Summary
このプロトコルでは生きている細胞の核に直接制御力を適用するマイクロ ピペット法について述べる。このアッセイでは、生活、付着性の細胞で核の力学特性の尋問をことができます。
Abstract
核の機械的性質は、細胞で生成された機械的な力への応答を決定します。核が細胞骨格の分子に連続しているため付着細胞での力学的挙動を調べるための方法が必要です。ここでは、付着性細胞の核に直接力を適用するためのツールとして直接力プローブ (DFP) について述べる。我々 は、吸込みを伴う核の表面に細いピペットを添付します。マイクロ ピペットは、翻訳を変形させ、核を引き起こす核から変換されます。復元力が吸引力に等しい、核はデタッチし、弾性を緩和します。吸引圧が正確に知られているために、核の表面に働く力が知られています。このメソッドは、ナノの力が変形し、付着細胞で核を翻訳するのに十分なされ、力に抵抗する核を可能にする骨格の要素を明らかにしました。DFP を使用して、細胞内の核の力学特性に細胞や原子力部品の貢献を分析できます。
Introduction
癌などの疾患は、核の形状と構造1,2, '' 核3,4の軟化に伴う一般的に変化を含みます。原子力機械変形抵抗は、隔離された核5に力を適用することで一般的に特徴づけられています。
細胞核は細胞骨格に Nucleoskeleton リンカーと細胞骨格 (バイオス) 複雑な6,7,8,9分子接続されます。その結果、核は、細胞骨格と、細胞-基質間の癒着、細胞外マトリックスを機械的に統合されています。機械的に付着性細胞の中の核を探るこの機械的統合への洞察力を提供できます。マイクロ ピペット吸引10、11、および原子間力顕微鏡12,13,14生きた細胞中の核を操作するメソッドが含まれます。最近生活付着性のセル15に核に直接機械的な力を適用する直接力プローブ (DFP) について述べる。
ここでは、我々 は付着性細胞の核に直接知られているナノ機械的な力を適用する顕微鏡施設で利用可能なインジェクション システムを使用する手順を概説します。Femtotip (0.5 μ m 径マイクロ ピペット チップ) がマウントされ、チューブでのインジェクション システムに接続されています。まで核の表面に隣接して、培養皿の表面に対して 45 ° の角度で配置されている、先端が低下します。チューブは切断し、核の表面に負の吸引圧を作成し、核の表面に対してマイクロ ピペット先端をシール大気開放します。マイクロ ピペット チップの翻訳を通じて核は変形し、最終的に (力の大きさ) によって、マイクロ ピペットを切り離します。この剥離は、核および細胞、によって出される、復元 (耐熱) 力、ピペットによって適用される吸引力の等しい場合に発生します。核の変位を測定することによって分析を行うことが長さひずみ (式 1)、または領域のひずみ (図 1 a)。
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Protocol
1. イメージング用細胞を準備
注: 任意の付着性のセルのタイプの直接力プローブ (DFP) を使用できます。ここでは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞は、このプロトコルのモデル細胞ラインとして使用されます。
- 文化 NIH 3T3 線維芽細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 1% と 10% ドナー牛血清ペニシリン-ストレプトマイシン 35 ミリメートルのガラスの下に目的の confluency まで皿します。37 ° C と 5% の CO2の細胞を維持します。
- 必ずイメージングのための NIH 3T3 細胞を播種する前に 5 μ g/ml のフィブロネクチン (または類似の ECM 蛋白質) のすべての 35 mm ガラス底培養皿をコートしてください。
注: セルする必要が完全に普及して実験用皿に付着。DFP メソッドが動作するための密度の面で制約があります。
- 必ずイメージングのための NIH 3T3 細胞を播種する前に 5 μ g/ml のフィブロネクチン (または類似の ECM 蛋白質) のすべての 35 mm ガラス底培養皿をコートしてください。
- 実験直前にセルを洗浄して完全な培地で一回の洗浄が続く PBS で 2 回。
- ガラス底皿に完全な成長培地 3 mL を追加します。
2. 顕微鏡と画像の取得
注: 倒立蛍光顕微鏡 (または同等) 側の腕は、メーカーの推奨事項に従ってインストール マイクロマニピュレーターと。顕微鏡は、37 ° c、温度および 5% の CO2レベルを維持するために環境チャンバーを装備する必要があります。マイクロマニピュレーターとマイクロインジェクター顕微鏡に接続も必要です。油浸漬 40 x/1.3 NA または 60 x/1.49 NA (または同等の目標) は実験のためにお勧めします。顕微鏡は、除振台にマウントする必要があります。
図 1.核変形と顕微鏡の焦点
A. 最大の核変形と核変形の緩和。最大の核の変形を計算する前に核の形態の背面のエッジが変形核の翻訳を修正する最初一致しました。ピペット先端部が抜け出る瞬間に核の形は引く前に初期の原子核の形にかぶせてありました。2 つの図形間の領域の違いを測定した Δ1。最大の核の変形は ΔA1 元の核の面積で割った値として定義されました。同様に、2 番目のパラメーター、Δ2、元の原子核の形でマイクロ ピペット剥離後最終的な定常状態の原子核の形を重ねることによって定義されるかもしれません。B. 焦点平面にセル、平面 B マイクロ ピペット チップを見つけるまで焦点の平面を移動します。画像の中に、マイクロ ピペットは右 (オレンジ色の矢印の方向) に翻訳しました。この図は、Neelamらから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 製造元のプロトコルごとマイクロインジェクターを入れます。
- 対物レンズの上に液浸オイルの一滴を適用、浸漬オイル ドロッパーを使用します。
- 料理を皿ホルダーにしっかりとクランプし、ステージ上に皿ホルダーをロードします。
注: セルは、実験を通じて CO2を 37 ° C、5% に保たれなければなりません。 - 焦点 (平面 A図 1 b) にセルを持って目的の高さを調整します。
- 目的のセルを検索する顕微鏡ステージに移動します。
- ピペット ホルダーをトップの位置に移動するマイクロマニピュレーターにジョイスティックを回転させます。0.5 μ m 径のヒント マイクロ ピペット ピペット ホルダーに読み込みます。
- ピペットへの細胞接着を避けるためには、あらかじめ室温で 0.3 mg/ml の 1 h の PLL g ペグ ソリューション マイクロ ピペット チップを扱います。任意の吸引圧力なし核にマイクロ ピペットを触れるし、核からピペットを翻訳密着性をテストします。密着性の不在は、核変形と翻訳の完全な欠如から識別できます。
注: パッケージを開く製造の提案に従ってください。
- ピペットへの細胞接着を避けるためには、あらかじめ室温で 0.3 mg/ml の 1 h の PLL g ペグ ソリューション マイクロ ピペット チップを扱います。任意の吸引圧力なし核にマイクロ ピペットを触れるし、核からピペットを翻訳密着性をテストします。密着性の不在は、核変形と翻訳の完全な欠如から識別できます。
- 細かい制御を調整することによって面 A と面 B のセルの上部の客観的焦点面を上げる (図 1 b、ステップ 2.4 を参照)。
- 粗制御に変えればエンブリオバイオプシーに対応を設定します。ゆっくりピペットが焦点に完全にくるまをマイクロ ピペットのシルエット見て平面 B にマイクロ ピペットをもたらします。
- マイクロ ピペットのチップは、フォーカス、マニピュレーターを微調整に設定します。
- (平面 A、図 1 b) 細胞の赤道面に目標を下げるし、(図 1 b、破線ピペット) 平面の上約 15 μ m のマイクロ ピペットを下げます。
- 圧が得られる; マイクロインジェクター on 補正圧力 (Pc)圧力を安定させるために数秒を待ちます。
注: 最適な圧セット ポイントはセルの種類および実験の特定の目的に依存します。ほとんどの場合、300 hPa は良い出発点になります。 - マイクロマニピュレーター パネルのクリーン設定を使用して、マイクロ ピペット チップから出てくる空気の泡を確認するためにチェックして、ピペットが詰まっていないことを確認します。
- 先端は核の表面を軽く触れるまでマイクロ ピペットを徐々 に下げることによって、先端をセルに挿入します。
注: マイクロ ピペットを下げるとマイクロ ピペット チップのシルエットが焦点になるよう明確ななります。マイクロ ピペットに触れる核、前に上げる目的のフォーカス、核 (同じ x と y 座標、z 面の高い) とマイクロ ピペット チップを合わせます。フォーカスを核 (平面 A、図 1 b) の赤道面に戻り、マイクロ ピペット チップを徐々 に下げます。 - それにより大気中にマイクロ ピペット チューブの端を開くマイクロインジェクション システムから圧力供給管を切断してマイクロ ピペット チップと核膜のシールを作成します。この手順は、核の表面にPcに等しい負圧を作成します。
- 顕微鏡画像コレクション ソフトウェアが画像を取得します。Avi ファイルの取得 (ビデオの) または nd 取得 (イメージ) をコレクションの画像ソフトで設定します。
注: 任意のイメージング ソフトウェアを取得、リアルタイムのビデオ画像や短い時間間隔でタイムラプス映像買収を設定します。 - 対応するイメージング チャンネルに切り替え (すなわちGFP、RFP、等)、イメージングを開始。
- (右側、図 1 b) にセルの体からマイクロ ピペット チップを翻訳核は、マイクロ ピペットから外れるまで引っ張ります。
注: は、(ビューのフィールドの右側) に肯定的な x 方向のヒントを引き出します。引き率のプログラムやコンピューターによって制御されるジョイスティックを手動で移動することがでくことができます。引っ張って相関が見つかっていない率と核変形15を強制的に主に弾性応答を示唆しています。
3. データ分析
- 利用できる基本的な画像処理ソフトウェアで画像解析を実行します。長さひずみ (Ɛ) または領域のひずみ (図 1 a) のいずれかによって核変形の程度を定量化することができます。式 1 を使用して長さひずみを定量化、L と L0はそれぞれ最大変形と初期位置で核の長さを表します。
(関係式 1)
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Representative Results
図 2 aは、NIH 3T3 マウス線維芽細胞核の強制を示しています。マイクロ ピペット チップの右側に翻訳核変形、最終的にマイクロ ピペット チップから切り離します。吸引力 (図 2 b) とともに増加する核の長さのひずみが見られます。核 (端を引っ張ってマイクロ ピペット) の前面の端を形成する核の突起とトレーリング エッジが元の位置からずれています。突起の長さはトレーリング エッジの変位 (図 2)、核と細胞質の間の緊密な統合を示唆よりも大きくなります。時間スケールが核の前面の端のための短いリラクゼーション (< 1 s)、および核の背面の端 (< 2 s) (図 2 D)。
図 2.核変形の特性
変形と、DFP で生活、付着性細胞の核の変位。NIH 3T3 繊維芽細胞核は、6 nN の力で引っ張られました。画像は、指定時間に原子核の形を見せます。スケール バー: 5 μ m * 核変形の長さ歪みによる定量化を行った。核変形は応用力を増加しました。誤差範囲を示す (SEM); 平均の標準誤差n > 6。C. リーディング エッジの変位は、トレーリング エッジの変位より大きいです。D. 長さ歪緩和後端リラクゼーションよりもはるかに高速です。P < 0.05;誤差範囲を示す SEM;n = 10。この図は、Neelamらから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
どのように骨格の力を決定するのに DFP 法を使用しているセルの変形核の抵抗に貢献。(サイトカラシン D) による F アクチンまたは (ノコダゾール) による微小管破壊後核変形または翻訳で重要な違いが見つかりませんでした、siRNA によるノックダウンを通じてビメンチンの発現を減らす結果に大きく原子力翻訳と変形 (図 3)。これは線維芽細胞におけるビメンチン中間径フィラメントが地元の力に抵抗する核を助ける主要な細胞骨格要素であることを示唆します。
図 3.核変形の蛍光画像
Dfp スタンダードは、核変形への細胞骨格の力の寄与を決定する使用されました。核は、SYTO 59 色素に染まっていました。蛍光画像 (赤、擬似カラー) 前に核のオーバーレイの表示と (緑、擬似カラー) 後示された状態で。CTRL 制御の細胞;サイトカラシン D; 細胞細胞 DNOC、細胞ノコダゾール;スクラム、スクランブル siRNA; と transfected セルvim siRNA 細胞ビメンチンをターゲットとする siRNA をトランスフェクトしました。この図は、Neelamらから変更されています。15.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
彼らはいずれかの隔離された核 (核は細胞骨格から分離) を必要とするためピペット吸引16など、最新の方法のための挑戦は、細胞骨格に核の機械的統合を測定または核浮遊細胞 (細胞外の力、牽引力などは欠席)。力は、軸ひずみを膜17,18; に付着性のセルに適用することで、核に適用されています。ただし、この手法は、核の力が不明であるという事実によって制限されます。原子間力顕微鏡 (AFM) プローブは、そのまま細胞に核をインデントに使用されています。これらのオファーは、彼らが中に核の力学特性を明らかにする利点は、細胞骨格と統合されて。核12,13,14を特徴付けるため既存の体内手法を加える機械的付着細胞で核をプローブにしたまま簡単で堅牢な方法を開発しました。周囲の骨格に統合されています。この手法の主な機能は、核の力が正確に知られているおよび制御です。
DFP を適用すると、ナノ ニュートンのスケールの力が十分に変形し、生活、付着性細胞の核を翻訳を推定します。さらに、さまざまな骨格要素の貢献の体系的な研究により、我々 を発見したビメンチン ベース中間径フィラメントがセルの核の硬化担当細胞骨格の主要なコンポーネントであります。15。
これらの実験でいくつかの注意事項が適用されます。セルに適用される吸引圧に未知の変化が原因となるマイクロ ピペットまたは先端の破壊の両方の目詰まり、実験中の目詰まり、破損マイクロ ピペット チップを定期的にチェックすることが重要です。マイクロ ピペットが詰まっているかどうか、確認するには、最大圧力を適用し、マイクロ ピペット チップから出てくる空気の泡を確認するマニピュレーターをクリーンの設定を使用します。マイクロ ピペット チップが壊れているまたはフラクチャされた場合、は、次の実験を開始する前に、ピペットを交換してください。また、核のひずみの力で、変わる、ゼロの力でゼロを確認することが重要です (Neelamらを参照してください。15). これは実験で観測されていないなら、それはマイクロ ピペット チップと (PLL ペグによる治療) にもかかわらず核表面の非特定の付着が核変形のため責任がある可能性があります。技術の別の制限は、セル自体にマイクロ ピペットを挿入が骨格構造のいくつかのローカルの中断を引き起こす可能性がありますです。
核変形/翻訳の範囲と負荷率間の相関関係をテストすると便利です。相関の欠如は、主に弾性抵抗を意味するでしょう。確かに、これは我々 が線維芽細胞核15のケースのように発見したものです。核の力は知られているメソッドにはヤング率などのパラメーターの計算はできません。私たちは主に核変形とセルの翻訳への抵抗に細胞構造の貢献を分析するそれを使用されます。二次元核形15,19を報告している、それ力下で核の完全三次元形状の定量化に役立つ可能性があります。
マイクロ ピペットで吸引圧力が知られているが10の毛穴を通して水の流れに対する核表面期日に適用される実際の圧力よりも大きい。しかし、我々 は核孔を通って流れに対する抵抗はマイクロ ピペット (Neelamらの計算のためのサポート情報を参照を通じて大きく示されています。15) 合理的な膜浸透率とマイクロ ピペット寸法。したがって、外膜表面の圧力は流れの存在にもかかわらず吸引圧に等しいはずです。
結論としての dfp スタンダードでは、知られており、制御力を付着性のセルの統合核-細胞骨格の力学的応答を定量化できます。このメソッドは、セル内核の力学的挙動に細胞質、核内の分子成分の貢献を分析する使用ことができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH R01 EB014869 によって支えられました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
FluoroDish | WPI | FD35 | |
SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
References
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