento e efeito de elementos reguladores de um gene alvo. Alguns progressos com a previsão de bioinformatic da existência e função de proximais modificações epigenéticas associadas com a expressão de gene ativado usando locais de ligação do fator de transcrição conservada. Estudos de captura de conformação da cromatina tem revolucionado nossa habilidade para descobrir contatos físicos cromatina entre sequências e mesmo dentro de um genoma inteiro. Captura de conformação de cromatina circular juntamente com a próxima geração sequenciamento (4C-seq), em particular, é projetada para descobrir todas as possíveis interações físicas da cromatina para uma determinada sequência de interesse (ponto de vista), como um gene alvo ou uma regulamentação atrapalha... Estratégias atuais de 4C-seq diretamente sequência de dentro do ponto de vista, mas exigem numerosos e diversos pontos de vista a ser sequenciado simultaneamente para evitar os desafios técnicos de uniforme base chamando (imagem) com plataformas de sequenciamento de próxima geração. Este volume de experiências pode não ser prático para muitos laboratórios. Aqui, nós relatamos uma abordagem modificada do protocolo 4C-seq que incorpora tanto um digest de enzima de restrição adicional e etapas de amplificação qPCR-baseado que são projetadas para facilitar uma maior captura de sequência diversas leituras e mitigar o potencial para Viés de PCR, respectivamente. Nosso método de 4C modificado é passível de laboratório padrão de biologia molecular para avaliar a arquitetura da cromatina.

Introduction

A identificação dos elementos reguladores para a expressão de gene tem sido facilitada pelo projeto livre de elementos de DNA (ENCODE) que exaustivamente anotada atividade funcional para 80% do genoma humano^1,2. A identificação dos locais para na vivo vinculação de fator de transcrição, DNaseI hipersensibilidade e epigenética histona e modificações de metilação do DNA em tipos de células individuais pavimentou o caminho para a análise funcional do candidato regulamentar elementos para a expressão do gene alvo. Armado com estas conclusões, nos deparamos com o desafio de determinar a interconectividade funcional entre genes e dos elementos reguladores. Especificamente, qual é a relação entre um gene alvo determinado e sua enhancer(s)? O método de captura (3c) conformação da cromatina aborda directamente esta questão por interações funcionais, físicas e prováveis identificação entre uma região de interesse e candidato interagindo sequências por meio de eventos capturados na cromatina fixo³ . Como nossa compreensão das interações de cromatina aumentou, no entanto, é evidente que a investigação dos loci candidatos pré-selecionados é insuficiente para fornecer uma compreensão completa das interações gene-realçador. Por exemplo, ENCODE utilizado o método de cópia carbono (5C) de captura de conformação cromossômica de alto rendimento para examinar uma pequena porção do genoma humano (1%, piloto conjunto dos 44 loci) e relatado complexa interconectividade dos loci. Genes e realçadores com interações identificadas em média diferentes parceiros de interação 2 – 4, muitas das quais foram centenas de kilobases afastado no espaço linear⁴. Além disso, Li et al. usado análise de interação cromatina pela cobertura-final Tag sequenciamento (ChIA-PET) para analisar interações promotor do inteiro-genoma e encontrado que 65% dos sítios de ligação II RNA polimerase estiveram envolvidos em interações de cromatina. Algumas dessas interações resultaram em grandes, genes multi complexos, abrangendo centenas de kilobases de distância genômica e que contém, em média, 8-9 genes cada⁵. Juntos, esses achados destacam a necessidade de imparcial do inteiro-genoma métodos para interrogar interações de cromatina. Alguns desses métodos são revistos em Schmitt et al. ⁶.

Métodos mais recentes para estudos de captura de conformação da cromatina juntamente com geração de sequenciamento (Hi-C e 4C-seq) habilitar a descoberta do desconhecido sequências interagindo com uma região de interesse⁶. Especificamente, a captura de conformação circular cromossoma com sequenciamento de nova geração (4C-seq) foi desenvolvida para identificar loci interagindo com uma sequência de interesse em uma forma imparcial⁷ por sequenciamento de DNA de cromatina capturada proximal para o região de interesse no espaço 3D. Brevemente, a cromatina é fixo para preservar suas interações da proteína-DNA nativo, clivado com uma enzima de restrição e posteriormente ligados em condições diluir para capturar biologicamente relevantes "emaranhados" dos loci interagindo (Figura 1). As ligações cruzadas são revertidas para remover a proteína, deixando assim o DNA disponível para a segmentação adicional com uma segunda enzima de restrição. Uma ligadura final gera círculos menores dos loci interagindo. Primers para a sequência de interesse são usados para gerar uma biblioteca amplificada de sequências desconhecidas dos fragmentos circularizou, seguidos de sequenciação de geração próxima a jusante.

O protocolo apresentado aqui, que se concentra na preparação da amostra, faz duas alterações principais existentes 4C-seq métodos^8,9,10,11,12. Primeiro, ele usa um método baseado em qPCR para determinar empiricamente o número ideal de amplificação ciclos para as etapas de preparação de biblioteca 4C-seq e assim reduz o potencial para viés PCR decorrentes de excesso de amplificação de bibliotecas. Em segundo lugar, ele usa um restrição adicional digerir passo em um esforço para reduzir a uniformidade das sequências conhecidas de "isca" que impede a exata base-chamada pelo instrumento sequenciamento e, daí, maximiza a sequência original, informativa em cada leitura. Outros protocolos de contornar este problema por pool de muitas bibliotecas de 4C-seq⁸ (12-15) com isca diferentes sequências e/ou locais de limitação, um volume de experiências que pode não ser alcançável por outros laboratórios. As modificações apresentadas aqui permitem que um pequeno número de experimentos, amostras e/ou Replica para ser indexado e agrupados em uma única faixa.

Protocol

1. enzima de restrição seleção

1. Identificar uma região de interesse (ex., promotor do gene, polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), potenciador) e obter a sequência de DNA de repositórios como National Center for Biotechnology Information (NCBI).
2. Identificar as enzimas de restrição do candidato (REs) para a primeira enzima de restrição digestão (RE1) que não corte dentro da sequência de interesse, que produz extremidades pegajosas (termini de DNA com saliências) após RE digestão, e cujas atividades não são inibidas por Metilação de CpG.
   Nota: A resolução dos dados é determinada pelo RE1. Uma enzima com uma sequência de reconhecimento de 6 pares de base (PB) produz, em média, fragmentos de aproximadamente 4 kilobases (kb) de comprimento, enquanto que uma enzima com uma sequência de reconhecimento bp 4 produz fragmentos aproximadamente 250 bp no comprimento, permitindo que mais preciso identificação de sequências de interação.
3. Selecione um RE1 as enzimas candidato identificadas no passo 1.2 que produz um "ponto de vista" restrição fragmento pelo menos 500 bp longa que inclui a região de interesse ou, alternativamente, uma região vizinha.
   Nota: A enzima selecionada deve ser passível de primer design (veja a etapa 2).
4. Para a digestão segunda, identificar uma enzima de restrição (RE2) com uma sequência de reconhecimento de bp 4 que produz extremidades pegajosas (termini de DNA com saliências) após RE digestão, cuja actividade não é inibida pela metilação de CpG, e que corta dentro a restrição fragmento gerado pelo RE1 para produzir um fragmento de isca 250 – 500 bp (Figura 1).
   Nota: A enzima selecionada deve ser passível de primer design (veja a etapa 2).

2. design e teste de Primers para PCR inverso e eficiência da digestão qPCR

1. Use uma ferramenta de design de primeira demão como Primer3 (http://primer3.ut.ee) para projetar primers inversas que são dirigidas para o exterior em direção as extremidades do fragmento de isca (i. e., 5' primer é um "Ré" cartilha, complementar a vertente mais, enquanto o 3' primer é um " para a frente"da primeira demão, complementar a vertente menos) e como fechar para os locais de restrição quanto possível para minimizar a amplificação de isca não-informativo sequenciar e maximizar a eficiência do PCR (Figura 2A).
   Nota: Primeiras demão devem ser previstas ter mínima específico amplificação do DNA genômico por em silico previsões de PCR e não devem alinhar em outro lugar no genoma exceto seu alvo com mais de 16/18 identidade⁹. Como adaptadores de sequenciamento não são incorporados os primers PCR inversas, o local de ligação do primer é mais flexível do que em outros métodos de preparação de 4C; as primeiras demão devem idealmente recozem dentro de 50 bp do fim do site restrição correspondente.
   1. Confirme a especificidade dos primers PCR inversas pela amplificação usando DNA genômico purificado (gDNA) como modelo.
   2. As primeiras demão ideal devem render alguns produtos quando usando gDNA como um modelo (ver passo 11.2 para a descrição dos produtos esperados do 4C). Se amplificação substancial de gDNA ocorre, projetar novas cartilhas. Se não aceitável da primeira demão de moda é identificadas, retornar à etapa 1 e selecione uma nova isca, selecionando novas enzimas de restrição.
2. Projeto qPCR primers para amplificar os fragmentos 70 – 200 nucleotídeos (nt) de comprimento para monitorar a eficiência de digestão de restrição (Figura 2B).
   1. Desenha um par de primers para amplificar através de cada local de restrição (selecionado na etapa 1) que definem a sequência de isca. Desenhar os primers para ambos RE1 (consulte a etapa 6.5.6) e sites de RE2 (ver passo 9.2).
   2. Desenha um conjunto de primers que amplifica uma região não contendo os sites para qualquer enzima de restrição como um controle de normalização (DNA sem cortes) para RE1 e RE2 (ver também passo 6.5.6).

3. conjunto de células

1. Usando um método apropriado para a cultura de tecidos ou células, obter uma suspensão de célula única. As células por 5 min a 200 x gde Pelotas, desprezar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 500 µ l de solução salina tampão fosfato (PBS) por 10⁷ células de 1x.

4. formaldeído cross-linking de células para preservar a cromatina interações

1. Por 10⁷ células, adicionar 9,5 mL de microscopia eletrônica de 1% (EM)-grau de formaldeído (metanol livre) em PBS e incubar, enquanto tombamento basculante (ou similar), durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT, 18-22 ° C).
   Nota: As condições de fixação podem ter que ser otimizado para cada tipo de célula. Prévia de trabalho publicado em pilhas do rato relatou que a fixação ideal resulta em pelo menos 40% de leituras mapeadas, alinhando o cromossoma que contém o ponto de vista⁹ supondo que uma região não-oligospermia por um cromossomo de tamanho médio.
2. Transferi os tubos de reação para o gelo e adicionar gelada 1m de glicina a uma concentração final de 0,125 M (1,425 mL) para saciar a reação de reticulação. Misture gentilmente por inversão.
3. Centrifugue por 5 min a 200 x g, 4 ° C e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante. Armazenar o centrifugado a-80 ° C, ou proceder de imediato à lise de células.

5. lise celular

1. Resuspenda o pellet de célula de etapa 4.3 em 500 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 5mm (EDTA) para lavar. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à RT. descartar o sobrenadante.
2. Resuspenda o pellet de células em 125 µ l de 5 mM EDTA, com 0,5% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e inibidores da protease x 1, como um coquetel contendo Antipaína 5 mg/mL, 10 mg/mL chymostatin, leupeptin de 10 mg/mL e 10 mg/mL pepstatin A. de x 100
   Nota: A concentração de detergente pode ter que ser otimizado para cada tipo de célula. Concentrações de detergente insuficientes resultará na lise celular incompleta, deixando a cromatina inacessível a enzimas de restrição. Se a digestão da limitação é persistentemente baixa na etapa 6.5.6 e confirmou-se a atividade da enzima, detergente adicional pode ser necessária. Aumente a concentração de SDS em incrementos de 0,1%.
3. Incube a suspensão de células no gelo por 10 min.
   Nota: Para queratinócitos humanos primários, Lise ideal foi conseguido usando uma incubação de 10 min a 65 ° C, seguido de uma incubação de 37 ° C durante a noite em um tremendo bloco de aquecimento com agitação (900 rpm).
4. Certifique-se de que lise celular é completo.
   1. Mix 6 µ l das células com 6 µ l de Trypan azul em um slide e cobrir com uma lamela. Ver os sob um microscópio.
      Nota: Após lise bem sucedida, o interior das células deve aparecer azul e un-lisadas células aparecerão em brancas.
   2. Se a lise celular parece insuficiente, as células a 200 x g por 5 min de pelotas e salvar o sobrenadante. Resuspenda o pellet e repita as etapas de 5,2-5,4 e/ou alternativamente com temperaturas de incubação diferentes (consulte a observação na etapa 5.3).
   3. Combinar a pelota re-lisada com o sobrenadante salvo e prosseguir.
      Nota: A Inspeção Visual não é uma garantia do lysis suficiente. Eficiência de digestão deve ser determinada objectivamente como na etapa 6.5.6.

6. a primeira restrição de digestão

1. Adicionar 30 μL de 10x buffer de enzima de restrição (especificado pelo fabricante) e 27 μL de 20% Triton X-100 (final 1,8%) para a suspensão de passo 5.4. Trazer o volume total de 300 µ l com H₂O.
   Nota: A composição da enzima de restrição reserva dependerá o RE escolhida na etapa 1.
2. Retire uma alíquota de μL 15 como um "Controle não digerida" e em 4 ° C.
3. Adicionar 200 U RE1 para a restante mistura de reação e incubar durante uma noite na temperatura adequada à enzima em um tremendo bloco de aquecimento com agitação (900 rpm). No dia seguinte, mais um adicional de 200 U RE1 e continuar a incubação durante a noite.
4. Remover um 15 μL alíquota como um controle de"digerido" e armazenar a 4 ° C.
5. Determine a eficiência da digestão:
   1. Adicione 82,5 µ l de pH de Tris-HCl 10mm 7.5 para amostras de 15 µ l de passos 6.2 e 6.4. Adicionar 2,5 µ l de proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante 1 h a 65 ° C.
   2. Adicione 100 µ l de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão para eliminar a contaminação residual da proteína. Centrifugue por 5 min, 16.100 x g , à temperatura ambiente.
   3. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 6,66 µ l de 3M de sódio acetato pH 5.2, 1 µ l de glicogênio de 20 mg/mL e 300 µ l de 100% de etanol (EtOH). Misture gentilmente por inversão e lugar a-80 ° C durante 1 h.
   4. Centrifugar por 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 500 µ l de 70% EtOH e centrifugar por 5 min a 16.100 x g em RT
   5. Remover o sobrenadante e secar a pelota em temperatura ambiente por 2 min. resuspenda o pellet em 50 µ l de nuclease livre H₂O.
   6. Determine a eficiência de digerir por qPCR^13,14 , usando o método ∆∆Ct. Usar o primer conjunto não flanqueando um sítio de restrição (consulte a etapa 2.2.2) como o controle de normalização. Proceder-se a eficiência da digestão é > 85%. Caso contrário, as células de pelotas e repita os passos 5.2 – 6,5, omitindo a incubação a 65 ° C, no passo 5.3.

7. primeira ligadura

1. Calor-inativar a enzima de restrição incubando min 20 a 65 ° C. Como alternativa, se a enzima não pode ser calor inativado, extrair o fenol-clorofórmio e etanol precipitar a amostra.
   Nota: As temperaturas mais elevadas inactivação recomendadas para algumas enzimas de restrição desnaturam as proteínas da cromatina, e isso pode afetar negativamente a qualidade da amostra. Além disso, extração fenol: clorofórmio não é ideal, pois resulta na perda da amostra.
2. Transfira para um tubo cónico de 50 mL e adicionar 6 mL de nuclease livre H₂O, 700 µ l de tampão ligase (660 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de cloreto de magnésio (MgCl₂), 10 mM ditiotreitol (DTT), 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP)), de 10x e 50 U T4 DNA Ligase. Misture delicadamente e agitando e incubar durante uma noite a 16 ° C.
3. Retire uma alíquota de 100 µ l da amostra como o 'controle de ligadura '.
4. Determine a eficiência de ligadura:
   1. Adicionar 2,5 µ l de Proteinase K (20mg/mL) e incubar 1 h a 65 ° C.
   2. Adicione 100 µ l de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão. Centrifugue por 5 min, 16.100 x g em RT.
   3. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 6,66 µ l de 3M de sódio acetato pH 5.2, 1 µ l de glicogênio e 300 µ l de 100% EtOH. Misture gentilmente por inversão e lugar a-80 ° C cerca de 1h.
   4. Centrifugar por 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 500 µ l de 70% EtOH e centrifugar por 5 min a 16.100 x g a 4 ° C.
   5. Remover o sobrenadante e secar a pelota à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet em 20 µ l de água e carregar em um gel de agarose de 0,6% ao lado os controles de"digestão" do passo 6.5.
      Nota: Uma amostra bem ligada deve aparecer como uma banda relativamente apertados, de alto peso molecular (Figura 3).
   6. Se a ligadura é suficiente, prossiga com a etapa 8. Caso contrário, adicione fresco ATP (concentração final de 1 mM) e ligase novo; Incubar durante uma noite a 16 ° C e repita as etapas 7.3-7.4.

8. inverta o cross-linking e isolar a cromatina

1. Adicionar 15 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) e incubar durante uma noite a 65 ° C para inverter as ligações cruzadas.
2. Adicionar 30 µ l de RNase A (10 mg/mL) e incubar a 45 min a 37 ° C.
3. Adicione 7 mL de fenol-clorofórmio e misture vigorosamente por inversão. Centrífuga de 15 min, 3.300 x g em RT.
4. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de 50 mL e adicione 7,5 mL de nuclease livre H₂O (para diluir o DTT presente no buffer ligase, que, de outra forma, precipita-se com o DNA), 1 mL de pH 3 M de acetato de sódio 5,6, 7 µ l de glicogênio (20 mg/mL) e 35 mL de 100% EtOH. Misturar e incubar a-80 ° C durante 1 h.
5. Centrífuga 20 min, 3.900 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante (pelota pode ser difícil de ver), lavar a pelota com 10 mL de gelada 70% EtOH e centrífuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
6. Remover o sobrenadante e secar brevemente a pelota no RT. dissolver a pelota em 150 µ l de pH de 10 mM Tris-HCl 7,5 a 37 ° C. Armazenar a-20 ° C ou continue com o passo 9.

9. segunda restrição digestão: Aparar os círculos

Nota: Este passo cria círculos menores para minimizar a sobre-representação de menores capturados fragmentos devido a viés PCR em etapas de amplificação a jusante.

1. Para a amostra da etapa 8.6, adicionar 50 µ l de 10x buffer de enzima de restrição (especificado pelo fabricante), 300 µ l de nuclease livre H₂O e 50 U de enzima de restrição RE2. Incube durante uma noite na temperatura adequada para a enzima escolhida.
2. Retire uma alíquota de 15 µ l da amostra como o "controle de digestão". Determine a eficiência da digestão conforme descrito no passo 6.5.

10. segunda ligadura e purificação de DNA

1. Inativar a enzima de restrição, conforme recomendado pelo fabricante. Se a enzima não pode ser inactivados por calor, remova a enzima usando um kit de purificação baseada na coluna.
   Nota: Como isso resulta na perda da amostra, purificação da coluna não é o ideal.
2. Transferir a amostra para um tubo de 50 mL e adicionar 12,1 mL de nuclease livre H₂O, 1,4 mL de 10x buffer de ligadura (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl₂; 10 mM DTT 10mm ATP) e 100 ligase do DNA de T4 U. Incubar durante uma noite a 16 ° C.
3. Adicione 467 µ l de pH 3 M de acetato de sódio 5.6, 233 µ l livre de nuclease H₂O, 7 glicogênio µ l (20 mg/mL) e 35 mL 100% EtOH. Misture bem e incubar a-80 ° C durante 1 h.
4. Centrífuga de 45 min, 3.900 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante, adicionar 10 mL de frio 70% EtOH e centrífuga 15 min, 3.300 x g a 4 ° C.
5. Remover o sobrenadante e secar brevemente a pelota à temperatura ambiente. Adicionar 150 µ l de pH de Tris-HCl 10mm 7.5 e incubar a 37 ° C para dissolver o sedimento.
6. Purifica as amostras com uma sílica baseada na coluna PCR purificação kit, seguindo as instruções do fabricante. Use 1 coluna por 3 x 10⁶ células, baseadas no número inicial das células. Eluir as colunas com 50 µ l de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e piscina as amostras.
7. Medir a concentração por fluorimetria ou espectrofotometria usando a absorvância em 260 nm. O modelo de 4C está agora pronto para inverso do PCR. Armazenar a-20 ° C ou vá diretamente para o passo 11.

11. PCR amplificar sequências de interação desconhecidas por PCR inverso

1. Determine o intervalo linear de amplificação através da realização de um PCR usando diluições de modelo de 12.5, 25, 50 e 100 ng 4C modelo. Se desejado, amplifica de gDNA em paralelo para comparar diretamente os produtos a fim de identificar a amplificação não-específica. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min; 30 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 55 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min; e uma extensão final a 68 ° C por 5 min.
2. Separe 15 µ l de cada produto do PCR em um gel de agarose 1,5% para confirmar a amplificação linear e avaliar a qualidade do modelo (Figura 4). Amplificação do modelo 4C deve produzir faixas discretas em baixas concentrações de DNA e um esfregaço em altas concentrações. A presença de mancha indica aumento da complexidade da ligadura 4C amplificado.
3. Quando estiver satisfeito com a qualidade e quantidade do produto do PCR inverso gerado, configurar um qPCR para determinar o número ideal de ciclos para usar para amplificação:
   1. Configure as reações que contém corantes SYBR e ROX usando a mistura de reação na tabela 2. A menos que a amplificação não é linear em concentrações elevadas no passo 11.2, uso 100 ng do modelo por reação.
      Nota: A adição de ROX facilita a normalização do sinal fluorescente de bem de bem e de ciclo para ciclo.
   2. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min; 40 ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 55 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min; e uma extensão final a 68 ° C por 5 min.
   3. Determine a fluorescência de pico (ponto final) das reações usando o enredo de amplificação. Determine o ciclo em que reações atingirem 25% do pico da fluorescência (Figura 5).
      Nota: Este é o número de ciclos que será usado para amplificar as bibliotecas 4C (ver passo 11.4).
4. Configure o inverso do PCR como na tabela 3 para amplificar sequências desconhecidas ligadas à isca do modelo 4C. Divida em 16 reações de 50 µ l de antes da execução. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 94 ° C por 2 min e ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 94 ° C, durante 10 s, um recozimento passo a 55 ° C por 1 min, e uma etapa de extensão a 68 ° C por 3 min. Use o número de ciclos de determinado na etapa 11.3.3.
5. Coletar e as reações da piscina. Purifica usando um kit de purificação de PCR de baseados em colunas de sílica. Use pelo menos 2 colunas por 16 reações. Os produtos PCR purificados da piscina.
6. Determine a quantidade de amostra e pureza por espectrofotometria. Rendimentos típicos são entre 10 e 20 μg com A260/A280 ~ 1.85. Se as taxas de absorção são sub-ótimo, re-purifica a fim de evitar problemas durante o sequenciamento.
7. Avaliar a complexidade da biblioteca, separando a 300 ng do produto PCR purificado em um gel de agarose 1,5%.
   Nota: Produto amplificado deve se parecer com isso de passo 11.2.

12. terceira restrição digestão: Recortar sequências de isca

Nota: Este passo remove sequências não-informativo isca os produtos PCR inversas para maximizar informativas sequências capturadas nas etapas a jusante de sequenciamento. Para monitorar a eficiência de síntese, um "monitor de digerir"¹⁵ é digerido em paralelo usando a concentração de DNA e enzima equivalente. Se RE1 e RE2 são incompatíveis para a digestão simultânea, por exemplo, devido a temperaturas de incubação ideal diferente ou buffers de reação, isto deve ser feito como um digest sequencial (isto não é o ideal).

1. Obter um monitor de digerir RE e testar a digestão em uma reação de 50 µ l.
   Nota: Esta é uma molécula de dsDNA (por exemplo, um plasmídeo, PCR amplicons ou DNA sintético) que contém o site do RE. A única exigência é que deve ser fácil de distinguir corte de monitor sem cortes em um gel de agarose. Otimizar RE monitor massa e enzima concentração se necessário.
2. Digest 1 µ g de produto PCR inverso purificado de 11,6 passo e, em paralelo, o monitor RE da etapa 12.1.
   Nota: DNA e concentração de enzima, bem como o tempo de incubação, deve ser o mesmo para o resumo de teste no passo 12.1 para tanto o inverso produto do PCR e digere o monitor. Ajuste o volume de reação conforme necessário.
3. Execute o digerido RE monitor em um gel de agarose de concentração adequada para os fragmentos esperados. Digestão é considerada suficiente quando < 10% do DNA permanece sem cortes (Figura 6).
4. Purifica o produto do PCR inverso digerido em um kit de purificação de DNA de baseados em colunas de sílica. Se digere sequenciais é necessárias, repita os passos 12.1 – 12,4 com a segunda enzima.

13. preparação de sequenciamento de biblioteca

1. Ligar os adaptadores compatíveis com a respectiva plataforma sequenciamento da geração seguinte.
   1. Desenha os adaptadores para cada RE1 e RE2 para que, após recozimento os oligos, cada adaptador RE tem a respectiva saliência de 1 lado.
      Nota: por exemplo, se HindIII é usado, o adaptador recozido deve conter uma ' fosforilada "AGCT" saliência 5. Alternativamente, se o padrão T-saliência adaptadores são usados, fim-reparação e cauda-a biblioteca antes da ligadura do adaptador.
   2. Recoze o respectivo adaptador RE oligos. Resuspenda os oligos em buffer de recozimento (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1 mM EDTA), misturar em quantidades equimolar de 50 µM, calor para 95 ° C e deixar arrefecer lentamente a 25 ° C.
   3. Realize a reação da ligadura. Misture 4 re-digerido C biblioteca com um total 5 - a 10 vezes molar excesso de adaptadores recozidos (passo 13.1.2; proporção 50: 50 para cada adaptador RE usado) ligase tampão 1x e adicionar 6U DNA ligase. Incube-se de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Remova o excesso adaptadores purificando usando um kit de coluna baseada em sílica de eluição de baixo volume.
2. Tamanho-selecione.
   Nota: Seleção de tamanho também pode ser realizada usando um kit de limpeza baseados em grânulo e recomenda-se mesmo depois de purificação da coluna.
   1. Conversão de um gel de agarose 2% usando um agarose de alta resolução, adicionando uma mancha não-UV antes de servir. Certifique-se de que toda a água perdida por evaporação durante o aquecimento é substituída pela garrafa ou frasco de pesagem antes e após aquecimento e adição de água para recuperar a massa perdida.
   2. Execute as bibliotecas adaptador-ligados em gel, deixando pistas vazias entre as amostras.
   3. Excisar as fatias do gel correspondente para o bp de escala 150 tamanho para 1 kb usando um limpa bisturi ou lâmina de barbear.
   4. Purifica as bibliotecas do gel usando um kit de extração do gel. Para minimizar o viés de GC na recuperação do DNA, dissolva as fatias do gel em temperatura ambiente com rotação.
3. Determine o número de ciclos de amplificação por PCR por qPCR usando a mistura de reação na tabela 4. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 98 ° C por 2 min e 40 ciclos consistindo de uma desnaturação passo a 98 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 60 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 72 ° C por 3 min.
   Nota: O ciclo em que a fluorescência atinge 25% do máximo é o número de ciclos que será usado para amplificar a biblioteca, como no passo 11.3.
4. Amplifica as bibliotecas usando a mistura de reação na tabela 5. Executar as reações de PCR usando uma desnaturação inicial a 98 ° C por 2 min e ciclos consistindo de uma etapa de desnaturação a 98 ° C, durante 10 s, um passo de recozimento a 60 ° C por 1 min e uma etapa de extensão a 72 ° C por 3 min. O número de ciclos de amplificação para ser usado para cada biblioteca foi determinado na etapa 13.3.
5. Purifica amplificadas bibliotecas usando um kit de coluna baseada em sílica de eluição de baixo volume.

14. sequenciamento e análise de dados de sequenciamento

1. Determine as concentrações de bibliotecas amplificadas usando um ensaio fluorimétrica. Dilua as bibliotecas com a concentração adequada para sequenciamento (verificar com o serviço de sequenciamento ou núcleo para sua recomendação).
2. Determine a qualidade das bibliotecas usando uma plataforma de análise de ácidos nucleicos microfluidic.
   Nota: O perfil do tamanho da biblioteca deve espelhar que vi sobre o gel de seleção de tamanho em 13,2 passo, e a concentração da amostra determinada nesta etapa vai ser utilizada para o sequenciamento.
3. Piscina indexados bibliotecas para obter leituras de pelo menos 3 milhões (pelo menos 50 bp ler; single [1 X 50] ou emparelhado final [2 X 50]) por exemplo. Uma biblioteca de alta qualidade requer pelo menos 1 milhão mapeado lê⁹, mas haverá algum atrito durante o mapeamento. Por exemplo, uma plataforma de sequenciamento que rende aproximadamente 150 milhões leituras por lane pode acomodar até 50 amostras em uma única faixa.

15. análise de dados da sequência

1. Demultiplex os dados usando sequências de índice para atribuir as leituras de suas amostras adequadas.
   Nota: Dependendo de sua familiaridade, os usuários podem executar análises computacionais a jusante de arquivos raw de FASTA/FASTQ sequência usando a interface de linha de comando básica ou, alternativamente, a user-friendly, web-based galáxia gráfica do usuário interface (GUI)¹⁶ .
2. Apare as sequências de adaptador e qualquer sequência de isca decorrentes incompleta RE digestão no passo 12, por exemplo, usando o Toolkit de FAST-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
3. Mapa demultiplexed leituras para o genoma adequado de interesse (ex., UCSC mm10, hg19) arquivos de saída usar o alinhador de Burrows-Wheeler (BWA)¹⁷ ou outro software de alinhamento resultando em SAM. Se necessário, converter arquivos de SAM para BAM através de samtools¹⁸ (ver passo 15,4).
4. Use um pipeline de análise 4C-seq como Basic4Cseq¹⁹, 4C-ker²⁰, FourCSeq²¹ou fourSig²² para analisar os dados e identificar as interações.
   Nota: A análise dos dados e a avaliação da qualidade respectivas devem ser conduzidos de acordo com o manual de referência do pacote software selecionado. Pacotes de geram arquivos de saída cama, exceto onde anotado. Brevemente, Basic4CSeq¹⁹ usa um arquivo de entrada SAM (passo 15.3) para visualizar as interações (txt, tiff, cama e arquivos de saída de peruca) e avalia a qualidade dos dados com base nos critérios estabelecidos na van de Werken et al. ⁹ 4C-ker²⁰ (entrada aparado FASTQ, passo 15.2) e FourCSeq²¹ (entrada BAM, passo 15,3) diferenciais interações entre condições de identificar. fourSig²² (entrada SAM) também identifica interações significativas e prioriza aquelas que são susceptíveis de ser reprodutíveis. Ferramentas como o Genomic regulamentar enriquecimento de anotações ferramenta (grande)²³, ou integração com ENCODE de conjuntos de dados também podem ser utilizadas para prever a função biológica de interações descoberto por 4 C-Seq

Results

Queratinócitos humanos primários foram isolados a partir de prepúcios neonatais descartados de 2 – 3, em pool e cultivadas em KSFM suplementado com 30 µ g/mL bovina pituitária extrato, 0.26 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico e 0,09 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂ ) a 37 ° C, 5% de dióxido de carbono. As células foram divididas em dois balões, e um balão se diferenciava pela adição de CaCl₂ para uma concentração final de 1,2 mM para células de

Discussion

4C resultados têm o potencial para revelar interações de cromatina que podem identificar elementos normativos anteriormente desconhecidos e/ou genes-alvo que são importantes em um contexto específico biológico^24,25,26. No entanto, barreiras técnicas podem limitar os dados obtidos a partir dessas experiências. Viés PCR decorrentes de amplificação excessiva do modelo em protocolos 4C é provável. Este protocolo aborda esta questão ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
Primers de oligonucleotídeos de DNA	IDT		A ser projetado pelo leitor
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mL	Fisher Scientific	06-443-19
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL MidSci		AVSS1700
Solução salina	tamponada com fosfatoThermo Fisher	14190-136
Formaldeído, sem metanol	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710
Nutator	VWR	15172-203
Glicina	JT Baker	4059-00
Centrífuga
Microcentrífuga
Etilenodiaminotetracética ácido (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED2SS
Solução SDS a 20%	Sigma-Aldrich	05030
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
Lâminas de vidro	Fisher Scientific	12-550-143
Lamínulas	VWR	16004-094
Microscópio
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Bloco de calor
2 M Tris-HCl	Qualidade Biológica	351-048-101
Proteinase K	NEB	P8107S
Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1)	Sigma-Aldrich	P2069
Acetato de sódio	Sigma-Aldrich	M5661
20 mg/ mL de glicogênio	Thermo Fisher	R0561
Etanol	Fisher Scientific	04-355-223
Água livre de nuclease	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
qPCR cycler	Thermo Fisher	4453536
placas qPCR	Thermo Fisher	4309849
Thermo	Fisher	4375786
Tubos de tira de PCR	MidSci	AVSST-FL
1 M Cloreto de magnésio	Qualidade biológica	351-033-721
Ditiotreotol	Sigma-Aldrich	43815
Trifosfato de adenosina	Sigma-Aldrich	A2383
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Agarose	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Qiaquick PCR kit de purificação	Qiagen	28104
MinElute PCR kit de purificação	Qiagen	28004
Espectrofotômetro
Expandir Sistema de PCR de Modelo Longo	Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP mix	Thermo Fisher	R0191
SYBR Green I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S5886
End-It DNA End-Repair Kit	Lucigen	ER0720
LigaFast Sistema de ligação rápida de DNA	Promega	M8221
SYBR Safe	Thermo Fisher	S33102
Taq Polimerase	NEB	M0267S
UltraSieve Agarose	IBI Scientific	IB70054
Kit de Extração de Gel Qiaquick Qiagen		28704