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Artigo de método

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

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DOI:

10.3791/58043

⸱

26 de junho de 2018

 ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Embryology, University Medical Centre Göttingen

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Resumo

Nos terminais de nervo pré-sináptica ativo, vesículas sinápticas passam por ciclos de exo e endocitose. Durante a reciclagem, os domínios luminal de proteínas transmembrana SV tornam-se expostos na superfície da célula. Uma destas proteínas é Synaptotagmin-1 (Syt1). Um anticorpo dirigido contra o domínio luminal de Syt1, uma vez adicionado ao meio de cultura, é retomado durante o ciclo exo-endocytotic. Esta absorção é proporcional à quantidade de SV reciclagem e pode ser quantificada através de imunofluorescência. Aqui, nós combinamos Syt1 absorção de anticorpos com duplo transfeccao de neurônios hippocampal culturas. Isso permite que nós (1) localizar sites pré-sináptica baseados na expressão do marcador pré-sináptica recombinante Sinaptofisina, (2) determinar sua funcionalidade usando Syt1 absorção e (3) caracterizar a segmentação e os efeitos de uma proteína de interesse, GFP-Rogdi.

Introdução

Estudando a vesícula sináptica reciclagem é importante em determinar como alteram Propriedades pré-sináptica, durante a plasticidade sináptica, ou em resposta a perturbação da função sináptica. Estudando Synaptotagmin-1 (Syt1) captação de anticorpo fornece um método para medir a quantidade de reciclagem de SV. Syt1 é uma proteína de SV-associado que atua como um sensor de Ca2 + e é necessária para os liberação do neurotransmissor1,2. É uma proteína transmembranar com um domínio citoplasmático do C-terminal fora o SV e um domínio N-terminal do luminal dentro do SV3. Durante a exocitose, o domínio luminal de Syt1 torna-se exposto ao meio externo. Para este meio externo, acrescentamos anticorpos dirigidos contra o domínio citoplasmático, que se torna interiorizado durante a endocitose. Estes anticorpos podem ser que também pre-conjugados com fluorophores ou immunostained com anticorpos secundários4,5,6,7. A intensidade da fluorescência do immunosignal resultante é proporcional à quantidade de reciclagem de SV. Esta abordagem pode ser usada para determinar o SV constitutiva e induzida por despolarização reciclagem6,8.

Ensaios de absorção de Syt1 podem ser realizados após a transferência de genes mediada por vírus para praticamente todas as células no prato ou transfection esparso de um pequeno número de células. Nosso método combina o ensaio com esparso transfection duplo de neurônios hippocampal preliminares usando o fosfato de cálcio9. Nós usamos uma proteína recombinante marcador conhecida a acumular-se no presynapses, Sinaptofisina fluorescente etiquetada, localizar terminais pré-sináptica e overexpress nossa proteína de interesse, Rogdi. Isto permite-nos testar ou não Rogdi alvos funcionais sinapses e afeta SV reciclagem. O gene que codifica a Rogdi foi originalmente identificado em uma tela para mutantes de Drosophila, caracterizados pela memória prejudicada10. Em humanos, mutações no gene Rogdi causam uma doença rara e devastadora, chamada síndrome de Kohlschütter-Tönz. Os pacientes sofrem de malformações do esmalte dentário e pharmacoresistant epilepsia psicomotoras atrasos; no entanto, a Localização subcellular do produto gene permaneceu evasivo11. Assim, o ensaio de absorção de Syt1 forneceu evidência chave para localização de GFP-etiquetado Rogdi às sinapses funcionais9.

Esta técnica de captação tem diversos benefícios. Primeiro, SV reciclagem pode ser observado tanto em tempo real através da realização de7,de imagens ao vivo12e após fixação6,9 , medindo a intensidade da fluorescência do rótulo Syt1 fluorescência. Além disso, foram desenvolvidas diversas variantes de Syt1 anticorpo. Existem variantes sem marcas de formatação que podem ser rotuladas com um anticorpo secundário, seguindo um protocolo padrão de imunocoloração após a fixação e variantes pre-conjugadas com um rótulo de fluorescência já anexado. Finalmente, baseados em anticorpo fluorescência é vantajosa devido a grande seleção de corantes secundários ou conjugados em comercialmente disponíveis que pode ser usado.

Quando fixação e imunocoloração os neurônios, é também possível mancha para proteínas adicionais e executar análise colocalization. Isto pode ajudar a determinar onde eles estão localizados em relação à reciclagem SVs. A intensidade do rótulo da fluorescência é a medida direta da quantidade de SV reciclagem. Além disso, os anticorpos seletivamente rotulam Syt1 contendo estruturas, resultando em alta especificidade e de fluorescência do pouco fundo4. Protocolos de estimulação diferentes também podem ser usados, tais como buffers de despolarização ou estimulação elétrica protocolos9,12,13,14. No entanto, reciclagem de SV basal pode ser medida sem estimular as culturas neuronal15.

Nosso método trata especificamente a absorção de anticorpo Syt1 nos neurônios duplo-transfectadas com anticorpo secundário immunolabeling após a fixação. No entanto, nos referimos a todas as variantes rotineiramente utilizadas do ensaio em nossa discussão para dar aos espectadores a oportunidade de adaptar o protocolo para necessidades específicas.

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Protocolo

Foi realizado nenhum estudo com animais vivos. Experimentos envolvendo animais sacrificados para obter culturas foram aprovadas pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob a aprovação de célula número T10/30. Os experimentos foram realizados com os protocolos aprovados.

1. primário de células Hippocampal cultura

  1. Prepare a cultura de células dissociadas do hipocampo rato em embrionárias dia 1916,17. As células em lamelas de 12 mm, revestidas com polyethyleneimine (PEI) em 24-bem pratos em uma densidade de 50.000-60.000 células/poço da placa. Verifique a densidade utilizando uma célula ótica de contraste de fase e câmara de contagem.
  2. Cultura os neurônios para 3 dias (dia em vitro (DIV) 3) em uma placa de 24 na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Avalie as lamelas para indicadores de saúde de células usando microscopia de luz transmitida (por exemplo, fase contraste ótica em uma ampliação de 10-20 X). Verifique os seguintes indicadores de saúde: um halo de contraste de fase clara, neuritos sem estruturas frisados e não soma clustering ou agrupamento do axônio.

2. transfection

Nota: O seguinte protocolo refere-se a um dupla de Transfeccao para 3 poços. No entanto, o protocolo funciona melhor quando quantidades suficientes para 4 poços estão preparadas.

  1. Prepare 500 mL de tampão de transfeccao (274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, glicose de 15mm, 42 mM HEPES) em um Erlenmeyer.
    1. Dissolva 5,0 g de HEPES em 400 mL de água destilada em um Erlenmeyer, 0,37 g de KCl, 0,095 g de Na2HPO4, 1,35 g de glicose e 8,0 g de NaCl.
    2. Ajuste o pH a 6,95 com 1 M NaOH, usando um medidor de pH.
    3. Ajustar o volume com água destilada para 500 mL e verificar o pH usando um medidor de pH.
    4. Fazer alíquotas de 20-30 mL de tampão de transfecção com os seguintes valores de pH por pipetagem 1 M NaOH para o buffer de transfeccao: 6,96, 6.97, 6,98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7,07, 7.08, 7.09, 7.11.
      Nota: O pH do buffer do transfection é crucial para a eficácia do transfection.
    5. Para testar o que leva de tampão de Transfeccao para o maior número de células transfectadas, teste cada valor de pH de 6,96 a 7.11. Use o método de transfeccao descrito em 2.2-2.11 e um plasmídeo validado expressando GFP. Determine o número de células transfectadas por lamela para cada valor de pH do tampão de transfeccao avaliar qual tampão funciona melhor.
    6. Alíquota a reserva com a mais alta eficiência de Transfeccao para tubos de 2 mL microcentrifuga congelar e armazenar os tubos a-20 ° C.
  2. Pré-aquecer o soro reduzida meio, meio de cultura celular e água destilada a 37 ° C em banho-maria.
  3. Prepare a mistura de transfeccao em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Trabalhar sob a capa de fluxo laminar para garantir condições de trabalho estéril.
    1. Mix de 7,5 µ l de cloreto de cálcio 2 M com 4 µ g de cada DNA livre de endotoxinas (Sinaptofisina-mOrange e mGFP/GFP-Rogdi). Adicione água para atingir um volume total de 60 mL em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    2. Adicione 60 mL de tampão de transfeccao à mistura. Para obter os melhores resultados, adicione o buffer de transfeccao gota a gota, agitando a mistura de DNA suavemente sobre o vórtice.
    3. Incube a temperatura ambiente (RT) por 20 minutos. Evite agitação do tubo de incubação durante o tempo de incubação, colocando o tubo ao lado a capa do fluxo laminar.
  4. Sob o capô de fluxo laminar, remover o meio de cultura celular ("meio condicionado") dos poços utilizando uma pipeta de 1000 mL e armazená-lo em um recipiente separado na incubadora.
  5. Adicione 500 mL de soro reduzida meio a cada poço. Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO2 até que acabe o período de incubação de 20 minutos (etapa 2.3.3).
  6. Adicione 30 mL de mistura de Transfeccao para cada poço pipetando várias gotas. Descarte o resíduo no fundo do tubo.
  7. Depois de todos os poços foram fornecidos com a mistura de transfeccao, agite suavemente a placa de 24 para garantir a distribuição da mistura no meio do transfection.
  8. Incube os poços durante 60 minutos a 37 ° C e 5% de CO2.
  9. Remova e descarte a mistura de transfeccao e lavá-lo três vezes com meio de cultura celular. Adicione 1 mL de meio de cultura celular a cada poço e incube-os por 30 segundos a RT. remover 750 mL do meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repita isso três vezes.
    Nota: A etapa de lavagem é muito importante. Manter o tempo que cada poço não tem nenhum meio de no mínimo (i. e., remover e substituir por-bem) e adicionar lentamente o meio de lavagem.
  10. Remova e descarte o meio de cultura celular e adicionar 450 mL do condicionado médio por-bem.
  11. Deixe os neurônios maduros na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 para 10 DIV.

3. estimulação e captação de Syt1

Nota: O seguinte protocolo aplica-se a absorção de 3 poços. Por despolarização de qualquer outro número de poços, ajuste os montantes em conformidade.

  1. Prepare-se 50 mL de tampão de despolarização 10 x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20mm CaCl2, glicose de 300 mM, 200 mM HEPES, pH 7,4), em um Erlenmeyer.
    Nota: A reserva de despolarização pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas. Se uma solução não-despolarizantes também é usada, preparar um 10 solução do x Tyrode consistindo de 1290mm NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20mm CaCl2, 300 mM, glicose, pH HEPES 200mm 7.4 fim comparar estimulação induzida por reciclagem com espontânea reciclagem. Após a diluição a 1 x, adicione 1 µM de tetrodotoxina antes do uso para bloquear a geração do potencial de ação.
    1. Dissolva 1,87 g de NaCl, 2,61 g de KCl, 0,1 g de MgCl2-6 H20, 0,15 g de CaCl2-2 H2O e 3,0 g de glicose-1 H2O e 2,38 g de HEPES em 50 mL de água destilada em um Erlenmeyer. Ajuste o pH com NaOH e estéril-filtrar a solução. Dilua o tampão 01:10 em água destilada a obter uma concentração de 1 x.
  2. Prepare o paraformaldeído 4% (PFA) em 1X PBS (pH 7,4) para fixação após a estimulação.
    1. Para 500 mL de 4% PFA em PBS 1x, dissolver 20 g de paraformaldeído em 450 mL de água destilada H2O.
      Nota: A solução de aquecimento pode acelerar a dissolução, mas não aqueça a solução acima de 70 ° C, como o PFA pode desintegrar-se.
      Cuidado: PFA é tóxico, potencialmente carcinogênicos e teratogênicos. Use luvas quando trabalhar com PFA, trabalhar sob a coifa e evitar a ingestão.
    2. Deixe a solução esfriar a RT e adicionar 50 mL de solução estoque de PBS x 10. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH/HCl usando um medidor de pH.
  3. Pré-aqueça 600 mL de tampão de despolarização 1x e 10 mL de meio de cultura celular para 37 ° C em banho-maria.
  4. Adicione 1 mL de anticorpo anti-Syt1 de rato (clone 604.2) para o 1x buffer de despolarização e vortex durante 10 segundos.
  5. Remova e descarte o meio de cultura celular de células. Adicione 200 mL da mistura despolarização-anticorpo para cada bem e incubar por 5 minutos a 37 ° C e 5% CO2 na incubadora.
  6. Remova e descarte a mistura de despolarização-anticorpo e lavá-lo três vezes com meio de cultura celular. Adicione 1 mL de meio de cultura celular a cada poço e incube por 30 segundos a RT. remover 750 mL do meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repeti três vezes.
  7. Remova e descarte o meio de cultura celular e adicionar 300ml de 4% PFA em 1X PBS. Incubar durante 20 minutos a 4 ° C.
  8. Lavar três vezes por 5 minutos, cada um com PBS 1x.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. imunocitoquímica

  1. Prepare 50 mL de tampão de bloqueio.
    Nota: Bloqueio de buffer pode ser mantido a-20 ° C por vários meses.
    1. Dissolva 2,5 g de sacarose e 1 g de albumina de soro bovino (BSA) em 5 mL de solução estoque de PBS x 10. Adicione 1,5 mL da solução detergente 10%. Agite a solução até que todos os componentes corretamente se dissolveram e adicionar água destilada H2O até atingir um volume final de 50 mL. Alíquota da solução e congelar as alíquotas para armazenamento.
  2. Dilua o anticorpo secundário, fluoróforo acoplados (dirigido contra as espécies de Syt1-anticorpo primárias) em 200 mL de tampão de bloqueio em cada poço a uma diluição de 1: 1000.
  3. Remova e descarte a PBS 1x de cada bem que contém uma lamela.
  4. Adicionar 200 mL de mistura de tampão-anticorpo para cada poço de bloqueio e incubar durante 60 minutos a RT
    Cuidado: Porque os anticorpos secundários são sensíveis à luz, todos os passos em frente devem ser realizados no escuro.
  5. Após a incubação, lave as células três vezes por 5 minutos com 1 mL de 1X PBS.
  6. Incorpore as lamelas em corrediças do microscópio com o medium de incorporação.
    1. Adicione uma gota de 7 mL de incorporação médio da lâmina de microscópio. Remova a lamela a placa de 24 por levantá-lo com uma seringa e agarrando-o com a pinça.
      Cuidado: Células na superfície da lamela são facilmente danificadas, então fórceps deve ser manuseado com cuidado.
    2. Mergulhe a lamela água destilada para remover a PBS e seque-o cuidadosamente, tocando uma borda de um tecido mole.
    3. Inverter a lamela sobre a incorporação da gota média, para que a superfície carregando as células enfrenta a lâmina de microscópio, incorporando, assim, as células no meio de encastre.
  7. Deixe os slides para secar sob o capô para 1-2 h (cobri-los para evitar a exposição à luz) e armazená-los em uma caixa de slide de microscópio a 4 ° C.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

5. microscópico análise

  1. Depois de secam as lamelas, colocá-los sob o microscópio com o objectivo e a câmera.
  2. Ajuste o tempo de exposição para cada canal para que alguns pixels são superexpostas para garantir o máximo da distribuição dos valores de cinza.
    Nota: Enquanto o tempo de exposição pode variar entre os canais, deve ser constante para um canal para assegurar a comparabilidade entre as lamelas.
  3. Adquira imagens de multi-canal para 10 regiões de interesse (ROIs) por lamela. Verifique se o ROI contém processos axonal a partir de um neurônio transfectado, verificando a GFP-fluorescência, que deve ser punctate.

6. análise estatística

  1. Exporte as imagens como arquivos. tif. Carregar as imagens para OpenView18 clicando em arquivo | Arquivo de imagem de carga.
  2. Escolha a imagem Sinaptofisina-mOrange como canal 1, a imagem Rogdi-GFP/mGFP como o canal 2 e a imagem de fluorescência Alexa647 como canal 3.
  3. Limiar de ROIs.
    1. Clique em análise | Área de lugar sobre a partitura. Escolha os valores de limiar e intensidade de Delta para que após a inspeção visual, fluorescência difusa é excluída, deixando apenas punctate sinais na imagem do canal 1 (representando Sinaptofisina-mOrange fluorescência). Manter o mesmo limiar para todas as imagens.
  4. Transferi estes ROIs ao correspondente canal 2 (fluorescência de GFP-Rogdi/mGFP) e 3 (Syt1-fluorescência) de cada área de lamela, clicando em executar agora.
    Nota: O ROIs só deve ser considerado se a célula é duplo-transfectadas. Neste método, o mOrange e GFP-fluorescência deve ser claramente visível.
  5. Salve os dados no editor de registo de análise clicando em dados de Log.
  6. Abra o editor de registro de análise sob a guia do Windows e copiar os valores para cada canal. Cole os valores para os canais separados em uma planilha.
  7. Determine a intensidade média de fluorescência do Syt1-canal no ROIs em ambas as condições de transfeccao (GFP-Rogdi e mGFP).
  8. Aplica testes estatísticos adequados, tais como o teste t de Student para determinar diferenças significativas.

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Resultados

Um resultado esperado desta abordagem é localizar aproximadamente 50 duplo-transfectadas neurônios por lamela em uma densidade de 50.000 neurônios por bem. O axónio de cada neurônio é esperado para mostrar vários hotspots de acumulação Sinaptofisina fluorescente etiquetado, indicando aglomerados ofSVs. Em sites pré-sináptica funcionais, o sinal de Sinaptofisina recombinante colocalizes com punctate Syt1 fluorescência. Usando a transfeccao duplo, ou GFP-Rogdi como a proteína de interesse (...

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Discussão

Existem três ensaios rotineiramente usados para estudar a vesícula sináptica (SV) reciclagem. Os dois primeiros incluem o uso de um) fluorescente styryl corantes como FM1-43 (que incorporar em membranas, são retomadas em organelas durante a endocitose e são liberados após a exocitose); e b) marcados fluorescentemente proteínas recombinantes do SV (que, em cima de superexpressão, incorporam as máquinas de reciclagem proteicas). Se o anexadas fluorophores alterar sua fluorescência dependendo do pH, pode ser usados para mon...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos Irmgard Weiss-assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado pelo DFG através do Cluster de excelência para microscopia na escala do nanômetro e fisiologia molecular do cérebro (CNMPB, B1-7, a T.D.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
B27Gibco17504-044
BSASigmaA7030-50g
CaCl2Sigma-AldrichC3306-100g
CoolSNAP HQ2Photometrics
dH2OInvitrogen15230
DABCOMerck8.03456.0100
anti-rato de burro Alexa 647Jackson-Immunoresearch715605151 anticorpo
DMEMInvitrogen41966
DPBSGibco14190
Eppendorf tubosEppendorf30120094
multipoços 24 poçosFisher Scientific087721H
tubo (50 mL)Greiner Bio-One
FBS superiorBiochromAGS0615
GlicoseMerck1.083.421.000
HBSSInvitrogen14170
HEPESSigmaH4034-500g
Hera Cell 150 (Inkubator)ThermoElectron Corporation
KCLSigma-AldrichP9541-500g
L-GlutaminaGibco25030
MgCl2HoneywellM0250-500g
lâminasde microscópio Fisher Scientific10144633CF
Microsoft ExcelMicrosoft
Mowiol4-88Calbiochem475904
NaClBioFroxx1394KG001
Na2HPO4BioFroxx5155KG001
NeurobasalInvitrogen21103049
OpenView Experiment Analysis ApplicationSoftware livre, veja os comentáriosescritos por Noam E. Ziv, Technion – Instituto de Tecnologia de Israel, Haifa, Israel
PBS (10x)Roche11666789001
OptimemInvitrogen31985
PenstrepGibco15140-122
PFASigmaP6148-1kg
capuz de segurançaThermoElectronNº de série 40649111
SacaroseneoFroxx1104kg001
Synaptotagmin1Synaptic Systems105311monoclonal de camundongo; clone 604.2
Triton X-100Merck1.086.031.000
Vortex Genius 3 IKA3340001
Banho-mariaGFL1004
Zeiss Observer. Z1 Zeiss
227261

Referências

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Captação de Sinaptotagmina-1Neurônios Hipocampais CultivadosDupla TransfecçãoSinaptofisina-mOrangeColocalização de GFP-RogdiQuantificação por ImunofluorescênciaTampão de DespolarizaçãoAnticorpo Anti-Syt1Terminais Pré-sinápticos
Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica
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