Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.
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Artigo de método
Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nos terminais de nervo pré-sináptica ativo, vesículas sinápticas passam por ciclos de exo e endocitose. Durante a reciclagem, os domínios luminal de proteínas transmembrana SV tornam-se expostos na superfície da célula. Uma destas proteínas é Synaptotagmin-1 (Syt1). Um anticorpo dirigido contra o domínio luminal de Syt1, uma vez adicionado ao meio de cultura, é retomado durante o ciclo exo-endocytotic. Esta absorção é proporcional à quantidade de SV reciclagem e pode ser quantificada através de imunofluorescência. Aqui, nós combinamos Syt1 absorção de anticorpos com duplo transfeccao de neurônios hippocampal culturas. Isso permite que nós (1) localizar sites pré-sináptica baseados na expressão do marcador pré-sináptica recombinante Sinaptofisina, (2) determinar sua funcionalidade usando Syt1 absorção e (3) caracterizar a segmentação e os efeitos de uma proteína de interesse, GFP-Rogdi.
Introdução
Estudando a vesícula sináptica reciclagem é importante em determinar como alteram Propriedades pré-sináptica, durante a plasticidade sináptica, ou em resposta a perturbação da função sináptica. Estudando Synaptotagmin-1 (Syt1) captação de anticorpo fornece um método para medir a quantidade de reciclagem de SV. Syt1 é uma proteína de SV-associado que atua como um sensor de Ca2 + e é necessária para os liberação do neurotransmissor1,2. É uma proteína transmembranar com um domínio citoplasmático do C-terminal fora o SV e um domínio N-terminal do luminal dentro do SV3. Durante a ....
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Protocolo
Foi realizado nenhum estudo com animais vivos. Experimentos envolvendo animais sacrificados para obter culturas foram aprovadas pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob a aprovação de célula número T10/30. Os experimentos foram realizados com os protocolos aprovados.
1. primário de células Hippocampal cultura
- Prepare a cultura de células dissociadas do hipocampo rato em embrionárias dia 1916,17. As células em lamelas de 12 mm, revestidas com polyethyleneimine (PEI) em 24-bem pratos em uma densidade de 50.000-6....
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Resultados
Um resultado esperado desta abordagem é localizar aproximadamente 50 duplo-transfectadas neurônios por lamela em uma densidade de 50.000 neurônios por bem. O axónio de cada neurônio é esperado para mostrar vários hotspots de acumulação Sinaptofisina fluorescente etiquetado, indicando aglomerados ofSVs. Em sites pré-sináptica funcionais, o sinal de Sinaptofisina recombinante colocalizes com punctate Syt1 fluorescência. Usando a transfeccao duplo, ou GFP-Rogdi como a proteína de interesse (.......
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Discussão
Existem três ensaios rotineiramente usados para estudar a vesícula sináptica (SV) reciclagem. Os dois primeiros incluem o uso de um) fluorescente styryl corantes como FM1-43 (que incorporar em membranas, são retomadas em organelas durante a endocitose e são liberados após a exocitose); e b) marcados fluorescentemente proteínas recombinantes do SV (que, em cima de superexpressão, incorporam as máquinas de reciclagem proteicas). Se o anexadas fluorophores alterar sua fluorescência dependendo do pH, pode ser usados para mon.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Irmgard Weiss-assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado pelo DFG através do Cluster de excelência para microscopia na escala do nanômetro e fisiologia molecular do cérebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| anti-rato de burro Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 anticorpo | |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubos | Eppendorf | 30120094 | |
| multipoços 24 poços | Fisher Scientific | 087721H | |
| tubo (50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glicose | Merck | 1.083.421.000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| lâminas | de microscópio Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Software livre, veja os comentários | escritos por Noam E. Ziv, Technion – Instituto de Tecnologia de Israel, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| capuz de segurança | ThermoElectron | Nº de série 40649111 | |
| Sacarose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | monoclonal de camundongo; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1.086.031.000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Banho-maria | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss |
Referências
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-6....
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Reimpressões e permissões
