Condicionamento clássico curto-atraso Eyeblink em crianças de um ano de idade

Resumo

Este protocolo descreve um eyeblink condicionado paradigma adequada para experiências com crianças de um ano de idade. Equipamento comercial ou feitos sob medido pode ser usado para entregar os estímulos, e análise e coleta de dados devem ser realizadas sobre as gravações de vídeo.

Resumo

Eyeblink clássico condicionamento (EBC) refere-se à associação entre um estímulo condicionado (um sinal auditivo) e um estímulo unconditioned (um sopro de ar para a córnea) aprendeu. Eyeblink condicionado é frequentemente utilizado experimentalmente para detectar anormalidades na cerebelar dependentes de aprendizagem e memória subjacente a este tipo de aprendizagem associativa. Enquanto as experiências em adultos e crianças mais velhas são relativamente simples de administrar usando equipamento comercial, eyeblink condicionado em lactentes é mais desafiador devido à sua conformidade pobre, que faz o correto posicionamento do equipamento difícil. Para atingir o condicionamento em bebês de um ano de idade, uma medida e um sistema comercial adaptado pode ser usado para entregar o ar sopro córnea da criança. O principal desafio reside na detecção e classificando as respostas comportamentais com êxito. Nós relatamos que métodos de deteção de piscar automatizados não são confiáveis nessa população, e que o experimentos de condicionamento deve ser analisado usando análise de frame-por-frame de gravações de câmera de vídeo suplementar. Esse método pode ser aplicado para estudar alterações do desenvolvimento em eyeblink condicionado e examinar se esse paradigma pode detectar as crianças com distúrbios neurológicos.

Introdução

EBC é uma forma de condicionamento clássico que é comumente usado para avaliar a aprendizagem e a memória em humanos e outros animais. O paradigma convencional do EBC refere-se a uma sábio associação entre um estímulo inócuo 'condicionado' (um sinal auditivo), com o estímulo 'incondicionado' (um sopro de ar da córnea que induz uma eyeblink reflexiva, a resposta de unconditioned). Aprendizagem associativa é avaliada por apresentar o estímulo condicionado e classificando eyeblinks como condicionado e unconditioned respostas, um aumento do número de respostas condicionados ao longo do tempo, ou mais mais do que uma sessão, pode indicar associativa aprendizagem está ocorrendo.

O eyeblink paradigma de condicionamento pode ser usado para identificar indivíduos com deficiências de aprendizagem associativa. Atraso condicionado-onde o estímulo condicionado (CS) começa antes mas se sobrepõe o estímulo unconditioned (EUA)-é controlada pelo circuito cerebelar^1,2e é interrompida em adultos e crianças com distúrbios neurológicos, incluindo a esquizofrenia³, autismo^4,5e^76,transtorno do espectro álcool fetal. Do ponto de vista clínica, examinar o eyeblink condicionado nos infantes pode oferecer suporte anterior detecção e tratamento destes transtornos neurológicos. No entanto, enquanto as crianças mais velhas podem tolerar um ar corneal sopro^6,7,8 e podem manter uma posição estável cabeça/olho para a duração do experimento, crianças são menos complacente e convencional software e equipamento de detecção de eyeblink não é suficiente.

Aqui descrevemos um protocolo simples para examinar curto-atraso eyeblink condicionado em crianças de um ano de idade, que foi adaptado da protocolos descrito anteriormente em outro lugar^9,10,11. Este protocolo pode ser administrado utilizando qualquer sistema comercial ou feitos sob medido, capaz de entregar um sopro controlado de ar para a córnea. No entanto, no lugar de software de detecção de eyeblink comerciais (por exemplo, sistema de detecção de EyeBlink do instrumento de San Diego, que processa os sinais de uma câmera infravermelha), nós e os outros^9,10,11, recomendo usar o quadro-a-quadro análise de gravações de câmera de vídeo para detectar e classificar eyeblink respostas em bebês de um ano de idade.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo norte o B saúde e Comitê de ética da deficiência, número de referência: 13/NTB/181.

1. técnicos requisitos

1. Use uma unidade de sopro de ar capaz de administrar um sopro de ar diretamente para a córnea. Isto pode ser conseguido usando um flexível tubo ligado a um ar tanque através de um compressor de ar. Para garantir a segurança da criança, encaixar isso com um regulador de pressão ajustável que restringe a pressão de ar e limites de duração do sopro de ar.
   Nota: Sistemas comercialmente disponíveis incorporam o compressor dentro do sistema e não necessitam de um tanque de ar.
2. Use uma cinta de cabeça ajustável ou chapéu que pode ser usado pelo Infante e permite o posicionamento adequado do sopro de ar tubo ao lado do olho.
3. Configure dois altifalantes portáteis com configurações de volume ajustável.
4. Projetar e configurar controle computacional do equipamento para que o sopro de ar e Tom pode ser administrado automaticamente com sincronismo preciso e em intervalos variáveis.
5. Configure uma câmera de vídeo portátil pelo menos uma taxa de quadros de 60 Hz para registrar manualmente o eyeblink respostas. Para medir tempos de resposta, use uma câmera de vídeo que pode capturar o início do julgamento, gravando o Tom audível ou por filmar um indicador de julgamento de início programado para o pacote de software.
6. Instalar e executar qualquer software de edição de vídeo que permite que o frame-por-frame pisando de componentes de áudio e vídeo (por exemplo, Adobe Premiere Pro) para permitir que o pesquisador medir o intervalo de tempo entre o estímulo e a resposta de piscar.

2. experimental paradigma

1. Administre ensaios em blocos de 10. Cada bloco deve conter os seguintes tipos de julgamento.
   1. Incluem oito ensaios emparelhados, onde cada tentativa de aprendizagem consiste em um tom de 750-ms (80 dB, 1 kHz) que se sobrepõe e encerra com um 100 ms ar sopro (~1/20 psi)^9,10,11.
   2. Incluem um julgamento não pareado, que consiste em um tom único 750-ms apresentado sozinho na ausência do sopro de ar para testar uma resposta condicionada eyeblink indicando aprendizagem associativa.
   3. Incluem um julgamento somatossensorial consistindo de um julgamento de sopro de ar único 100 ms apresentado sozinho na ausência do Tom para testar a sensibilidade da córnea para o sopro de ar e o posicionamento correcto da cinta de cabeça.
2. Randomize o intervalo entre testes consecutivos (por exemplo, 8-16 s, com um intervalo de tempo médio de julgamento de aproximadamente 12 s)^9,10,11.
3. Mede cinco blocos consecutivos (ou seja, um total de 50 ensaios) em uma única sessão, por um tempo de sessão total de cerca de 12 min.
4. Para testar se condicionado persiste, administre duas sessões EBC de 50 ensaios pelo menos 1 h separados.

3. o procedimento de teste

1. Execute EBC em uma sala moderadamente iluminada (~ 300 lux) com níveis de iluminação consistente entre as experiências.
2. Posição os dois alto-falantes portáteis em ambos os lados do Infante, aproximadamente 40 cm de cada lado da cabeça.
3. Coloque o arco feito por na cabeça da criança e ajustar para o tamanho da cabeça.
4. Posicione o tubo flexível de segurar o bocal de sopro de ar e sensor infravermelho adjacente para que estas são aproximadamente 1-3 cm do olho direito da criança em um ângulo de ~ 45° do plano axial da cabeça (Figura 1).
5. Antes de iniciar o experimento, verificar que a montagem experimental é otimizada para fornecer o ar corneal puff. Entregar um ar de teste único sopro ao olho do bebê e observar se um eyeblink ocorre e é visível na câmera de vídeo. Se nenhum eyeblink for observado, ajuste o posicionamento da cabeça para que a unidade de sopro de ar é mais perto do olho.
6. Registre respostas de eyeblink do bebê durante toda a duração do experimento. Posicione a câmera de vídeo para que o campo de visão é direcionado para os olhos da criança. A câmera deve estar perto o suficiente para discernir os movimentos dos olhos pequenos, mas não tão perto de tal forma que a criança pode mover fora da moldura, se ele/ela se torna exigente.
7. Certifique-se dos que experimentadores são mascarados com o tempo de estímulo. Se a interface de usuário do EBC indica quando ocorrerá o próximo julgamento, pedir o pesquisador para orientar-se longe da interface do computador, para que eles não estão cientes quando o estímulo seguinte ser-lhe-á entregue. Isso impedirá o pesquisador de responder aos estímulos próprios e potencialmente contribuindo para respostas aprendidas da criança.

4. otimizando a montagem Experimental para crianças de um ano de idade

1. Certifique-se de que dois pesquisadores estão disponíveis para realizar o experimento.
2. Quando colocar a bandelete da cabeça da criança, pergunte o cuidador para posicionar a criança no seu colo virada para o lado. Isso permite que o pesquisador a abordagem do lado e atrás da cabeça da criança, enquanto um segundo pesquisador acopla o infante.
3. Colocação da cinta de cabeça e o posicionamento do bocal devem ser realizadas como rapidamente e calmamente quanto possível garantir o respeito da criança. Colocando uma mão sobre a ponta do bico impede que a criança virando a cabeça o bocal durante o posicionamento.
4. Manter a criança no colo do cuidador durante todo o experimento.
   Nota: Enquanto uma cadeira alta pode fornecer um ambiente mais consistente entre experiências, isto pode aumentar a ansiedade e reduzir a conformidade em muitas crianças.
5. Para infantes inclinados a interferir com a bandelete da cabeça durante o experimento, use distração suave.
6. A bandana comumente se move durante o experimento. Se a criança não está respondendo ao ar sopro ou a bandelete da cabeça mudou significativamente longe o olho, pausar o experimento e ajuste a posição da cabeça antes de continuar.
7. Incentivar a criança a olhar durante o experimento, a fim de aumentar a amplitude dos movimentos eyeblink; desta forma, deteção de eyeblink pode ser melhorada.
   Nota: Isto pode ser conseguido colocando o bebê na frente de um monitor jogando um vídeo infantil de amigável (por exemplo, uma caricatura de idade apropriada com o áudio desligado) ligeiramente acima de sua linha de visão.

5. Eyeblink deteção usando gravações de câmera de vídeo

1. Deixe dois pesquisadores definir independentemente das respostas eyeblink para cada experimento.
2. Use o software de edição de vídeo para analisar cada julgamento para uma latência de 2.000-ms após o início do julgamento.
3. Use a áudio de forma de onda para detectar o primeiro quadro do início do julgamento.
   1. Para o par (CS + U.S.) e desirmanados ensaios (apenas para o CS), definir o início experimental desde o início do Tom audível.
   2. Para os ensaios somatossensorial onde só os EUA (sopro de ar) é apresentado, realize pré-testes para assegurar que o microfone da câmera pode detectar o barulho sutil 100 ms criado pelo sopro de ar. Caso contrário, vídeo gravação do indicador de início julgamento programado no software pacote ajudarão em detectar o aparecimento de sopro de ar.
4. Use a faixa de vídeo para detectar a resposta de piscar. Gravar a latência de piscar como os seguintes: Blink aparecimento, o primeiro quadro onde as pálpebras começam a fechar; Pico, o primeiro quadro, onde as pálpebras estão fechadas màxima de piscar.
5. Conforme necessário, desenvolve estratégias para lidar com respostas ambíguas. Consulte os exemplos a seguir.
   1. Razoavelmente exclua pisca parcial, que pode ocorrer quando as pálpebras não conseguem fechar completamente por mais de ~ 50%.
   2. Exclua os ensaios em que o aparecimento de sopro de ar/Tom está escondido por ruídos estranhos, ou onde a resposta de piscar é obscurecida da vista, mais análises.
   3. Em ensaios onde várias piscadas são observadas, analise a primeira resposta de piscar após o início do julgamento.
6. Registre o número de quadros de vídeo entre o aparecimento do estímulo e o pico de piscar. Converta a latência em tempo real com base na taxa de amostragem de câmera de vídeo.

6. EBC resposta classificação

1. Após a detecção desses julgamentos no qual ocorreu uma resposta eyeblink, defina o tipo de blink, com base na sua latência relativo para o aparecimento do estímulo (Figura 2).
   1. Definir um piscar como uma resposta de assustar se ele ocorre dentro do intervalo de 200-ms a primeira após o sinal; Estes representam um reflexo em resposta ao sinal auditivo ou pisca que é cronometrada coincidentemente com o aparecimento de Tom que teria ocorrido independentemente o sopro de ar.
      Nota: Alarme respostas podem ser observadas para o emparelhados (CS + U.S.) ou da marcação sem paridade ensaios (apenas para o CS), onde o Tom auditivo é entregue.
   2. Definir uma piscada como resposta somatossensorial se ocorre em resposta ao sopro de ar; indica se a córnea é sensível para o sopro de ar com a configuração atual do capacete. Este é um tipo de resposta unconditioned (veja abaixo).
   3. Defina unconditioned respostas como respostas somatossensorial para os ensaios de sopro durante emparelhados (CS + U.S.) do ar que ocorrem mais de 650 ms após o início do Tom.
   4. Defina respostas condicionados como pisca que é otimamente cronometrada para coincidir com o sopro de ar. Eles são iniciados entre 350 e 650 ms após o início de Tom para os testes pareados ou não pareados e indicam que a aprendizagem associativa entre o CS e EUA pode ter ocorrido.
   5. Definir um julgamento como falhou respostas se não piscar foi detectada em resposta ao sopro de ar; Estas podem ser observadas para o emparelhados (CS + U.S.) ensaios ou ensaios somatossensorial. Essas respostas indicam que o sopro de ar não atinja o olho.

7. análise de aprendizagem associativa

Nota: Um número de métodos têm sido descrito anteriormente para avaliar aprendizagem associativa^9,10,11 (brevemente descritos aqui). Pesquisadores devem modificar esses métodos ou desenvolver seus próprio para definir se aprendizagem associativa ocorreu, dependendo do seu projeto experimental.

1. Primeiro, exclua os ensaios em que foi coletados sem dados utilizáveis, tais como aqueles com erros técnicos.
2. Calcule a sensibilidade para o sopro de ar calculando a percentagem de respostas eyeblink de todos os possíveis ensaios somatossensorial.
3. Avalie aprendizagem associativa ocorreu durante o experimento, comparando a porcentagem de respostas condicionados em blocos sequenciais de 10 ensaios. Um aumento da percentagem de respostas condicionados ao longo do experimento pode indicar condicionado ocorreu.
   Nota: Como alternativa, modelagem a mudança em latências eyeblink ao longo do tempo poderia ser usado para avaliar se a criança se adaptou seus tempos de resposta durante o curso do experimento.
4. Avalie aprendizagem associativa está ocorrendo nas sessões experimentais ou entre dois grupos experimentais. Use um critério arbitrário para definir se o condicionado ocorreu (por exemplo, > 40% condicionados respostas dentro de uma sessão experimental)^6,9.

Resultados

Capacidade de teste de condicionamento Eyeblink em crianças de um ano de idade:

A montagem experimental necessária para examinar o eyeblink condicionado é um desafio para as crianças de um ano de idade. Nos experimentos conduzidos, 35% (11 infantes) falha ao participar na experiência, porque eles não tolerariam vestindo uma bandolete ou receber o sopro de ar para a córnea (n = 31 infantes tentadas). Cerca de metade (52%, n = 16 lactentes) concluído ou parcialmente concluído o primeiro conjunto de 50 ensaios (mediana [IQR] = 22,5 [0 - 50] ensaios concluídos). O restante participou de duas sessões experimentais.

Atingir resultados experimentais de confiança requer posicionamento correto da unidade de sopro de bandana e ar durante todo o experimento. Para aquelas crianças que participam na experiência, entrega de sopro de ar para a córnea pode ser alcançada para a maioria dos ensaios (77 ± 6% de sopros de ar induziu uma resposta de piscar; n = 13 ensaios de sopro de ar de infantes/557 tentados). Os testes restantes representam 'falhou testes', em que a criança não foi sensível para o sopro de ar.

A Figura 3 ilustra o sucesso de entrega de sopro de ar durante dois experimentos de condicionamento de 50 ensaios. O número de eyeblinks observados é descrito como uma porcentagem dos julgamentos de sopro de ar (ou seja, ensaios ou somatossensorial ou emparelhados). Pisque respostas desde a primeira queda infantil em cada bloco sucessiva de 10 ensaios, indicando que a bandelete pode foram sub-optimizada posicionada no final do experimento. Em contraste, a segunda criança ilustra a sensibilidade relativamente boa para o sopro de ar, pelo menos 90% dos ensaios de sopro de ar com sucesso, provocando uma resposta de piscar em cada bloco subsequente de 10 ensaios.

Taxas de sucesso de detecção eyeblink usando análise de câmera de vídeo:
Uma câmera de vídeo portátil fornece um método confiável de capturar eyeblink respostas, permitindo que o pesquisador controlar manualmente os olhos da criança. Análise do frame-por-frame manual foi usado para identificar respostas de 90 ± 3% dos julgamentos (n = 13 ensaios de infantes/608 tentados). Os testes restantes representam aqueles em que os olhos da criança ficaram ocultos durante as filmagens.

Embora a análise de vídeo requer interpretações subjetivas, este método pode ser usado para medir confiavelmente eyeblink latência desde o início do estímulo. Nossa análise de tempos de resposta de piscar medido por dois observadores independentes ilustra boa confiabilidade inter avaliador através do qual a diferença média entre as medições foi 28,4 ms e limite de 95% do acordo de ± 263,9 ms (Figura 4: n = 4 as experiências analisadas por dois observadores/94 piscarem respostas). Considerando que eyeblinks condicionados são definidos como aqueles que caem dentro de uma janela de 300 ms, isto permite uma precisão suficiente para distinguir condicionados de unconditioned respostas. Observe que esses ensaios com desacordo significativo podem ser facilmente reavaliada após consulta entre os observadores.

Eyeblink condicionado em bebês de um ano de idade:
O condicionamento de dois experimentos, mostrados na Figura 5A e 5B ilustram as latências de resposta eyeblink ao longo do experimento para ambos os testes emparelhados e não emparelhados. As eyeblink respostas do primeiro bebé durante o primeiro pico de sessão EBC após o início do sopro do ar e do lado de fora da janela de latência que define uma resposta condicionada. Além disso, esta criança não responder a qualquer um do desirmanada ensaios (som apenas). Juntos, isso indica que esta criança ainda não aprendeu a associar o Tom e o ar sopro durante sua exposição inicial ao paradigma da EBC. Em comparação, a segunda criança, quem participa em sua segunda sessão EBC, rotineiramente pisca antes do início do sopro de ar e responde a todos os ensaios não pareados, indicando que a criança alcançou eyeblink condicionado após a sessão inicial de 50 ensaios. A Figura 5 ilustra um método típico de avaliação de aprendizagem associativa ao longo de vários ensaios de sessões^6,9,10,11. O número de respostas condicionados de ambos os infantes é descrito em blocos sucessivos de 10 ensaios e como uma porcentagem de todos os ensaios emparelhadas e não emparelhadas em cada bloco. Neste caso, ambos os infantes mostram alterações mínimas na aprendizagem associativa durante o experimento, ilustrar uma falta de condicionamento (infantil 1, sessão 1) ou aquele condicionado já ocorreu (infantil 2, sessão 2).

Figura 1 : Eyeblink condicionado set-up com um participante infantil de um ano de idade. O arco feito por apoiar a unidade de sopro de ar é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Estímulos e resposta as definições para uma paradigma de condicionamento eyeblink apropriado para experiências com crianças de um ano de idade. (A) durante os ensaios emparelhados, um tom audível 750-ms (estímulo condicionados [CS]) sobrepõe-se e termina com um sopro de ar de 100 ms (unconditioned estímulo [US]). Respostas de piscar variam de acordo com seu calendário relativo para o aparecimento do estímulo (assustar resposta: 0 - 200 ms; resposta condicionada [CR]: 350-650 ms; unconditioned resposta [UR]: 650-2.000 ms). Definições de resposta são idênticas para ensaios de (CS apenas) da marcação sem paridade. (B) ensaios somatossensorial entregam um ar único 100 ms (nos) sopro apenas, e pisca que ocorrem dentro de uma janela de 300-ms é classificada como respostas somatossensorial (SSR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Exemplo de eyeblink condicionado experiências em bebês de um ano de idade, ilustrando a variação na sensibilidade de sopro de ar. A sensibilidade para o sopro de ar é descrita como o número de respostas observadas para o sopro de ar (entregado um julgamento somatossensorial ou como um julgamento emparelhado) como uma porcentagem de todos os ensaios de sopro de ar, em cada bloco subsequente de 10 ensaios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Bland-Altman plot ilustrando o acordo em tempos de resposta de piscar medido a partir de gravações de câmera de vídeo por dois observadores independentes. Linhas cinzentas indicam o preconceito entre as medições (definidas como a diferença média entre medições) e os limites superiores e inferiores do acordo (LOA, definido como os diferença média ± 1,96 desvios-padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Exemplo de eyeblink condicionado experiências em bebês de um ano de idade, ilustrando a variação nas respostas condicionados. Tempos de resposta de piscar são mostrados para o emparelhados (CS + U.S.) ensaios (círculos pretos) e da marcação sem paridade (só CS) ensaios (quadrados cinzentos). A barra cinza indica a altura do sopro de ar e as linhas pretas indicam a latência entre 350-650 ms usado para definir uma resposta condicionada. Ensaios que não conseguiram obter uma resposta são mostrados no x-linha central. (A) piscar respostas geralmente caem fora da janela de condicionamento, e ensaios desirmanados falharam eliciar uma resposta eyeblink. (B) respostas são adequadamente cronometradas para coincidir com a ocorrência do sopro de ar, e respostas não pareadas e ensaios emparelhados iniciam uma resposta condicionada. (C) condicionado ao longo do experimento é ilustrado como o número de respostas de condicionada (descrita como uma porcentagem de todos os ensaios emparelhadas e não emparelhadas), em cada bloco sucessivo de 10 ensaios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Modificações e solução de problemas:
Eyeblink comercial ou feitos sob medida, sistemas de condicionamento deve apresentar o assunto de uma forma controlada experimentalmente os estímulos e ser capaz de detectar as respostas comportamentais. Embora este seja um procedimento não-invasivo, os requisitos técnicos para a realização dessas experiências em populações menos compatíveis (por exemplo, crianças) é um desafio. Fisicamente, anexar o cabeça-mount para o olho é possível para experiências em animais, tais como condicionamento experimentos em ovelhas^12,13. Crianças mais velhas podem tolerar usando um headband com um ar anexada puff entrega unidade^6,7,8 e podem ser incentivadas a manter uma posição constante olho usando a televisão como uma distração. Apesar de conformidade em bebês muito jovens pode ser alcançada pelo condicionamento durante sono¹⁴, lactentes mais velhos, aproximando-se um ano de idade geralmente são facilmente distraídos, tornando-os uma população excepcionalmente desafiador. Apesar dos desafios, eyeblink condicionado experiências são possíveis para algumas crianças acordadas, um ano de idade. Nossas taxas de sucesso são semelhantes aos anteriormente relatados na literatura (~ 40% - 50% de conformidade)⁹, com a probabilidade de sucesso provavelmente refletida pelo temperamento da criança no dia do experimento.

Passos críticos dentro do protocolo:
Recomendamos adaptar um set-up EBC comercialmente disponíveis, ou usando um gerador de pressão de ar Custom-Built como descrito anteriormente, para crianças mais jovens^9,10,11. O desafio inicial é manter a unidade de entrega de sopro de ar na posição correta durante todo o experimento, o que exige uma menor, modificado de capacete. Olho a segurança é uma preocupação particular para lactentes não conformes que tentam remover o capacete se. Portanto, lactentes devem ser monitorados de perto em todos os momentos. Uma proporção de crianças não tolerará usando a bandana ou receber o sopro de ar para o olho (aqui, ~ 35%), embora isto possa ser melhorado por distracção suavemente o Infante se o protocolo experimental permite isso e se isso não interfere abertamente com a criança comportamento. Para as crianças que tenham concluído o experimento, ar-sopro somente ensaios são essenciais para confirmar que o capacete foi posicionado corretamente, como falta ou inversão de condicionamento de respostas pode ser causada por pobre entrega do sopro de ar durante todo o experimento.

Enquanto a análise de vídeo manual é demorado, medidas automatizadas de respostas eyeblink infantil são atualmente difícil de alcançar. Sensores infravermelhos fornecidos com afinações EBC comerciais (posicionadas na bandelete da cabeça adjacente à unidade de sopro de ar) gravar a reflectância de momento a momento da córnea com uma taxa de amostragem de 1 kHz, e pisca pode ser detectada medindo-se a mudança de reflectância após o aparecimento do estímulo. Alterações significativas de reflectância de base indicam que uma eyeblink ocorreu, e análise automatizada pode ser usado para detectar e classificar as respostas de piscar. No entanto, nós e os outros^9,10,11 sugerem que os pesquisadores não devem confiar em medições de reflectância corneal infravermelho fornecidas com set-ups EBC comerciais para detectar pisca em crianças de um ano de idade. Enquanto este método pode ser adequado para participantes adultos ou mais velhos crianças^6,7, fomos capazes de detectar confiavelmente pisca em um ano de idade usando esse método. Aqui, observa-se insignificante mudança na reflexão de base ao longo do comprimento da época do julgamento, indicando que o eyeblink não é detectado pelo sensor de infravermelho. Além disso, picos de positivos falsos são comumente observados, que são causadas por movimentos da cabeça da criança que alterar o posicionamento do sensor. Piloto de testes em adultos sugere que o participante deve centrar-se na ou ligeiramente acima de sua linha de visão horizontal, com a unidade de sopro ar posicionada dentro de 1 a 2 cm da córnea, para detectar com sucesso as eyeblinks-condições que não podem ser mantidas consistentemente com uma criança. Além disso, o tamanho da pequena fissura hiperemia em lactentes pode reduzir a reflectância da córnea, tornando a detecção de piscar mais difícil do que em adultos ou mais velhas, crianças.

Importância no que diz respeito a métodos existentes:
Apesar da necessidade de análise manual de câmera de vídeo e a menor resolução temporal de um vídeo de 60 Hz, em comparação com medições de reflectância 1 kHz, as taxas de sucesso melhorada de gravações em vídeo dificulte um método superior para o sensor infravermelho. Embora o sopro de ar da córnea também é entregue pelo mesmo acessório capacete como um sensor infravermelho comercial, entrega de estímulo parece ser mais resistente ao posicionamento do que o sensor de infravermelhos, como a força do sopro de ar pode ser ajustada conforme necessário. Isso evita o ajuste excessivo da bandelete da cabeça, o que tende a reduzir a conformidade infantil. Pesquisadores que podem atingir maiores taxas de sucesso usando o sensor de infravermelhos podem exigir ainda apoiar a análise de câmera de vídeo. Para os ensaios onde não há nenhuma resposta detectável eyeblink gravada pelo sensor infravermelho, gravações de vídeo podem distinguir entre o verdadeiras respostas ou ensaios inválidos (isto é, se a criança estava usando a unidade de sopro de ar na posição correta, Se eles não pisque, ou se o sensor infravermelho não conseguiu detectar a piscar). Igualmente, gravações de vídeo são necessárias para confirmar os resultados falso-positivos, como movimentos durante o julgamento também podem produzir artefactos mascarada pisca. Olho de monitoramento aparelho^15,16 e eletromiografia^9,10,14 do músculo orbicularis oculi são outro automatizado métodos de detecção de piscar de olhos que estão além do escopo deste artigo, embora sem confirmação visual da unidade de sopro de ar de posicionamento para cada julgamento, esses métodos são propensos a sofrer os mesmos inconvenientes como o software de detecção de infravermelho eyeblink descrito aqui.

Anteriormente trabalho publicado no piscar de olhos condicionado centrou-se em crianças mais jovens, normalmente de 4-5 meses de idade; Este trabalho acrescenta a este corpo de literatura descrevendo técnicas para o uso com crianças mais velhas (12 ± 1 mês de idade) e os desafios únicos que nessa faixa etária apresenta. Outros autores também têm usado análise de vídeo (sozinho ou em combinação com eletromiografia) com crianças^9,10,11,14. Os resultados apresentados aqui são consistentes com esses achados anteriores que sugerem quadro-a-quadro análise de vídeo é o melhor método de detecção de eyeblinks em lactentes, como ambos eletromiografia e monitoramento infravermelho podem ser problemáticos devido facial e cabeça movimentos em crianças de tenra idade. Este trabalho também suporta a constatação de que crianças podem desenvolver respostas condicionados mesmo em idades muito jovens, pelo menos por um de intervalo de atraso de 650-ms⁹.

Aplicações futuras:
Como um número limitado de estudos tentaram eyeblink condicionado experiências em bebês humanos, os parâmetros do estímulo devem ser cuidadosamente ponderados no futuro as experiências. Observou-se logo em 10 dias de idade¹⁷ condicionado e pelo menos no primeiro mês de vida¹⁴, apesar de um intervalo de tempo entre estímulo (por exemplo, 1.500 ms) parece ser mais bem sucedido nestas fases muito iniciais da infância¹⁸ . Em comparação, crianças, aproximando-se seis meses de idade podem ser mais confiantemente condicionadas com um intervalo mais curto¹⁰, apesar de menos sucesso do que em adultos¹⁹. O intervalo de 650-ms entre o Tom e o sopro de ar sugerido para crianças de um ano de idade neste protocolo com êxito podem induzir condicionado em 4 ou 5-meses lactentes^9,10,11, bem como em mais velho crianças de^6,7. Isto sugere que eyeblink condicionado desenvolvente é regulamentado, com o atraso ideal entre o Tom e o sopro de ar diminuindo com idade infantil¹⁰, embora experimentos adicionais adaptando este protocolo são obrigados a investigar estas parâmetros adicionais.

Limitações desta técnica:
EBC pode ser um desafio para configurar e pode exigir a solução de problemas em cada situação individual. Determinar quando ocorreu o condicionado é difícil definir e é melhor observado ao longo de vários ensaios ou sessões. Por exemplo, outros estudos têm utilizado uma taxa de condicionamento arbitrário de 40% em cada bloco de 10 ensaios para definir condicionado e comparado quaisquer alterações entre sucessivas sessões experimentais^{6,9,10, 11}. Concluir com sucesso o número necessário de ensaios para observar o condicionamento pode, portanto, ser difícil de alcançar em crianças pequenas.

No que diz respeito à análise de dados, dentre os desafios específicos é separa evocada por estímulo pisca pisca (endógena) espontânea⁹. A taxa de eyeblinks espontânea é diferente entre indivíduos, mas pode ser influenciada por fatores ambientais como umidade da sala, bem como Estados comportamentais. Pisca dupla ocorre quando existem duas tampas de pálpebra completa em um curto espaço de tempo (por exemplo, 400 ms)²⁰, e é possível que estes reflictam pisca espontânea ocorrendo ao mesmo tempo como uma reflexiva (condicionada ou incondicionada) eyeblink. Observamos ocasionalmente dupla pisca em nosso conjunto de dados e, usando este protocolo, gravamos a latência para piscar primeiro apenas. No entanto, descartar estes ensaios pode aumentar a certeza que a análise está capturando evocada por estímulo apenas pisca.

Os pesquisadores também precisará tomar decisões sobre a janela de latência no qual deseja definir um condicionado ou unconditioned resposta, bem como se deve definir a latência para o aparecimento de piscar ou o pico de piscar (fechamento das pálpebras). Aqui nós definimos conservadoramente uma resposta condicionada como um piscar de olhos que picos antes ms 650 em ensaios ou emparelhados ou não pareados, para proporcionar segurança que piscar é iniciada antes do início do sopro de ar, em vez de resposta para o sopro de ar. No entanto, esta janela de latência pode ser estendida para ensaios não pareados onde nenhum sopro de ar é apresentado, particularmente se usando piscar pico para definir a latência da resposta. O princípio importante aqui é que todas as instâncias são tratadas da mesma forma, por todos os examinadores, e que este critério é determinado antes de iniciar qualquer análise de dados.

Em resumo, a análise de vídeo frame-por-frame pode fornecer um método confiável e reprodutível de avaliação clássicas respostas EBC em lactentes jovens. Estas medidas fornecem uma medida de comportamento, de aprendizagem, apesar de uma avaliação abrangente do desenvolvimento é necessário para caracterizar totalmente neurodesenvolvimento na infância.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de condicionamento de piscar de olhos	San Diego Instruments	Modelo #2325-0145-W	inclui unidade de airpuff portátil e emissor/receptor infravermelho montado em faixa de cabeça ajustável; software de detecção de estímulo e resposta de piscar de olhos; Interface para PC
4K Ultra HD câmera de ação	RV77	Modelo SJ9000	micro SD / TF gravação de cartão 90fps a 720p