Caracterizando Microbiome dinâmica – citometria de fluxo com base em fluxos de trabalho de culturas puras de comunidades naturais

Summary

Análise de fluxo cytometric demonstrou ser valiosa para investigar culturas puras e monitoração dinâmica da comunidade microbiana. Apresentamos três abrangentes fluxos de trabalho, de recolha de amostras para análise de dados, para culturas puras e comunidades complexas em meio clara, bem como em matrizes desafiadoras, respectivamente.

Abstract

A investigação de culturas puras e acompanhamento da dinâmica da comunidade microbiana são vitais para compreender e controlar os ecossistemas naturais e aplicações técnicas, conduzidas por microorganismos. Próxima geração métodos de sequenciamento são amplamente utilizados para resolver microbiomes, mas eles geralmente são recursos e tempo intensivo e entregam informações principalmente qualitativas. Análise de fluxo cytometric microbiome não sofrem estas desvantagens e pode fornecer abundâncias subcommunity relativo e absoluto na linha de números de celular. Embora ele não entrega informação filogenética directa, pode realçar a profundidade de análise e resolução de abordagens de sequenciamento. Em contraste com aplicações médicas na pesquisa e configurações de rotina, citometria de fluxo é ainda não amplamente utilizada para análise de microbiome. Informações ausentes em gasodutos de análise de dados e preparação de amostra podem criar uma barreira de entrada para os pesquisadores enfrentam desafios de análise microbiome que seriam muitas vezes aplicações de citometria de fluxo típico. Aqui, apresentamos três fluxos de trabalho abrangentes para culturas puras, comunidades complexas em claro médias e complexas comunidades em matrizes desafiadoras, respectivamente. Descrevemos os procedimentos de amostragem e fixação individuais e otimizado de protocolos para os amostra respectivos conjuntos de coloração. Elaborar a análise cytometric com uma complexa investigação centrada e um dispositivo de topo aplicativo banco focado, descrevemos a célula classificação procedimento e sugerir pacotes de análise de dados. Além disso propomos importantes controles experimentais e aplicam-se os fluxos de trabalho apresentados para a respectiva amostra de moda.

Introduction

Os microrganismos desempenham um papel vital em muitos aspectos do ser humano vivo. Eles são os principais drivers bióticos dos planetas carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre ciclos¹e ato como degradante,^2,3 , bem como sintetizar⁴ Biocatalisadores em várias indústrias, tais como tratamento de águas residuais ⁵ ou biotecnologia⁶. Eles ainda constituem a microbiome humano, que está influenciando diretamente a saúde humana e metabolismo^7,8. Portanto, as informações sobre estrutura, função e comportamento dinâmico de microorganismos, em resposta ao seu ambiente imediato, são necessárias se pretendemos inteiramente compreender e manipular esses sistemas. Próxima geração de sequenciamento (NGS) é a tecnologia estabelecida para a resolução de microbiome estrutura e função⁹. No entanto, a análise e avaliação de dados NGS não é possível gerar informações quantitativas e é ainda caro, demorado e de nenhuma maneira pronta para fornecer resultados no local dentro de corredores de desempenho. Algumas bactérias exibem geração vezes abaixo de 1h e causa estruturas comunitárias em certos ambientes¹⁰em constante mudança. Na sequência de tal dinâmica, usar abordagens de sequenciamento excederia a capacidade financeira e da força de trabalho de laboratórios mais científicos.

Em contraste, citometria de fluxo pode fornecer impressões digitais de comunidade semelhante aos dados NGS, mantendo uma maior eficiência de tempo, mão de obra e custo. Aqui, apresentamos técnicas de fluxo cytometric capazes de seguir a comunidade microbiana dinâmica em linha a nível de célula única. Ao contrário de NGS, citometria de fluxo não fornece afiliação filogenética ou informações sobre genes funcionais, mas oferece números de telemóvel quantitativa. Utilizando citometria de fluxo, comunidades microbianas podem ser resolvidas em subcommunities com a dispersão de luz distinta e propriedades de fluorescência (forward scatter (FSC) e dispersão lateral (SSC) fornecem indicações de tamanho da célula e granularidade, respectivamente). A abordagem apresentada utiliza predominantemente célula tamanho - e DNA montante informações relacionadas que estão associados a certos tipos de células e Estados fisiológicos (crescimento). O conteúdo de DNA é quantificado usando o UV-excitável 4', tintura de 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI), que se liga para regiões ricas A-T do DNA e nem pode resolver diferentes níveis cromossômicos. Combinando DAPI fluorescência e FSC mais de 50 subcommunities podem ser distinguidos e monitorados por abundâncias sendo alterado ao longo do tempo¹¹. As variações de abundância de subcommunity podem ser correlacionadas com as mudanças no ambiente microambientais, tais como pH e produto títulos¹², com parâmetros globais, tais como o tempo de^13,14, ou em caso de intestino ou saliva microbiomes com determinados tratamentos médicos,¹⁵. Essas correlações revelam chaves subcommunities responsáveis por determinadas funções na rede metabólica de toda a Comunidade. Os subcommunities chaves podem então ser especificamente promovidos suprimidas, alterando os microambientes circundantes ou classificados para posterior sequenciamento¹⁵ ou proteomic investigação¹⁶.

No entanto, citometria de fluxo da comunidade microbiana não é ainda amplamente estabelecida devido a um número bastante baixo de fluxo cytometric dispositivos capazes de resolver as populações microbianas ou comunidades corretamente. Além disso, a falta de experiência, comunidade pipelines de análise e avaliação de dados eficaz pode representar uma barreira de entrada para os investigadores microbiome análise desafios. Nós estabelecemos a fluxos de trabalho abrangentes para abordar estas questões. Para ilustrar sua aplicabilidade geral, vamos apresentar-lhes sobre três conjuntos de amostra exemplar (arquivo complementar 1-S1), ou seja, eu) uma cultura pura (PC) para aplicações biotecnológicas cultivados em meios claramente definidos (Pseudomonas putida KT 2440 na glicose), ii) uma comunidade de laboratório complexo em claro médio (comunidade de lamas activadas (ASC), em efluente sintético) e iii) uma comunidade complexa de ambientes naturais em uma matriz densa (comunidade de biogás (BC), em silagem de milho).

Diversos fatores influenciam a escolha do protocolo para cada um desses conjuntos de amostra. Congelação profunda renuncia a utilização de produtos químicos tóxicos, mas principalmente está limitada a ambientes de laboratório devido ao uso de nitrogênio líquido para cobertura de choque. A estabilização de formaldeído e etanol subsequente fixação permite a amostragem em massa sem a necessidade de preparação de alíquota e tem provado para ser estável durante longos períodos. No entanto, amostras de ricos em proteínas, tais como saliva humana¹⁵ podem ser problemáticas, porque flocos de proteína, denaturized pelo formaldeído, podem causar sinal desfavorável para rácios de ruído. A secagem da amostra vai levar mais tempo (cerca de 1 h no total) dos procedimentos nesta comparação, mas pode ser executada no site sem produtos químicos tóxicos. Que produz pelotas estáveis em tubos, que podem ser facilmente enviados sem precauções de risco adicional ou refrigeração. Além disso, muitos métodos alternativos de fixação foram propostos¹¹. É altamente recomendável para testar a estabilidade de resolução e a fixação de diferentes protocolos, aquando da introdução de um novo conjunto de amostra.

Usamos dois citômetros diferentes para analisar os conjuntos: i) uma pesquisa altamente sofisticada e cara, centralizado classificador da pilha e ii) um aplicativo focado banco Analisador superior que aparece mais adequado para aplicação no local⁵. O BC foi medido com o analisador de bancada superior, enquanto o PC e ASC foram medidos com o classificador de célula. A análise da amostra exemplar três conjuntos diferentes procedimentos necessários para a reprodutibilidade otimizada, estabilidade de amostra e conveniência de fluxo de trabalho. O seguinte protocolo especificará as seções para os três sistemas diferentes.

Protocol

1. amostragem e fixação

1. Cultura pura: congelamento de^15,17
   1. Tomar 2 mL de suspensão de células, centrifugar durante 5 min à temperatura ambiente (RT) e 5.000 x g e descartar o sobrenadante.
      Nota: A suspensão de eritrócitos amostrados é descrita no arquivo complementar 1-S1.
   2. Ressuspender as células em 1 mL de solução salina de tampão fosfato (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM NaH₂PO₄, 145 mM de NaCl com bi-destilada H₂O, pH 7,2) Adicionalmente contendo 15% (v/v) glicerol como um agente cryoprotective.
   3. Incubar durante 10 min no gelo e choque de congelamento em nitrogênio líquido para posterior armazenamento a-80 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras são estáveis pelo menos um mês.
2. Ativada a Comunidade do lodo: estabilização de formaldeído + etanol fixação^5,10,18
   1. Tomar 4 mL de suspensão de célula, centrifugar por 20 min a 15 ° C e 3.200 x g e descartar o sobrenadante.
      Nota: A suspensão de eritrócitos amostrados é descrita no arquivo complementar 1-S1.
   2. Adicionar 4 mL de formol 2% em PBS e incube por 30 min em RT
      1. Prepare a solução de formaldeído 8% das ações da paraformaldeído para evitar o conservação metanol aditivo adicionado ao formaldeído enviado na forma líquida. Adicionar 4 g de paraformaldeído a 50 mL de PBS a 70 ° C. Adicione aproximadamente 125 µ l de solução de NaOH 10 M. Mexa até o paraformaldeído foi completamente dissolvido e deixe depois arrefecer RT. ajustar o valor de pH de 7.0 com aproximadamente 100 µ l 37% HCl. congelar a solução de formaldeído em alíquotas de 15 mL para armazenamento. Não use descongeladas alíquotas de mais de 10 dias.
         Cuidado: Formaldeído precisa ser manipulados e eliminados com cuidado devido a suas propriedades tóxicas e mutagénicos. Use sempre luvas ao manuseá-lo. Use o aspirante enquanto dissolvendo o paraformaldeído para evitar a exposição a gases tóxicos.
   3. Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 15 ° C e 3.200 x g e descartar o sobrenadante.
   4. Resuspenda a amostra em 4 mL de etanol a 70% e em-20 ° C.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras são estáveis pelo menos 2 meses. Dependendo das propriedades da amostra, a etapa de centrifugação em 1.2.1 também pode ser realizada por 10 min a 4 ° C, para economizar tempo.
3. Comunidade de biogás: secagem
   1. Use uma ponta de pipeta recortado 1.000 µ l a 200 µ l de amostra de digestores o viscoso em um tubo de 2 mL.
   2. Adicione 1.700 µ l de tampão PBS e misture bem.
   3. Coloque os tubos em um banho ultra-sônico em 35 kHz e 80 W eficaz potência durante 1 min para dissolver agregados de células grandes e destacar células degola para resíduos de células da planta.
   4. Homogeneizar a amostra, filtrar a amostra através de um filtro de malha de 50 µ l e divida o filtrado em quatro alíquotas de cerca de 400 µ l.
      Nota: Neste momento a preparar alíquotas oferece duas vantagens principais. Primeiros, menores volumes são mais fácil e rápido para secar mecanicamente (centrífuga) e termicamente (secagem), mas a amostragem de pequenos volumes de geralmente lama espessa de biogás pode ser muito desafiador. Segunda, extras de amostras podem ser utilizadas para célula subsequente classificação, medições de backup ou controles.
   5. Centrifugar as alíquotas duas vezes por 10 min a 10 ° C e 4.000 x g e descartar o sobrenadante completamente duas vezes para mecanicamente secar a amostra tão completamente quanto possível.
   6. Seca as amostras em uma centrífuga de vácuo aquecida por 40 minutos a 35 ° C, aproximadamente-97 kPa e x 2.500 g para criar pelotas estáveis. Armazene as pelotas a 4 ° C no escuro.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As pelotas são estáveis pelo menos 6 meses.

2. coloração

Nota: DAPI mancha provou-se a entregar os lotes do ponto de alta resolução e, portanto, é particularmente vantajosa quando analisando comunidades. A concentração de DAPI na solução de coloração precisa ser otimizado para garantir uma intensidade de fluorescência de porta celular bem acima do nível de ruído, mas abaixo os grânulos. O ideal depende da escolha de sensibilidade e o grânulo do instrumento, pode variar entre conjuntos de amostra devido ao teor de G/C dos microorganismos contidos e geralmente deve ser testado para conjuntos de amostra recém introduzidos. Testando as concentrações entre DAPI de 0,24 µM e 1 µM DAPI é recomendado para a instalação apresentada. Outros corantes podem ser usados para aplicações específicas. O uso de um SYBR Green que mancha o protocolo é aconselhado quando a célula absoluta precisão de contagem é priorizada sobre as impressões digitais de^6,análise (arquivo complementar 1-S1)¹⁵. Isso inclui menos etapas de manipulação e centrifugação da amostra e é aplicável com células fixas e vitais. O uso de células vitais reduz ainda mais as etapas de manipulação de amostra, ignorando a fixação e, portanto, requer apenas uma centrifugação para a colheita de células. Isso minimiza a perda potencial de célula e erro de medição, consequentemente, sistemática. O PBS, tampão de permeabilização e manchando a solução usada durante todas as etapas a seguir devem ser filtrados através de filtros de seringa 0,2 µm para reduzir a carga de partículas adicionais na amostra. A coloração de uma amostra contendo Escherichia coli BL21 (DE3) como um padrão biológico com piscina cada amostra é aconselhado.

1. Cultura pura
   1. Descongelar as amostras, centrifugar durante 5 min à RT e 5.000 x g e descartar o sobrenadante.
   2. Resuspenda o pellet de células em PBS gelado por pipetagem repetidas e ajustar o OD_700nm de 0,035 (de comprimento de caminho_cubeta = 0,5 cm).
   3. Prepare as células para a coloração.
      1. Centrifugar 1 mL de suspensão de células ajustado durante 5 min à RT e 5.000 x g e descartar o sobrenadante.
      2. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de permeabilização contendo ácido cítrico de 0,3 M e 4,1 mM Tween20 e misture bem.
      3. Incube a amostra durante 10 minutos no gelo para criar permeáveis as membranas das células para a coloração subsequentes.
      4. Centrifugar a amostra durante 5 min à RT e 5.000 x g e descartar o sobrenadante.
   4. Adicione 1 mL de solução contendo 0.68 µM DAPI no buffer 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (289 mM Na₂HPO₄, 128 milímetros NaH₂PO₄ com bi-destilada H₂O, pH 7) de coloração, misture e incube durante pelo menos 15 min em RT no escuro.
      Nota: Ajuste preciso de OD é crucial para garantir medidas comparáveis, porque a fluorescência de DAPI variam com a densidade celular se a concentração de DAPI é mantida constante. O sobrenadante deve ser cuidadosamente removido devido a uma pelota geralmente frágeis para evitar a perda de células.
      Cuidado: Manuseie e elimine DAPI com cuidado devido a suas propriedades mutagénicas.
2. Comunidade de lodo ativado
   1. Homogeneizar a amostra fixa e transferir 0,6 mL para um tubo de vidro. Adicionar 1,4 mL de PBS e proceda à sonicação durante 10 min a RT, conforme descrito na etapa 1.3.3. Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 4 ° C e 3.200 x g e remover o sobrenadante. Adicione 2 mL de PBS e misture bem. Proceda à sonicação por 5 min.
   2. Ajustar o OD_700nm de 0,035 (de comprimento de caminho_cubeta = 0,5 cm) com PBS.
   3. Prepare as células para a coloração.
      1. Centrifugar a amostra durante 10 minutos a 4 ° C e 3.200 x g e remover o sobrenadante.
      2. Ressuspender as células em 1 mL de tampão de permeabilização contendo ácido cítrico de 0,11 M e 4,1 mM Tween20 e misture bem.
      3. Incube durante 20 min em RT para criar permeáveis as membranas das células para a coloração subsequentes.
      4. Centrifugar a amostra novamente por 10 min a 4 ° C e 3.200 x g e remover o sobrenadante.
   4. Adicionar 2 mL de solução de coloração contendo 0,68 µM DAPI e 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ amortecedor, homogeneizar e incubar a pelo menos 60 min em RT no escuro.
      Nota: É aconselhável o uso de tubos de vidro, como certos microorganismos tendem a aderir às paredes do tubo de plástico e podem ser perdidos durante o processo. Incubar durante a noite, também é possível e geralmente simplifica procedimentos de laboratório.
      Cuidado: DAPI precisa ser manipulados e eliminados com cuidado devido a suas propriedades mutagénicas.
3. Comunidade de biogás
   1. Suspenda o centrifugado secas em PBS.
      1. Adicionar 800 µ l de PBS, misture bem e deixe a pelota de molho por 15 min.
      2. Aspire a fase líquida, com uma pipeta de 1.000 µ l e mover a pelota encharcada a seção cilíndrica do tubo com a ponta da pipeta. Ele deve ficar lá.
      3. Mova a ponta da pipeta em um movimento circular para esmagar a pelota ao longo das paredes do tubo.
      4. Lave o chorume resultante das paredes do tubo por dispensar a fase líquida da ponta da pipeta ao longo da parede do tubo.
      5. Agite a suspensão por aspiração e suspendê-la três vezes dentro da pipeta.
   2. Lave a amostra com PBS duas vezes.
      1. Centrifugue por 5 min a 10 ° C e 4.000 x g e descartar o sobrenadante.
      2. Adicione 1.500 µ l de PBS e misture bem.
      3. Repita as duas etapas acima uma vez.
   3. Coloque os tubos em um banho ultra-sônico por 1 min, conforme descrito na etapa 1.3.3 e, posteriormente, filtrar cada amostra através de um filtro de malha de 50 µ l em um tubo de vidro individuais.
   4. Diluir 2 mL da amostra para OD_700nm 0,035 (de comprimento de caminho_cubeta = 0,5 cm) com PBS.
   5. Prepare as células para a coloração conforme explicado na etapa 2.2.3 acima.
   6. Adicionar 2 mL de solução de coloração contendo 0,24 µM DAPI e 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ amortecedor, homogeneizar e incubar durante a noite em RT no escuro.
      Cuidado: DAPI precisa ser manipulados e eliminados com cuidado devido a suas propriedades mutagénicas.

3. medição

Nota: Os conjuntos de exemplares da amostra foram analisados com dois citômetros diferentes. O PC e o ASC foram analisados com um classificador de célula centrado mais complexo, altamente ajustável e facilmente personalizável, pesquisa. Para a análise de PC, este dispositivo foi equipado com um laser definido como descrito no anterior publicação¹⁶, em suma, um azul (488 nm, 400 mW) e uma ultravioleta (364 – 334 nm, 100 mW) laser de íon argônio. Para a análise ASC, azul mais recente (488 nm, 400 mW) e ultravioleta (355 nm, 150 mW) lasers de semicondutores foram instalados. Em ambos os casos, o laser azul induzida SSC (bandpass filtro 488 nm ± 5 nm, filtro de densidade neutra 1.9, gatilho) e o FSC (bandpass filtro 488 nm ± 5 nm, filtro de densidade neutra 1,9). Estas características ópticas estão relacionadas com o tamanho da célula e a densidade celular, respectivamente. Os lasers UV animado a fluorescência de DAPI (bandpass filtro 450 nm ± 32,5 nm) para a quantificação do conteúdo de DNA celular. O sistema fluídico foi executado em 56 (3,86 bar psi) com a sobrepressão de amostra no máximo 0,3 psi e um bocal de 70 μm. Todos os parâmetros foram registrados como alturas de pico em vez de áreas de pico para melhorar a resolução de medição. O acompanhamento a longo prazo da comunidade de biogás foi conduzido com a menos complexa, cubeta de fluxo baseada, analisador de topo do banco. Um laser semicondutor ultravioleta (355 nm, 50 mW) foi usado para induzir o FSC (bandpass filtrar 355 nm ± 5 nm) e SSC (bandpass filtro 355 nm ± 5 nm, gatilho) sinais e excitar a fluorescência de DAPI (bandpass filtro 455 nm C). A água utilizada para o buffer de bainha de ambos os dispositivos foi bi-destilada e 0.1 µm filtrada. O PBS usado para diluição da amostra devem ser filtrados através de filtros de seringa 0,2 µm para reduzir o ruído de partículas nas medições tanto quanto possível.

1. Pura cultura e comunidade de lodo ativado
   1. Começar o instrumento, laser, computador e software e prepare-se para a análise da amostra.
      1. Ligue os lasers e concorrer a 15 min alcançar a temperatura de funcionamento e assegurar a estabilidade.
      2. Encha o depósito de bainha com 10x buffer de bainha (19mm KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 milímetros Na₂HPO₄, 1,39 M NaCl com bi-destilada H₂O) diluído com bi-destilada H₂O para um 0.2 x solução de trabalho (para célula classificação: 0,5 x solução de trabalho).
      3. Encha o sistema fluídico com 56 psi sobre pressão e o depósito de resíduos com aproximadamente vácuo de 6 libras por polegada quadrada.
      4. Execute o instrumento para mínimo 15 min no modo de proc para enxaguar o porto de amostra, a tubulação e o bocal.
   2. Calibre com contas padrão.
      1. Preparar as misturas do talão para a calibração na linear (1 μm μm azul + 2 amarelo-verde fluorescente) e escala logarítmica (0,5 μm e 1 μm azul fluorescente). Dilua a suspensão de grânulo das suspensões de estoque originais para atingir concentrações iguais.
      2. Continuamente medir a mistura linear do grânulo e encaixar os picos do grânulo para um modelo de calibração predefinidos manipulando o bocal e laser posições de óptica para pre-calibrar o instrumento no intervalo linear.
      3. Alterne para a escala logarítmica e medir continuamente o mix de grânulo logarítmica. Encaixe os picos de talão para seu modelo de calibração predefinidos para afinar o hardware do instrumento. Fazer ajustes finais para a posição do grânulo, usando o ajuste de ganho dos tubos fotomultiplicadores (PMTs).
      4. Verifique a posição do ruído instrumental e possivelmente ajustá-lo para caber o modelo de calibração.
         Nota: Um modelo de calibração fixo para a posição dos grânulos precisa ser preparado antes de um projeto de medição e não pode ser alterado (ver arquivo complementar 1-S4)! Ruído instrumental pode ser induzido por partículas da amostra ou o ruído eletrônico das PMTs e sempre vai ser gravado em algum grau. Não é aconselhável esconder o ruído completamente pelo ganho de ajuste ou trama do deslocamento. A abundância e a posição dos eventos ruído podem ser uma valiosa fonte de informações e, portanto, devem estar contidos em dados brutos. Amostras de partículas muito intensivo podem exigir a posterior remoção do ruído por motivos de análise de dados e plotagem. Controle a calibração em intervalos regulares durante um dia de medição para garantir a estabilidade do instrumento e, portanto, provar a comparabilidade.
   3. Medir uma amostra contendo o padrão biológico, conforme descrito em 2.1.4 (DAPI manchado Escherichia coli BL21 (DE3), amostrado e fixo durante a fase estacionária (16 h), de acordo com o protocolo ASC descrito em 1.2). Verifique a posição de pico em relação ao seu modelo de calibração predefinidos (ver arquivo complementar 1-S5).
      Nota: A coloração de rotina e de medição da norma biológica com cada pool de amostras também servirá como um controle interno para o processo de coloração. Se o dispositivo é calibrado usando grânulos e o padrão biológico não couber seu modelo de calibração predefinido, o procedimento de coloração provavelmente precisa de ser repetido.
   4. Aquisição de amostra.
      1. Execute a solução de coloração por 10 min enxaguar o porto de amostra e tubo e assegurar a estabilidade da fluorescência DAPI em amostras subsequentes.
      2. Filtre a amostra manchada com um filtro de malha de 50 μm antes da medição, para evitar o entupimento do bico citômetro ou fluxo capilar.
      3. Adicione a mistura de grânulo logarítmica à amostra para monitorar a estabilidade do instrumento e prever a possibilidade de uma verificação de calibração retrospectiva. As amostras devem conter entre 1.000 e 2.500 eventos em cada um dos portões de duas esferas.
      4. Crie um portal de célula no software do instrumento durante as primeiras medidas de teste de um novo conjunto de amostra. Este portão deve conter as células coradas e excluir o barulho e os grânulos.
      5. Misturar as amostras e mede-se a uma velocidade máxima de 3.000 eventos s^-1 até 250.000 células (comunidades) ou 50.000 células (culturas puras) são detectadas dentro do portão da cela.
         Nota: Essas contagens de células são escolhidas com base na experiência com a moda da amostra. Números diferentes podem ser usados para deslocar o equilíbrio entre a eficiência de medição e a detecção de subcommunities baixa abundância em qualquer direção.
         Solução de problemas: Súbita intramedição desloca do cordão de e posição da célula pode ser causada por bolhas de ar aprisionadas no bico. Isto exige a remoção e limpeza de bico e a lavagem do sistema fluídico com buffer de bainha. O instrumento deve ser reajustado após a remontagem do bocal (comece com o passo 3.1.2).
      6. O instrumento cuidadosamente com um tampão de bainha antes desligamento e amostras de comutação de proc.
2. Comunidade de biogás
   1. Arranque o instrumento, laser, computador e software para se preparar para a análise da amostra.
      1. Faça pelo menos 6 mL de tampão de bainha (bi-destilada H₂O) através da tubulação e Porto de amostra em um tubo frouxamente ligado usando a função de "prime de fluido bainha" do software do instrumento.
      2. Medir bi-destilada H₂O no 5 µ l s^-1 para enxaguar o sistema fluídico, até menos de 200 eventos s^-1 são detectados na taxa de fluxo regular de 0.5 µ l s^-1.
   2. Calibre o sistema.
      1. Prepare a mistura de grânulo (0,5 μm e 1 μm azul fluorescente). Dilua a suspensão de grânulo partir das soluções estoque originais para atingir concentrações iguais.
      2. Continuamente medir a mistura de grânulo na faixa de₄ log e encaixar os picos de talão para seu modelo de calibração predefinidos manipulando-se as posições de óptica de fluxo cubeta e laser. Fazer ajustes finais para a posição de grânulo com o ajuste de ganho das PMTs.
   3. Controle a calibração com o padrão biológico, conforme descrito na etapa 3.1.3.
   4. Aquisição de amostra.
      1. Diluir a 400 µ l de amostra manchada em 1.600 µ l de PBS, medir e monitorar a contagem de eventos para executar um teste de concentração.
         Nota: Taxas de diluição ajustado podem ser necessárias para outras fontes de amostra. A contagem de eventos não deve exceder 1.200 eventos s^-1 em amostras ricas de partículas para evitar a perda de resolução na dispersão para a frente (exemplo negativo no arquivo complementar 1-S2). Culturas puras podem ser medidas com até 2.000 eventos s^-1.
      2. Crie um portal de célula no software do instrumento durante essas primeiras medidas de julgamento. Este portão deve conter as células coradas e excluir o barulho e os grânulos.
      3. Dilua a amostra de acordo com os resultados do teste de concentração para executar no máximo 1.200 eventos total s^-1 e adicione a mistura de pérola com a amostra para monitorar a estabilidade do instrumento e prever a possibilidade de uma verificação de calibração retrospectiva. As amostras devem conter entre 1.000 e 2.500 eventos em cada um dos portões de duas esferas.
      4. Misture e medir a amostra até 250.000 células (comunidades) ou 50.000 células (culturas puras) são detectadas dentro do portão da cela.
      5. Enxágue o instrumento completamente com bi-destilada H₂O antes de desligamento e amostras de comutação.

4. célula de triagem

Nota: A célula classificação procedimento requer instrumento adicional instituído e é realizada de acordo com protocolos publicados¹².

1. Arranque e calibrar o instrumento como descrito em etapas 3.1.1-3.1.3, mas usar um 0.5 x solução de trabalho de buffer de bainha.
2. Defina a frequência DD e amplitude DD para encontrar o quebre-fora da gota.
3. Montar as placas de deflexão, acusá-los e decidir para 2-4-modo ou modo de classificação.
4. Executar a calibração de atraso de entrega interna com 2 grânulos de verde-amarelo μm para definir o intervalo de tempo que leva uma partícula ou célula para viajar desde o interrogatório apontam (célula de sucessos do laser) até a última gota anexada para o fluxo.
5. Classificar 20 grânulos de 6 vezes em um slide de vidro e contá-las com um microscópio para verificar a calibração de atraso de entrega.
6. Prepare o modelo de portão a classificação.
7. Uso o "modo único e gota a gota: maior pureza de 99%" a uma taxa não superior a 2.500 total eventos s^-1 para classificar 500.000 células no máximos 4 portas em um tempo (modo de classificação de 4-Way).
8. Recolher as células por centrifugação (20.000 x g, 6 ° C, 25 min) e congelar a pelota a-20 ° C para sequenciamento e posterior isolamento do DNA.
   Nota: Evitar a classificação de células nas portas com menos de 5% abundância relativa, como o tempo de classificação é inversamente proporcional da abundância relativa. Os passos individuais são descritos em detalhe no manual do classificador de célula. O número de células necessárias é fortemente dependente do uso respectivos casos e protocolos de extração. Inúmeros métodos foram aplicados: ddPCR (1.000 células^17,.¹⁹), 16S rDNA ou mcrA amplicon sequenciamento (500.000 células^6,10,15) e proteômica (até 1,1 x 10⁷ células ^16,17). A classificação de célula será particularmente vantajoso quando combinado com uma abordagem metagenomics devido à baixa diversidade nos subcommunities classificadas.
   Cuidado: Não toque nas placas de defletor durante o procedimento de classificação devido a tensões elevadas.

5. análise de dados

Nota: A medição cytometric produz "citometria de fluxo padrão".fcs arquivos de dados com uma estrutura de dados geralmente uniforme. No entanto, citômetro de diferentes fabricantes usa versões ligeiramente adaptadas e instrumentos mais velhos são anteriores ao 2010 introdução do mais recente FCS 3.1 padrão. Isso pode levar a trama do ponto problemas, que impedem a comparação direta dos resultados coletados com diferentes instrumentos de dimensionamento. No entanto, os pontos de dados individuais são sempre armazenados nas linhas de uma matriz, com a respectiva dispersão e valores de intensidade de fluorescência em colunas diferentes. Os pipelines de análise apresentado microbiome usam o distintivo célula tamanho e conteúdo de DNA para descrever subcommunities microbianas. Esses parâmetros estão correlacionados com as intensidades de canal de fluorescência FSC e DAPI (classificador da pilha: FL-4, analisador: FL-1) e resultado em clusters subcommunity quando visualizado em parcelas de fluorescência bidimensionais FSC vs DAPI. Estes lotes do ponto permitem a interpretação e análise de dados de citometria de fluxo e geralmente logaritmicamente são dimensionados. Eles podem ser exibidos de .fcs arquivos usando soluções de software ou de terceiros proprietários citômetro e são a base para o automatizado (Cytometric histograma imagem comparação, CHIC) e semi-automática (Cytometric Barcoding, CyBar) análise da Comunidade.

1. Comparação de imagens cytometric histograma
   Nota: O código, documentação detalhada e um manual para este pacote estão disponíveis em http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Eles também foram publicados²⁰.
   1. Instalar e carregar o pacote R, definir o diretório de trabalho que contém os arquivos de .fcs e configurar uma lista de arquivos executando:
      > fonte ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Defina o diretório de trabalho para o caminho onde se encontram seus arquivos FCS
      > # Digite o caminho para as citações
      > setwd("")
      > # Obter uma lista dos nomes de arquivo dos arquivos FCS localizados no seu diretório de trabalho
      > arquivos <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Obter uma lista dos nomes de arquivo dos arquivos FCS incluídos para o pacote
      > arquivos <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + total = TRUE, padrão = "*.fcs")
      > # Ler o primeiro arquivo de FCS como flowFrame
      > quadro < - Leia. FCS(files[1],ALTER.Names=true,Transformation=false)
      > # Obter uma lista dos nomes de parâmetro/canal
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. Crie imagens para dados brutos cytometric executando a função de pacote "fcs_to_img":
      > # Criar as imagens de histograma usando parâmetros padrão
      > fcs_to_img(files)
   3. Defina subconjuntos das imagens histograma executando a função de pacote "img_sub":
      > # Cria o histograma subconjuntos imagem usando parâmetros padrão
      > img_sub (ficheiros, ch1 = "FS. Log",CH2="FL.4.log")
   4. Calcule os valores de sobreposição e XOR para realizar a análise de imagem, executando a função de pacote "calculate_overlaps_xor":
      > # Guardar os nomes de todas as imagens de subconjunto como uma lista
      > subconjuntos <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Calcular sobreposição e imagens XOR e gravar valores para dois novos arquivos
      > resultados <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Crie não-métrica que multidimensional dimensionamento (NMDS) parcelas para análise de similaridade, executando a função de pacote "plot_nmds":
      > # Mostrar um enredo NMDS das amostras
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. Cytometric Barcoding
   Nota: O código, documentação detalhada e um manual para este pacote estão disponíveis em http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Eles também foram publicados^11,12.
   1. Desenvolva um modelo de portão principal para uso em todas as amostras.
      1. Carrega os arquivos de .fcs para o software de análise usando a funcionalidade de arrastar e soltar.
      2. Dê um duplo clique uma medição e escolher os parâmetros de eixos x e y nas listas dropdown respectivos para abrir um lote de fluorescência FSC vs DAPI.
      3. Use o ferramenta de desenho de polígono para reproduzir o portão de célula anteriormente usado para controlar o número de células analisadas em etapas 3.1.4.5 e 3.2.4.4 e nomeá-lo de acordo. Arraste a entrada do portão de célula na lista de amostra no grupo de todas as amostras para piscina.
      4. Clique duas vezes o portão da cela e corrigir a eixo de atribuição para visualizar os eventos de portão de célula.
      5. Definir os subcommunities predominantes no conjunto de amostra com a ferramenta elíptica gates, seguindo as orientações publicadas¹² e usar a varredura de CCD ou outro terceiro parâmetro²¹ para garantir a integridade do modelo de portão. Piscina, controlar e ajustar a alocação de subcommunity em outras amostras.
   2. Exporte as abundâncias relativas subcommunity em um arquivo. txt para uso no script R.
      1. Abra o editor de tabela com a guia Editar.
      2. Adicionar colunas para cada subcommunity que foi definido na etapa 5.2.1.5 e definir a estatística de saída para "frequência de pai" e nomeá-los.
      3. Crie a tabela no editor de"tabela" depois de escolher salvar formato e destino.
         Nota: O software de análise diretamente fornece abundâncias subcommunity relativo. Eles também podem ser obtidos através da divisão da contagem do evento no portão de subcommunity individual pela contagem de evento no portão de célula. Os valores devem ser salvos em uma matriz de delimitado por tabulação em um arquivo. txt que não pode conter quaisquer campos de n.a. e precisa atender a alguns requisitos adicionais para ser lido pelo código R (Veja o manual e o FAQ para obter instruções específicas).
   3. Instalar e carregar o pacote R e carregar os dados executando:
      > fonte ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Digite o caminho para as citações
      > setwd("")
      > # Carga dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # Visualizar dados
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. Normalize As abundâncias relativas ao executar a função de "normalizar" pacote:
      # Normalizar dados, imprimir 2 dígitos
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. Crie um código de barras do normalizado e um boxplot das abundâncias relativas originais executando a função de pacote "cybar_plot":
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Terreno com parâmetros padrão
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Crie uma trama NMDS das abundâncias relativas originais.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > Trama de # NMDS de números normalizados cel
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Crie a análise de correlação das abundâncias relativas normalizadas e outros parâmetros, executando a função de pacote "correlação":
      > # Carga dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > Valores de correlação # show
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Executar análise de correlação
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Nota: CHIC e CyBar dependem de abundâncias relativas. No entanto, citometria de fluxo pode também determinar números de célula absoluta, que podem ser de grande interesse para aplicações biotecnológicas. Para determinar o número de célula absoluta, o número de células no portão de interesse é dividido pelo volume da amostra analisada. O volume da amostra analisada pode ser determinado pela adição de suspensão do grânulo com uma concentração conhecida para a amostra (fórmula no arquivo complementar 1-S7). O analisador de bancada superior além disso é equipado com um recurso de contagem volumétrico verdadeiro que quantifica diretamente o volume do tubo de amostra durante a medição. É aconselhável usar um SYBR Green que mancha o protocolo para a contagem de células.

Results

Os seguintes resultados representativos enfatizam a necessidade de repetições e exemplificam técnicas de visualização e análise de dados diferentes em cada um dos três conjuntos de amostra. Eles mostram os resultados de dados possíveis condutas de avaliação adequado para responder às perguntas de pesquisa padrão sobre o respectivo conjunto. No entanto, as técnicas apresentadas não são exclusivas ao conjunto de amostra que são apresentados com. Os dados brutos de citometria de fluxo foi disponibilizados publicamente com ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Anteriormente inseridos dados ASC estão disponíveis sob ID FR-FCM-ZYD7.

Réplicas biológicas e técnicas foram tomadas, elaboradas e analisadas de acordo com protocolos publicados¹¹. Réplicas biológicas do PC e ASC foram retiradas três frascos paralelos. Réplicas biológicas do A.C. foram tomadas como três amostragens subsequentes em um local em uma planta em escala piloto. Três alíquotas de uma amostra foram fixadas, manchadas e analisadas para garantir a reprodutibilidade técnica. A reprodutibilidade dos métodos foi avaliada de acordo com os procedimentos anteriormente publicados¹¹. Um modelo de portão para todas as amostras do conjunto de uma amostra (arquivo complementar 1-S6) foi usado para calcular o desvio padrão (%) por porta.

Para o PC, o desvio-padrão máximo da abundância relativa foi de 3,44%, enquanto o desvio padrão da médio foi de 2,13% (Figura 1). Para o ASC e o BC, os desvios-padrão máximos das abundâncias relativas foram 1,27% e 0,88%, enquanto as médias dos desvios-padrão foram 2,13% e 0,21% (arquivo complementar 1-S8).

Um procedimento padrão, ao investigar uma cultura de linhagem pura, é a preparação de uma curva de crescimento para analisar a fase de retardo, tempos de geração e densidade celular sob condições específicas. Nós combinamos este procedimento com o fluxo cytometric análise fluxo de trabalho para alcançar uma compreensão mais profunda do sistema (Figura 2). O FSC vs DAPI fluorescência parcelas revelaram os Estados do ciclo celular da cultura em diferentes pontos da cultura em lotes. Um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6) foi estabelecido para quantificar a proporção de células com um (c1n), dois (c2n) e vários cromossomos (cXn, Figura 2B). A proporção predominante de células inoculadas tinha apenas um cromossomo (93,7% às 0h). Isto mudou drasticamente durante o crescimento exponencial, onde quase todas as células continham mais de um (99,6%, 4 h) e mais metade da população (53,1%) ainda continha mais de dois cromossomos. Isto ilustra p. putidas capacidade de replicar seus cromossomos mais rápido do que seu tempo de geração.

Análise de fluxo cytometric provou muito útil para monitorar a evolução das comunidades microbianas. Ele pode acompanhar a dinâmica da comunidade muito mais perto do que o mais recurso intensivo de métodos moleculares^5,10. Nós destacadas essas dinâmicas em um filme e ganhou uma visão geral sobre os turnos de comunidade de lodos ativados ao longo do tempo. Cada um segundo quadro mostra uma trama de fluorescência FSC vs DAPI de um ponto de amostra (arquivo complementar 2). Uma mudança muito distinta entre dia 0 e o dia 4 foi seguida pelo estabelecimento de uma comunidade de núcleo após dia 7. Subcommunities adicionais surgiu no dia 21. Estabelecemos um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6) que permitiu a avaliação da dinâmica microbiana em um nível de subcommunity. Os subcommunities dominantes em diferentes fases do experimento foram claramente identificados usando a ferramenta CyBar (Figura 3). Combinando-a com a distribuição de frequência das abundâncias relativa subcommunity ajudou a selecionar gates que são interessante (alteração significativa em abundância, desencadeada em um ponto chave de tempo) e viáveis (mais 5% de abundância relativa) para classificação e mais análise de²².

Aplicações de biorreator de escala industrial podem enfrentar potenciais heterogeneidades espaciais devido a limitações de agitação. Eles também frequentemente estão expostos a alteração de parâmetros operacionais, como alterações na qualidade dos substratos não-sintético. O BC representa um sistema desse tipo e foi amostrado de diferentes localidades em um reator de fluxo dinamicamente conduzido plug. Parcelas de fluorescência o FSC vs DAPI (Figura 4) dos pontos de amostra exemplar mostram apenas pouco espacial, mas pronuncia-se heterogeneidade temporal. O BC foi mais investigado usando ambos, o chique rápida automatizada e o modelo de portão mestre mais aprofundado baseado CyBar abordagem.

Sua natureza automatizada, rápida e imparcial, faz com que o CHIC particularmente interessante para o controle no local de Bioprocessos em um ambiente industrial. Ele compara dados crus .fcs de todas as amostras disponíveis. Dois dessas comparações são exibidos na Figura 5. Os valores resultantes de dissimilaridade confirmam as observações anteriores relativas à heterogeneidade espacial e temporal. A forma de parcelas geradas NMDS a matriz de dissimilaridade de ferramentas CHIC (Figura 6) mais fundamenta este resultado e visualiza-lo em conformidade.

Além disso, calculamos a abundância relativa de 23 subcommunities do A.C. usando um modelo de portão mestre (arquivo complementar 1-S6). Realizou-se uma análise de correlação de 48 amostras de um período de um ano para compreender as relações funcionais na comunidade microbiana. Isto pode ajudar a identificar portas de interesse para investigação futura (classificação de célula 4). Correlações positivas ou negativas com parâmetros abióticos como produto títulos podem ajudar a entender e otimizar os ecossistemas e processos biotecnológicos. A taxa de carregamento orgânico incluída nesta correlação (Figura 7) exemplifica um parâmetro tão abiótico. G5, G4 e G10 exibem correlações positivas e possivelmente poderiam conter espécies fermentativa, enquanto a correlação negativa no G8 pode dica para archaea metanogénicas.

Figura 1: reprodutibilidade de análise cytometric da pura cultura. Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas com grânulos de controle (A, B) e bar parcelas das abundâncias de 3 subcommunity [%] com barras de erro, que representa um desvio padrão de ± (C, D). As abundâncias relativas foram determinadas com o modelo de portão mostrado no arquivo complementar 1-S6. Três réplicas biológicas A, B e C foram tiradas da curva de crescimento em 4 h e três repetições técnicas P1, P2, P3 foram preparados da amostra A e medido três vezes, respectivamente: M1, M2, M3 e são dadas com seus respectivos desvios-padrão. 50.000 eventos foram gravados na porta da cela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: análise de ciclo celular de cultura pura, tirada durante uma curva de crescimento experimentar mais 12 h. (A). Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas das amostragens de bi-horária que apresentam uma mudança do conteúdo de DNA durante a fase de crescimento exponencial. Esta série de medição não inclui grânulos (ver arquivo complementar 1-S3). (B). curva de crescimento baseado na densidade óptica com barras de erro, que representa um desvio padrão de ± e abundâncias relativas nos subcommunities ao longo do tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: evolução da estrutura da comunidade de lamas activadas durante 24 dias. (A) a flowCyBar com a sobreposição de distribuições de frequência visualizadas em boxplots para as portas individuais que são organizadas pela semelhança das tendências, o correspondente cor chave (B) e uma análise de similaridade em uma trama NMDS sagacidade R < (0,001 C). os terrenos subjacentes são mostrados na sequência do filme em arquivo complementar 2. Abundâncias relativas foram determinadas utilizando o modelo de portão no arquivo 1 - S6 suplementares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: ficha de heterogeneidade espacial e temporal da estrutura da comunidade microbiana em escala industrial reator de fluxo biogás. Amostragem (A), a comparação da estrutura da comunidade microbiana dos quatro portas I-IV no dia 223. (B) a comparação entre as variações de estrutura comunidade dependente tempo do dia 0 ao dia 384 no porto II. O barulho foi cortado tardiamente para melhorar a visualização. 250.000 eventos foram medidos na porta celular (arquivo complementar 1-S6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: comparação da imagem histograma Cytometric — chique. O princípio do algoritmo CHIC é exemplificado pela comparação de duas amostras, representando a heterogeneidade espacial e temporal, respectivamente. (i) imagens CHIC são criadas a partir de arquivos de .fcs depois de selecionar dois parâmetros para exibir (fluorescência FSC vs DAPI). A escala de cinzentos (0-255) códigos a contagem de eventos em um pixel. (ii) CHIC subconjuntos são gerados depois de especificar a área que contém células (aqui: 200 < x < 4000, 200 < < 2200 de y). (iii) XOR combinação imagem é criada através da comparação de pixels entre os subconjuntos. Não há diferença é igual a 0 e é exibida como preto. Diferença máxima é igual a 200 e é exibida como branco. O correspondente valor do XOR é calculado somando os valores de escala de cinza de todos os pixels na imagem de XOR. (iv) sobreposição combinação imagem é criada adicionando-se os valores de tons de cinza dos pixels de subconjuntos. O valor de sobreposição correspondente é calculado contando os pixels de uma imagem de sobreposição que não igual a zero e, portanto, conter informações. (v) valores de dissimilaridade são calculadas dividindo valores XOR e sobreposição. Estas são a base para o enredo NMDS na Figura 6. Ambos os valores de dissimilaridade e o show de enredo NMDS um insignificante espacial- e uma comunidade temporal pronunciada heterogeneidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: CHIC com base em análise de similaridade das amostras comunidade biogás. A amostra de 0-dia foram excluída desta trama devido à sua estrutura extremamente diferentes comunidade distorcendo a análise (arquivo complementar 1-S11). O enredo NMDS confirma a suposição sobre baixo espacial- e maior heterogeneidade temporal feitas usando a ferramenta CHIC e explicado na Figura 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: análise de correlação na Comunidade biogás. A matriz foi calculada utilizando o coeficiente de ordem de classificação de postos de Spearman e baseia-se a abundância relativa de 23 subcommunities que foram determinadas com o modelo de portão mestre no arquivo complementar 1-S6. Eles foram correlacionados com a taxa de carregamento orgânico (OLR) para 48 amostras de um período de um ano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: análise de similaridade de planctônicos (P) e lamas com base em comunidades (S) nas águas residuais. Foram colhidas amostras da bacia de lamas clarificador primário (PCL), ativado (AS) e tanque digestor (DT) de uma planta de tratamento de águas residuais em grande escala (lotes do ponto no arquivo complementar 1-S10). Abundâncias relativas foram determinadas utilizando o modelo de portão mostrado no arquivo complementar 1-S6. Essas abundâncias subcommunity também foram analisadas com a ferramenta flowCyBar para criar um CyBar (arquivo complementar 1-S10) e NMDS plot (R < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: estabilidade de fixação da cultura pura. Amostras do experimento de curva de crescimento levado às 0h foram armazenadas a-80 ° C, com mais de 28 dias após a fixação em 15% de glicerol. Fluorescência de FSC vs DAPI parcelas com controle grânulos são mostrados. Série de medição não inclui grânulos (arquivo complementar 1-S3). 50.000 eventos foram gravados na porta celular (arquivo complementar 1-S6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo complementar 1: por favor clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo complementar 2: por favor clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Uma análise bem sucedida das comunidades e populações microbianas requer cytometers bem afinados, uma escolha adequada dos parâmetros da célula e um fluxo de trabalho confiável da amostragem e a fixação para a medição e dados de avaliação. Os parâmetros de célula selecionada devem consorciar-se com os comprimentos de onda de excitação disponíveis. Nós usamos e recomendamos DAPI, que é muito sensível em baixas concentrações; Mas precisa ser animado por um laser UV, que não é compreendido geralmente em citômetro padrão set-ups. Outros corantes, como o SYBR Green I, também mancha populações inteiras ou comunidades mas livrai geralmente resoluções inferiores. Não recomendamos usar procedimentos de peixe ou testes de viabilidade em comunidades microbianas. Essas abordagens são impossíveis de quantificar, verificar e controlar, porque seus efeitos em espécies individuais na Comunidade é incerto. Eles não podem ser confiavelmente testados, enquanto uma parte substancial das comunidades típicas é ainda não está disponível como uma cultura pura.

Passos críticos no protocolo incluem procedimentos de amostragem e fixação, bem como a classificação de célula. A amostragem pode ser complicada pela tendência de certas culturas puras e comunidades microbianas que agregam-se flocos ou aderir às partículas da matriz da amostra. É essencial para dissipar estes agregados e separar as células em uma amostra antes de apresentá-los para análise de fluxo cytometric para garantir resultados confiáveis. Os protocolos de preparação apresentados foram otimizados para permitir análise única célula. Filtração final 50 µm é executada antes da medição para remover qualquer residuais agregados e evitar o bocal de 70 µm de classificador de célula e a cubeta de fluxo do analisador de entupimento. Flocos de células de plantas de tratamento de águas residuais são especialmente abundantes, robusto e vital para a função do sistema. Nós investigamos o planctônicos e lamas com base em comunidades microbianas em tanques diferentes de uma estação de tratamento de águas residuais em grande escala, para testar o protocolo estabelecido. O lodo formando células agregados foram claramente se dissipou e a composição da Comunidade permaneceram estáveis. Além disso, as comunidades planctônicas e baseada em lodo exibiram notável semelhança entre eles em todos os três tanques amostrados (Figura 8, arquivo complementar 1-S10). Estes resultados foram verificados por comparativos 16S rDNA amplicon sequenciamento de um fresco, um formaldeído tratados-, fixado um formaldeído e etanol-e uma amostra classificada¹⁰. Não obstante, extraordinariamente desafiador de amostras ambientais, tais como biofilmes fortes ou bactérias que crescem nas cadeias bem ligadas, pode ser impossível de se dissipar. Amostras de solo podem ser particularmente problemáticas, como as partículas onipresentes aparecem no histograma e podem obscurecer as células pela enorme abundância. Em tais casos, métodos de sequenciamento tradicional precisam ser aplicado.

A estabilidade de fixação de cada novo conjunto de amostra deve ser testada antes de projetar o experimento para garantir a validade do resultado. Estabilidade de fixação boa também permite que o pool de coloração e medição de vários pontos de tempo de amostra em um único dia. Além disso, possibilita medições de replicação e retrospectiva célula classificação de pontos de tempo decisivo após a conclusão e avaliação final do experimento. A estabilidade da fixação da cultura pura foi verificada ao longo de 28 dias (Figura 9). Para experiências no local, incluindo o transporte da amostra, a estabilidade de fixação deve ser testada por períodos mais longos (no caso, 60 dias para a comunidade de lamas activadas, 195 dias para a comunidade de biogás, arquivo complementar 1-S9).

A coloração geralmente não é problemática, mas precisa ser controlada com um padrão biológico para permitir a aplicação das ferramentas de bioinformatic avaliação. Usamos a cepa trocista Escherichia coli BL21 (DE3), que foi fixado de acordo com o protocolo ASC e armazenadas para uso em cada lote de coloração.

Além de DAPI, SYBR Green eu já foi aplicado com sucesso para resolver as comunidades microbianas por vários anos^{14,23,24,25,26}. SYBR Green que posso solucionar comunidades em subconjuntos de alta e baixa de ácidos nucleicos (HNA e LNA) usando células vivas em um modus on-line. DAPI, no entanto, é mais específico na sua ligação ao DNA e permite a distinção de mais de 50 subcommunities em conjunto uma amostra mas requer uma etapa de fixação antes da coloração.

Classificação de célula é uma característica marcante desta abordagem e pode ser aplicada se certos subcommunities são de mais interesse. Isso precisa ser enfatizado que nem PFA-(interpretada por apenas 30 min), nem tratamento de etanol ou DAPI coloração¹⁰ teve um efeito negativo sobre o sequenciamento de amplicons 16S subsequentes. Potencial influencia da fixação e coloração procedimentos na subcommunity metagenome análises ainda precisam ser testados.

Um monte de informações sobre as funções de comunidade e tendência dinâmica pode ser obtido independente da abordagem classificação quando envolvendo ferramentas de Bioinformática que resolver recursos da Comunidade num nível de célula por célula virtual e conectar esses recursos com abiótico parâmetros.

Recentemente, uma série de novas ferramentas de avaliação de bioinformática, muito útil para ambos o SYBR Green I e as abordagens DAPI, foram desenvolvidos para resolver padrões de comunidade cytometric. Estes são FlowFP²⁷, os pacotes usados neste estudo (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), um modelo de deconvolução estabelecido com água fresca comunidades²⁹ e uma ferramenta usada para discriminar cepas de acordo com seus fisiológicos características de³⁰. Além disso, cytometric diversidade pode ser determinado²⁵ e estabilidade mesmo Propriedades de comunidades microbianas agora podem ser seguidas com uma ferramenta on-line¹⁰.

Assim, análises de fluxo cytometric têm uma enorme vantagem quando se trata de avaliação rápida das comunidades microbianas e parâmetro abióticos possíveis correlações. No entanto, ainda existem limitações para o método. Não pode ser aplicada de forma verdadeiramente on-line, com a ferramenta flowCyBar, devido ao processo de configuração de portão com base experiente. Além disso, o desenvolvimento de citômetros feitos sob medida, fácil de usar muito avançou a proliferação da abordagem de análise de fluxo cytometric microbiome. Primeiros passos neste sentido são realizadas²⁸.

Futuras aplicações da citometria de fluxo microbiano podem ser vislumbradas em ecologia microbiana, que permite alta frequência de monitoramento dentro da escala de tempos de geração bacteriana e tem sido demonstrado que paradigmas ecológicas são aplicáveis aos dados cytometric^{5 ,10}. O método é muito útil para as sessões de rotina de ambientes naturais, como os controles obrigatórios de água potável na Suíça³¹. Também pode ser uma ferramenta valiosa para aplicações médicas como humano¹⁵ ou animal³² microbiome triagem. Além disso, desenvolvimentos mais recentes em Bioinformática podem permitir citometria de fluxo microbiano ser um sensor integral nos controles do processo de sistemas gerenciados microbianos. Citometria de comunidade microbiana também fornece uma ferramenta de triagem para classificação de célula, que permite maior resolução investigações genômicas de subconjuntos específicos de comunidade.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema Milli-Q Synthesis A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter	Beckman-Coulter, Brea, Califórnia (EUA)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (EUA)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, Califórnia, EUA		355 nm, 150 mW
Tubos fotomultiplicadores R928 e R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japão)
Software	Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, Califórnia (EUA)
1 e micro; m  Sondas Moleculares FluoSpheres	, Eugene, Oregon (EUA)	F8815	350/440 azul fluorescente
2 μ m YG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (EUA)	F-8827	505/515 contas fluorescentes verde-amarelas
0,5 μ m Microesferas de carboxilato Fluoresbrite BB	PolyScience, Niles, Illinois (EUA)	18339	360/407
1 μ m Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres	PolyScience, Niles, Illinois (EUA)	17458	360/407 azul fluorescente
1 µ Sondas Moleculares mYG FluoSpheres	, Eugene, Oregon (EUA)	F-13081	505/515 contas fluorescentes verde-amarelas
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)	CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japão)
UV Laser Genesis CX,Coherent	, Inc, Santa Clara (EUA)		355 nm, 150 mW
H6779-32 série PMTs	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japão)
FloMax software	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
todos os filtros ópticos	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (EUA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (EUA)		Número de compilação: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html