Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב Aphis nerii: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק

Published: August 31, 2018 doi: 10.3791/58044
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

Summary

מימדיה Aphis nerii והצנרות על הגן מאוד צמחים ממשפחת dogbane (Apocyanaceae), ומספק הזדמנויות רבות ללמוד אינטראקציות צמח-חרקים. כאן, אנו מציגים סדרת פרוטוקולים עבור שמירה על צמח, כנימות עלה תרבויות, ואת הדור ניתוח של מולקולרית ונתונים - omic עבור nerii א.

Abstract

כנימות הן ניסיוניות מעולה למגוון רחב של שאלות ביולוגיות החל את האבולוציה של symbioses ופיתוח של polyphenisms לשאלות המקיפים של החרק אינטראקציות עם צמחים פונדקאים שלהם. גנומית משאבים זמינים עבור מספר מינים כנימות עלה, עם ההתקדמות רצף הדור הבא, מחקרים transcriptomic להיות מורחבות כדי אורגניזמים שאינם-דגם חסרי הגנום. יתר על כן, תרבויות כנימות עלה יכול להיות שנאספו מהשטח וגדלתי במעבדה לשימוש בניסויים organismal מולקולרית, כדי לגשר על הפער בין מחקרים אקולוגיים גנטי. בפעם האחרונה, כנימות רבים יכול להישמר במעבדה על צמחים פונדקאים המועדפת שלהם במחזורי החיים הנצחי, parthenogenic המאפשר השוואות של asexually מתרבה אחרים. Aphis nerii, מימדיה לבנבן-הרדוף מספק מודל אחד כזה ללמוד אינטראקציות חרקים עם צמחים רעילים באמצעות ניסויים הן organismal והן מולקולרית. שיטות דור ותחזוקה של תרבויות החממה, מעבדה, עקירות DNA ו- RNA, ניתוח microsatellite, דה נובו transcriptome הרכבה, ביאור, transcriptome דיפרנציאלית הביטוי צמח, כנימות עלה ניתוח ואימות qPCR של גנים ביטוי באופן שונה המתוארים הינם שנדונו כאן.

Introduction

כנימות הן חרקים קטנים, hemimetabolous ליישב על משפחות צמחים מגוונים ברחבי העולם. הם ייחודי עבור מספר תכונות, ביותר ובמיוחד שלהם מחזורי החיים מורכבים המערבים רביית בתולים מחזורית polyphenisms דיסקרטית, ואת שלהם symbioses תזונתי פעל עם endosymbionts בקטריאלי או שמרים לספק חומרים מזינים חסרים הדיאטה שלהם של הצמח sap1. בעוד רוב הכנימות הם מומחים הצמח הפונדקאי, מינים מסוימים עובדים כלליים הם מזיקים חשוב חיתוך, גרימת נזק כלכלי ניכר על היבול גם ישירות או באמצעות גורמי מחלה, וירוסים הם וקטור2. הפרסום של הגנום כנימות עלה הראשון בשנת 2010 מימדיה אפונה Acyrthosiphon אפון3, מסומן ציון דרך חשוב בחקר הביולוגיה כנימות עלה משום שסיפקה את המשאבים גנומית לשאלות המיעון על החרק עיבודים ל אורח החיים אוכלי עשב, כולל אלה שעשויים להוביל אסטרטגיות שליטה טובה יותר4. מאז, צברו משאבים גנומית נוספים עם הפרסום של הגנום מוערת על סויה כנימות עלה Aphis glycines5ומשאבים הגנום כולו מהעדכונים הזמינים עבור שלוש-כנימות עלה עוד מינים (המידע cerasi (כנימות עלה דובדבן שחור), המידע שיפורט להלן מתייחס (כנימות עלה אפרסק-תפוחי אדמה), Rhopalosiphum padi (כנימות עלה ענביה-שיבולת שועל)6. ערך דה נובו transcriptomic משאבים זמינים גם עבור מספר מינים אחרים כנימות עלה (e.g.,Aphis gossypii (כותנה כנימות עלה)7, Sitobion avenae (כנימות עלה תבואה)8, Cinara pinitabulaeformis (כנימות עלה אורן)9, Aphis nerii (כנימות עלה לבנבן-הרדוף)10).

כנימות עשו גם תרומות מתמשך להבנה שלנו את האינטראקציות צמח-חרק ואקולוגיה של חיי הצמחים11. תחום אחד שבו כנימות לתרומות חשוב במיוחד הוא בהבנתנו. אקולוגיה כימית של אינטראקציות צמח המארח. עיבודים אקספרס מגוונות חרקים אוכלי עשב עבור להתגבר על ההגנות צמח, וחלק אפילו לצרף צמח ההגנות שלהם ליהנות12,13,14. לדוגמה, מימדיה לבנבן-הרדוף Aphis nerii, הוא בהיר צהוב, פולשני כנימות עלה, נמצאו באזורים אקלים ואזורים טרופיים ברחבי העולם זה והצנרות על צמחים ממשפחת לבנבן (הרדופיים). צמחים ממשפחת הרדופיים התפתחו ההגנות כימיים מגוונים, לרבות latex חלבי גליקוסיד הידועה בשם cardenolides, אשר מאגד המוביל הקטיון Na, K-ATPase ומהוות deterrents יעיל ומתוכנן אוכלי עשב15, 16. לבנבן מומחים לבטא מצבים שונים של התנגדות cardenolides, חלקם באופן סלקטיבי או פסיבי לצבור או לשנות cardenolides ברקמות שלהם כאמצעי להרתיע טריפה או הטבות אחרות17. Nerii א נחשב לבודד cardenolides בדרך זו, אף מנגנוני והיתרונות פונקציונלי לא ברור10,18.

בהינתן המשאבים גנומית בהישג יד, א nerii מספק מדגם ניסיוני מעולה לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים והגנטיים מעורבת ביחסי הגומלין כימותרפיה-אקולוגית בין צמחים פונדקאים רעילים מומחה שלהם אוכלי עשב. ראוי לציין כי, בעוד שבחלקם המחקרים המוקדמים של א nerii התמקדו פחמיות של cardenolides19, מאז, מחקרים של nerii א סיפקו תובנות לתוך מערך רחב של שאלות אבולוציונית וגם אקולוגית, כולל המבנה הגנטי של חרקים פולשנית20 והגומלין בין רגולציה מלמטה ולא מלמעלה על צפיפות הרביוור21. Nerii א ולכן מועמד טוב בתור מודל ניסיוני עבור מערך רחב במיוחד של מחקרים של אינטראקציות חרק-צמח. קריטי להצלחה של כל מחקר עם nerii א הוא התרבות זהיר של כנימות עלה אוכלוסיות, כולל התרבות של צמחים אשר תלויים הכנימות, וכן של דור יעילה של נתונים באיכות גבוהה - omic. המטרה שלנו היא להנחות את הקורא דרך שניהם. המפורטות להלן הן שיטות דור ותחזוקה של התרבויות צמח, כנימות עלה החממה, מעבדה, DNA, RNA עקירות, ניתוח microsatellite, דה נובו transcriptome הרכבה, ביאור, transcriptome ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ואימות qPCR באופן שונה באה לידי ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה כתובות א neriiculturing כללי, חילוץ, שיטות ניתוח יכול להרחיב מגוון מינים כנימות עלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מפעל תרבויות

  1. לרכוש זרעים שום ספק מסחרי או לאסוף צמחים בוגרים בתחום.
    הערה: פרוטוקול זה מתאים לבנבן זמינים מסחרית רוב המינים (למשל, Asclepias רפואית, סורי א, א curassavica, Gomphocarpus physocarpus). זרעים מסוימים ייתכן שתצטרך להיות קר, מרובדת, הוראות מהספק זרע צריך להיבדק.
  2. לשתול זרעים בקרקע germinating בסדר (60-70% בסדר כבול מוס, פרליט, ורמיקוליט, גיר).
    1. למלא מגש שתיל תקן נביטה תערובת אדמה; להבטיח כי הקרקע מגיע למעלה מן הבארות. כל טוב, ודא ההזחה ליצירת חור באדמה על 3 ס עמוק.
    2. מקום זרע אחד לכל חור ובמים היטב עם מזלף כזה כי הקרקע מכסה את הזרעים, רווי.
    3. גדלים הזרעים בחממה (ראה תנאים להלן, 1.5). מים באופן קבוע, כל יום על כל אחרים-יום; מספיק כדי לשמור על לחות הקרקע ברמה בינונית.
  3. כאשר השתילים גדלו את הסט הראשון של עלים מלא, סיר מחדש השתילים בשטח השתילה כללי לערבב (50%-60% כבול, הנביחה, ואבן גיר) (איור 1א').
    1. השתמש סירים עגול 4 אינץ מתאים עם חותם צר עם גביע הכלובים. למלא עם אדמת שתילה כללי עד כ 5 ס מ מתחת לקצה.
    2. ליצור חור באדמה עמוקה מספיק כדי להגיע לתחתית הסיר.
    3. עם היד בעדינות סקופ שתיל בוגר מבאר שלו ולמקם אותו עמוק בתוך החור בסיר 4 אינץ. מכסים שתיל עם הקרקע. מים טוב מאוד.
    4. לגדל צמחים החממה, מים באופן קבוע, כל יום כדי בכל יום; מספיק כדי לשמור על לחות הקרקע מתונה.
  4. תנאי החממה.
    1. הגדר את טרמוסטטים החממה כדי לשמור על טמפרטורות בין 18-28 מעלות צלזיוס וטמפרטורות הלילה בין 16 – 22 ° C באמצעות הוראות היצרן.
    2. במהלך חודשי החורף, כשהימים קצרים יותר, תוספת האור עם נורות נתרן בלחץ גבוה 600 W (12 h, שמונה בבוקר – 8:00-20:00).
  5. בקרת מזיקים בלתי רצויים (למשל, תריפסים, כנימות) עם פתרון בריסוס סבון אורגני, עם זאת, שימוש במוצרים אלה בזהירות.
    1. להפוך את הפתרון סבון על פי ההמלצה של היצרן ולהחיל באמצעות בקבוק ספריי.
    2. להשאיר הסבון על הצמחים עבור 4-24 ח' לשטוף בעדינות את הצמחים במים כדי להסיר את היישום שלאחר 4 – 24 h סבון ולשטוף אותם עם מים לכהן בפעם השנייה לשימוש עם תרבויות כנימות עלה מעבדה.
  6. התרבות האוכלוסייה הממוצעת כנימות עלה על צמחים שלא גדלו לפחות 3-4 סטים של עלים מלא לפחות 10 ס מ גבוה (איור 1B).

2. כנימות עלה תרבויות

  1. להתחיל האוכלוסיות כנימות עלה מעבדה של אוכלוסיה isoclonal מעבדה קיימים או להתחיל כנימות שנאסף בשדה בעקבות ההוראות שלהלן.
    1. כאשר החל אוכלוסיה מעבדה אוכלוסיה קיימת מעבדה isoclonal, העברה כנימות כמתואר ב- 2.3.1–2.3.3.
  2. מתי מתחיל את isoclonal החדש, אסף שדה כנימות עלה אוכלוסיות ומניחים על כנימות עלה בודד, שחזור, למבוגרים על צמח פונדקאי מתאים כאמור שלב 1.6.
    הערה: אוכלוסיות עשוי להיות החל מכנף (alate) או unwinged (apterous) מבוגרים.
    1. לבדוק ידנית צמחים מן החממה עבור מזיקים בלתי רצויים קודם לשימוש עם מעבדה כנימות. להקפיא עציצים עם כנימות לא רצויים. במידת הצורך, השתמש flask ואקום של אתנול להסרת תריפסים או מזיקים אחרים.
      הערה: יש להקפיד לשטוף את הצמחים שטופלו עם סבון לפני השימוש, כפי שמתואר בשלב 1.5.2.
    2. בבטחה העברה של כנימות עלה למבוגרים יחיד באמצעות מברשת או פיפטה בפה שנוצרו עם מזהה "3/16" x "1/4 צינורות פלסטיק OD, טיפ פיפטה µL 1000 וטיפ פיפטה µL 2.00 (איור 2א).
    3. לכסות בצורה מאובטחת צמחים עם כנימות עם כלוב גביע שנוצרו עם כוס פלסטיק עם הגג חתכו, מכוסה רשת קנס ומאובטחים עם קלטת (איור 2B).
    4. המקום שורץ כנימות עלה צמחים מגש ולשמור בחדר הסביבה מבוקרת (16 L: 8D, 22 ° C, 70% לחות).
  3. כדי לשמור על האוכלוסיות מניות, להעביר כנימות טרי, חדש צמחים שבועי (2.2.1–2.2.3).
    1. בבטחה להעביר 3-1 2nd או 3rd instar נימפות ואל כנימות למבוגרים בגילאי 1 באמצעות פיפטה של הפה (איורים 2 א, 3).
      הערה: מניות מתוחזקים בצורה הטובה ביותר על ידי העברת unwinged יחידים.
    2. בצורה מאובטחת לכסות את הצמחים שורצי כנימות עלה עם כלוב גביע שנוצרו עם כוס פלסטיק עם העליון מנותקים, מכוסה רשת קנס ומאובטחים עם קלטת.
    3. למקם צמחים מגש ולשמור כנימות בתא הסביבה (16 L: 8D, 22 ° C, 70% לחות).
    4. לחלופין, אם הרצויה ולהשתמש אם המפעל המארח של איכות סבירה, flask ואקום אתנול כדי להפחית אוכלוסיות עוזב את היחידה להתרבות למבוגרים 2 ו- 3 השנייה או השלישית וחמישית.
  4. כדי ליצור אוכלוסיות באותו גיל לשימוש בניסויים, במקום עד 5 מבוגרים (רצוי unwinged) מהאוכלוסייה מניות על גבי הצמח הפונדקאי החדש.
    1. הסר את המבוגרים 24 שעות מאוחר יותר.
    2. בערך 5-7 ימים מאוחר יותר, ברגע אופספרינג1 נ הבשילו לבגרות, במקום עד 5 מבוגרים1 F unwinged על הצמח הפונדקאי החדש. הסר את המבוגרים 24 שעות מאוחר יותר.
    3. ברגע האוכלוסייה2 F והתבגרה לבגרות, אוכלוסייה זו היא מוכנה לשמש בניסויים.
      הערה: תהליך זה מבטיח כי האוכלוסייה ניסיוני הוא בערך באותו גיל, נולדו לאמהות בערך באותו גיל.
  5. לאשר את ההבדלים genotypic בין קווי שדה-תפסו isoclonal באמצעות microsatellite genotyping (המתוארות להלן, בסעיפים 3 ו-4).

3. דנ א החילוץ

  1. הכנה
    1. להשתמש בטכניקות סטריליות להכין מאגר של פירוק 1 ליטר (0.1 M NaCl, 0.2 M סוכרוז, M 0.1 טריס (pH 9.1), 0.05 M EDTA, 0.05% מרחביות).
    2. לחמם את הבלוק חימום או רשמים עד 65 ° C.
  2. רקמות המגון והמסה
    1. מניחים על מימדיה ליד החלק התחתון של צינור סטרילי, microcentrifuge 1.5 מ.
    2. למקם את שהעקב סטרילי בצינור עם מימדיה, לטבול לתחתית הצינור בחנקן נוזלי.
      הערה: התפוררות רקמות אופטימלית מושגת כאשר מימדיה ממוקם בין איחדו את הצד של הצינור.
    3. לטחון על מימדיה עם המרוסקים כדי בתחילה lyse תאים.
    4. לשימוש למבוגרים כנימות עלה בודד, µL 200 (לפצל 2 x 100 µL aliquots) המאגר פירוק. להוסיף את aliquot הראשונה כדי לטחון, resuspend על מימדיה כתוש עד המדגם היא התפוררה בעליל ולאחר מכן השתמש את aliquot השני כדי לשטוף את המרוסקים.
    5. דגירה כנימות כתוש במאגר פירוק ב 65 ° C בבלוק מים באמבטיה או חום למשך 30 דקות.
  3. משקעים דנ א
    1. בעוד הצינור חם, להוסיף µL 14 של 8 מ' KOAc. היפוך צינור כדי לערבב. לאחסן את דגימת קרח למשך 30 דקות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, דוגמאות שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 24 שעות.
    2. צנטריפוגה ב x 13,000 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 mL החדש עם פיפטה. יש להיזהר לא להסיר את כל ההריסות pelleted.
    3. כדי לשפר את ה-DNA צניפה ויזואליזציה, להוסיף µL 2 גליקוגן (20 µg/mL) תגובת שיקוע. אם גודל המדגם הוא גדול מספיק, להשמיט שלב זה.
    4. להוסיף 200 µL של אתנול ברמה המולקולרית 100% קר תגובת שיקוע. היפוך צינורות כדי לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, דוגמאות שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 24 שעות.
    5. צנטריפוגה ב x 13,000 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר אתנול על ידי pipetting.
  4. ה-DNA רוחצים את • תנאי
    1. להוסיף 200 µL של אתנול ברמה המולקולרית 70% קר. ואז קפיצי הצינור resuspend. ולשטוף את גלולה.
    2. צנטריפוגה ב 13,000 x g למשך 5 דקות. בעודכם מדמיינים בגדר, בזהירות להסיר האתנול על-ידי pipetting ולהוסיף 200 µL של אתנול ברמה המולקולרית 100% קר.
    3. צנטריפוגה ב 13,000 x g למשך 5 דקות. בעודכם מדמיינים בגדר, הסר בזהירות אתנול על-ידי pipetting.
      הערה: שטיפה של אתנול חוזר ה-100-70-100 במידת הצורך.
    4. האוויר יבש כדורי למשך 5 – 10 דקות עם הנחת צינור פתוח בצורה אופקית על נייר טישו.
    5. Resuspend בגדר DNA ב- 80 µL של טה נמוך (10 מ"מ טריס-HCl, 0.1 מ מ EDTA).
    6. לכמת את ה-DNA resuspended באמצעות ספקטרופוטומטרים.
    7. חנות ב 4 º C.

4. Microsatellite PCR ורצף עבור Genotyping כנימות עלה

  1. להזמין את המתאים F ו- R צבעי יסוד microsatellite רצף (טבלה 120).
    הערה: רצפים פריימר הפוך צריך להיות שונה עם תוויות פלורסנט 5-6-המשפחה או 5'-5-HEX כדי לאפשר את הדוגמאות מרובבת עבור רצף microsatellite.
  2. לבצע PCR עם דגימות די אן איי כנימות עלה בודד (המתוארים בסעיף 3), שכותרתו fluorescently microsatellite תחל.
    1. מערבבים תגובות PCR על פי הפרוטוקול של היצרן (0.2 µM F/R פריימר, 2.5 מ מ MgCl2, 50 – 200 ng תבנית ה-DNA).
    2. השתמש בהגדרות הבאות thermocycler: דנטורציה הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, 35 מחזורי 94 ° C ל 30 s, 58 ° C עבור 35 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s, וצעד התארכות הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות.
  3. לשלב דוגמאות PCR עם שונה פלורסנט תגיות כדי להפחית את מספר הדגימות וסודרו רצף הדגימות microsatellite במתקן genotyping.
  4. לנתח את הקבצים מדגם raw .fsa באמצעות תוכנת ניתוח microsatellite.

5. RNA החילוץ

  1. לאסוף הדגימות של כנימות לחילוץ RNA ב 1.5 mL RNase / נטול DNase מנורות להקפיא מיידית בחנקן נוזלי.
    הערה: אם השלבים הבאים לא יבוצעו באופן מיידי, הדגימות שניתן לאחסן ב- 80 ° c
  2. המגון רקמות
    1. עם שהעקב סטרילי בצינור עם כנימות עלה, להקפיא בחנקן נוזלי 10-15 שניות, עד לוהטת להפסיק הדגימה. קראש על מימדיה היטב עם איחדו כפי שמתואר בשלב 3.2.
      הערה: התפוררות רקמות אופטימלית מושגת כאשר מימדיה ממוקם בין איחדו את הצד של הצינור.
    2. בשכונה fume, להוסיף 800 µL של guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ ריאגנט המדגם (כנימות למבוגרים 1 – 5). Homogenize דגימות עם המרוסקים, השלך המרוסקים.
  3. שלב ההפרדה
    הערה: כל השלבים צריכה להתבצע בשכונה fume.
    1. דגירה בדגימות homogenized במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להוסיף µL 160 של כלורופורם הדגימה. טלטול נמרצות על ידי יד 15 s.
    2. תקופת דגירה של 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה למשך 15 דקות x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בעקבות צנטריפוגה, התערובת מפריד לתוך 3 שכבות: שלב התחתון, אדום פנול-כלורופורם, לאטמוספרה וגם שלב מימית העליון השקופה. הרנ א נשארת אך ורק בשלב מימית. נפח מימית יהיה ~ 480 µL.
  4. RNA משקעים
    1. בשכונה fume, להעביר את פאזה מימית צינור טריים, ללא RNase. נא לא להפריע שלב ביניים.
    2. לזרז את הרנ א על-ידי הוספת µL 400 של אלכוהול איזופרופיל, דגירה המדגם ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, דוגמאות שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 24 שעות.
    3. Centrifuge המדגם 10 דקות ב x 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
  5. RNA רוחצים את • תנאי
    1. הסר את תגובת שיקוע; watch בגדר RNA.
    2. לשטוף את צניפה RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול במים שטופלו DEPC. מערבבים על-ידי vortexing איטי. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 7,500 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
    3. חזור על צעדים 5.5.1–5.5.2 כדי לסייע בהסרת פנול מזהמים.
    4. הסר את תגובת שיקוע, אוויר יבש בגדר למשך 5-10 דקות עם הנחת צינור פתוח בצורה אופקית על ספסל סטרילי. אל תתנו בגדר RNA להתייבש לחלוטין.
    5. להמיס בגדר RNA ב 30 µL של מים נטולי RNase או שטופלו DEPC. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. דגירה ב 55 – 60 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.

6. RNAseq דה נובו Transcriptome הרכבה, ביאור, וניתוח ביטוי דיפרנציאלי

  1. לנתח RNA מדגם ריכוז ואיכות באמצעות שבב מערכת מבוססת-נימי electrophoretic.
    הערה: מערכת אלקטרופורזה נימי מבוססי שבב היא השיטה עדיף להתמקד מאשר ניתוח עם ספקטרופוטומטרים מכיוון שהוא מספק מדד מדויק ורגיש יותר של RNA ריכוז ואיכות.
    1. אם הדגימות באיכות מתאימה ≥ 250 ננוגרם הכולל, רין (RNA תקינות מספר) ≥ (5), לבצע רצף הרנ א.
      הערה: חשוב, כי נתונים אלה רצף ישמש להרכבה הן ביטוי פרופיל ו דה נובו transcriptome, שנקראו עומק יגרום transcriptome באיכות גבוהה יותר. אסיפה סביר מקיף בטכנולוגיה אילומינה רצף, לחץ דם 100 100-200 מיליון סוף לזווג קריאות יהיה נקודת פתיחה המומלצת. הכנה סה של ספריית ה-mRNA ורצף RNA בוצעו על ידי מתקן רצף.
  2. בדוק את איכות הקריאות באמצעות מהר QC22.
  3. לשלב את כל קריאות מדגם ולהרכיב את transcriptome דה נובו באמצעות טריניטי23,24 (Trimmomatic איכות סינון זמין).
  4. מקד את מכלול
    1. השתמש Transdecoder25 כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחה (ORFs) כי הם מינימום של 100 חומצות אמינו אורך.
    2. בצע חיפוש הומולוגיה ORFs מתורגמת נגד Pfam26 ו- UniProt27 מסדי נתונים באמצעות BLASTP28 ו- HMMER29, בהתאמה.
    3. להסיר התמלילים חיידקי (כל רצף המתורגם הטוב ביותר של מי פגע היה אל גנים חיידקיים עם ציון ביט של למעלה מ-300, זהות רצף חומצת אמינו מינימום של 50%).
    4. לכווץ את כל ORFs מלאה, מתורגם לפחות 99% זהה ברמת חומצת אמינו באמצעות תקליטור פגע30.
    5. לכווץ את ORFs הנותרים, שלם לפחות 95% זהים ברמה נוקלאוטיד באמצעות תקליטור פגע30.
    6. הקצאת רצפי את הנותרים עם מזהים ייחודיים, ספציפית (למשל, APHNE 0001).
  5. להעריך את שלמות התרגום של מכלול מעודן, באמצעות BUSCO (http://busco.ezlab.org/), פרוקי רגליים ג'ין הנתונים (dataset)31.
  6. ביאור Transcriptome
    1. ראשית, להוסיף את transcriptome מעודן באמצעות HMMER נגד26,מסד הנתונים Pfam29.
    2. שנית, להוסיף את transcriptome באמצעות BLASTP נגד27,מסד הנתונים UniProt28.
    3. שלישית, להוסיף את transcriptome באמצעות BLASTP נגד רצפי קידוד של חרקים שנבחרו עם הגנום שפורסם, המבואר.
    4. בפעם האחרונה, ביאור על transcriptome באמצעות BLASTP אפונה כנימות עלה חלבון במסד הנתונים בלבד.
    5. השתמש Trinotate כדי ליצור ביאורים ללכת מתוך UniProt accessions.
    6. השתמש Trinotate כדי לארגן את כל התוצאות ביאור לתוך מסד הנתונים SQLite ולהפיק דוח ביאור.
  7. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי
    הערה: שימוש transcriptome מעודן כנקודת התייחסות, ליישר ולכמת כל ספריה בנפרד.
    1. השתמש Trimmomatic כדי איכות-מסנן, חיתוך המקור לקרוא קבצי32.
      הערה: אם לבצע שלב זה לאחר אסיפה השילוש הקדוש, אחד עשוי במקום להשתמש הפלט Trimmomatic של הצעד הזה.
    2. בצע היישורים המקומי עבור כל דגימה באמצעות Bowtie233.
    3. לחלץ את ספירת קריאה מ כל מדגם בנפרד באמצעות SAMtools34.
    4. לחשב את הביטוי ההפרש בין דגימות עניין באמצעות DESeq2 עם הפרמטרים של ברירת המחדל ובכושר פרמטרי35.

7. qPCR אימות של הגנים באה לידי ביטוי באופן שונה

הערה: אם המשתמשים מעוניינות באופן שונה ביטוי הגנים הניסויים RNAseq שלהם, הפרוטוקול הבא יכול לשמש כדי לאמת דפוסי ביטוי דיפרנציאלי.

  1. ליצור דוגמאות RNA כמתואר לעיל (שלב 5).
  2. Quantitate עקירות RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי לבדוק האיכות וכדי להשיג את הריכוז.
  3. לסנתז דגימות cDNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית לפי ההמלצה של היצרן.
  4. לקבוע את היעילות פריימר על הגנים של עניין כדי להבטיח הגברה PCR כפולה מדויקת.
    1. מבוסס על ריכוז ה-RNA המקורי, ביצוע דילולים טורי (101) כדי להשיג ריכוזי cDNA 3.
    2. באמצעות שילוב מאסטר PCR כמותי, לערבב triplicate qPCR תגובות על פי הפרוטוקול של היצרן באמצעות שלושה ריכוזים פריימר (למשל, 100 ננומטר, 200 ננומטר, 300 ננומטר) עם cDNA באופן סדרתי מדולל שלושה ריכוזים (לדוגמה, 0.1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
    3. עבור כל יעד ג'ין, לחשב את השיפוע (ז) של קו שנוצר באמצעות ערכיt C כלומר עבור כל דגימה המשתנים התלויים, ביומן (ריכוז cDNA) כמו המשתנים הבלתי תלויים (שלוש נקודות סה כ).
    4. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את היעילות פריימר (E), כאשר m הוא השיפוע מחושבת באופן 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      הערה: פריימר היעילות בין 90-110% מתאימים ניתוחים. תהליך זה מבטיח שווה הגברה של כל הגנים הכלולים החישובים.
  5. השתמש בשיטתt ΔΔC עם גנים משק לכמת את הביטוי דיפרנציאלי עבור גנים של עניין36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צמח תרבויות: זרעים ייקח בערך שבועיים עד ארבעה שבועות, תלוי בעונה, לגדול גדול מספיק כדי להיות מחדש בעציץ (איור 1א'). שתילים מחדש בעציץ ייקח עוד שבועיים עד ארבעה שבועות לגדול לגודל האופטימלי עבור תרבויות כנימות עלה (איור 1B).

כנימות עלה תרבויות: למבוגרים nerii א נבדלים על ידי כמה תסמונת החשוך וייתכן unwinged (apterous, איור 3, ב') או כנפיים (alate, איור 3C, D). רפידות אגף פיתוח הופכים לגלויים כאשר נימפות להגיע לחלל את השלישי (איור 3E, F). תרבויות מלאי נשמרות בצורה הטובה ביותר על ידי העברת לחלל באמצע אחד עד שלושה, אחד בגיל מבוגר unwinged כנימות; פעולה זו מבטיחה תינוק בריא מעורב אוכלוסיית גיל. צריך להיות תרבותי אוכלוסיות שישמש עבור ניסויים באמצעות כנימות unwinged כפי שתואר לעיל (2.4). Nerii א מבוגר יכול לייצר 3-10 צאצאים ליום, תלוי מצמח פונדקאי וגילו של כנימות עלה10.

עקירות DNA ו- RNA: יחיד, למבוגרים א nerii תניב כ 100-200 ng/µL DNA (• תנאי 80 µL; איור 4 A) ו- 150-300 ng/µL RNA (• תנאי 30 µL; איור 4 B). microsatellite נציג פסגות מוצגים באיור5. נציג היחסי ביטוי של גנים המועמד תחת שלושה תנאים (פקד, טיפול 1, טיפול 2) לחשב בטבלה מס ' 2 , המוצגת באיור 6.

Figure 1
איור 1 : עבור תרבויות כנימות עלה נציג הצמחים. שתילים (א) יכול להיות מחדש בעציץ לאחר שהם פיתחו שלהם הסט המלא הראשון של עלים אמיתי. צמחים (B) יכול לשמש עבור תרבויות כנימות עלה כאשר הם פיתחו 3-4 סטים של עלים אמיתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : דוגמאות של כלים המשמשים culturing כנימות. (א) הפה פיפטות יכולים להיווצר באמצעות מזהה "3/16" x "1/4 צינורות פלסטיק OD, טיפ פיפטה µL 1000 וטיפ פיפטה 200 µL. (ב, ג) השתמש הכלובים גביע (כוסות פלסטיק שקוף עם הגג לחתוך ומאובטחים עם רשת קנס) כדי להתאים בצורה מאובטחת מעל פנימה 4 סירים המשמש תרבויות כנימות עלה. זה מאפשר בשפע אור ואוורור כדי ליצור סביבה מתאימה כנימות, צמח, ושומר כנימות הכיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : מבוגר נציג, נימפה Aphis nerii. (A, B) למבוגרים (unwinged) apterous nerii א מזוהים על ידי תסמונת החשוך בקצה האחורי שלהם. (C, D) Alate מבוגרים (כנפיים) המזוהה על-ידי כנפיים מפותחת, הקדירו תסמונת-את ישבנה שלהם. (E, F) נימפות nerii א המתפתח לעבור ארבעה שלבים לחלל, רפידות אגף פיתוח ומצביעים במהלך השלב השלישי לחלל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ג'לים נציג. (א) ה-DNA עקירות (הסולם 1 kb). עקירות דנ א nerii א שבע הם דמיינו הנמצאים בסמטאות 3-9. בקרה שלילית היא בנתיב 10. (B) RNA עקירות. עקירות RNA nerii א 11 הם דמיינו הנמצאים בסמטאות 3-13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : פסגות נציג microsatellite. פסגות 6 FAM-מתויג הם דמיינו בכחול. ליז-500 הסולם מוצג בכתום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : qPCR אימות של גנים ביטוי באופן שונה. נציג ביטוי כמות יחסית (RQ) mRNA (מחושב באמצעות שיטת ΔΔCt, בטבלה 2) המוצג עבור גן המועמד עניין תחת שלושה תנאים: שליטה, טיפול 1, טיפול 2. התרשים מראה ירידה בביטוי של המועמד ג'ין תחת טיפולים 1 ו- 2 בהשוואה הפקד (טבלה 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פריימר שם כיוון רצף (5' - 3')
Ago24_F קדימה TTTTCCCGGCACACCGAGT
Ago24_R הפוך GCCAAACTTTACACCCCGC
לפני 53_F קדימה TGACGAACGTGGTTAGTCGT
לפני 53_R הפוך GGCATAACGTCCTAGTCACA
לפני 59_F קדימה GCGAGTGGTATTCGCTTAGT
לפני 59_R הפוך GTTACCCTCGACGATTGCGT
לפני 66_F קדימה TCGGTTTGGCAACGTCGGGC
לפני 66_R הפוך GACTAGGGAGATGCCGGCGA
לפני 69_F קדימה CGACTCAGCCCCGAGATTT
לפני 69_R הפוך ATACAAGCAAACATAGACGGAA
לפני 84_F קדימה GACAGTGGTGAGGTTTCAA
לפני 84_R הפוך ACTGGCGTTACCTTGTCTA
לפני 89_F קדימה GAACAGTGCTCGCAGTCTAT
לפני 89_R הפוך GACAGCGTAAACATCGCGGT
לפני 126_F קדימה GGTACATTCGTGTCGATTT
לפני 126_R הפוך TAAACGAAAAAACCACGTAC

טבלה 1: רצפים פריימר Microsatellite נהגה גנוטיפ Aphis nerii 20 .

היעד מדגם Ct אומר Ct סטנדרטי Dev ΔCt ממוצעת של ΔCt ΔΔCt RQ=2^(-ΔΔCt) RQ SEM
ef1a 1.1 22.59 0
ef1a 1.2 20.31 0
ef1a 1.3 20.36 0.226
ef1a 1.4 20.27 0.036
ef1a 1.5 20.55 0.003
ef1a 1.6 20.52 0.245
ef1a 2.1 20.49 0.082
ef1a 2.2 19.86 0.033
ef1a 2.3 20.19 0.037
ef1a 2.4 19.67 0.058
ef1a 2.5 20.25 0.188
ef1a 2.6 18.16 0.089
ef1a 3.1 20.93 0.157
ef1a 3.2 20.22 0.003
ef1a 3.3 20.44 0.039
ef1a 3.4 20.91 0.559
ef1a 3.5 20.63 0.017
ef1a 3.6 20.3 0.135
ג'ין עניין 1.1 24.6 0.173 2.01 0 1
ג'ין עניין 1.2 24.25 0.019 3.94 2.975 0 1 0
ג'ין עניין 1.3 24.79 0.04 4.43 0 1
ג'ין עניין 1.4 25.23 0.285 4.96 4.695 0 1 0
ג'ין עניין 1.5 24.6 0.103 4.05 0 1
ג'ין עניין 1.6 25.08 0.033 4.56 4.305 0 1 0
ג'ין עניין 2.1 27.52 0.155 7.03 5.019033762 0.03084042
ג'ין עניין 2.2 27.23 0.061 7.37 7.2 3.428355679 0.092888533 0.031024057
ג'ין עניין 2.3 27.18 0.058 6.99 2.56158174 0.169389724
ג'ין עניין 2.4 27.45 0 7.78 7.385 2.820764967 0.141535419 0.013927153
ג'ין עניין 2.5 27.44 0.032 7.19 3.138956897 0.113521944
ג'ין עניין 2.6 28 0 9.84 8.515 5.284272079 0.025661119 0.043930413
ג'ין עניין 3.1 27.23 0.143 6.3 4.292437371 0.051032588
ג'ין עניין 3.2 27.05 0.088 6.83 6.565 2.891234282 0.134788164 0.041877788
ג'ין עניין 3.3 27.45 0.109 7.01 2.578145722 0.167456035
ג'ין עניין 3.4 27.58 0.019 6.67 6.84 1.709038085 0.305863936 0.069203951
ג'ין עניין 3.5 27.06 0.067 6.43 2.384498984 0.191511246
ג'ין עניין 3.6 27.36 0 7.06 6.745 2.513723938 0.175103043 0.008204101

בטבלה 2: חישובים עבור qPCR ΔΔC t אימות של המועמד ג'ין. ביטוי גנים המועמד מחושבת ביחס ef1a (איור 6). דוגמאות מייצגות 1.1-1.6 ביולוגית שישה משכפל תחת הטיפול שליטה; דוגמאות מייצגות 2.1-2.6 ביולוגית שישה משכפל תחת טיפול 1; דוגמאות מייצגות 3.1-3.6 ביולוגית שישה משכפל תחת טיפול 2. Ct סטיית תקן * מחושבת על פי משכפל טכני 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זה זמן הוכר כי aposematic nerii א יכולה לספק תובנות דפוסים ומנגנונים של התנגדות צמח ההגנות ו פחמיות כימי במיוחד18,37. לאחרונה הופיעו מספר משאבים גנומית nerii א10, המציע הזדמנויות חדש אקולוגי ופונקציונליים גנומית מחקרים המשתמשים nerii א כמודל. אנחנו חלוקה לרמות הפרוטוקולים הבסיסיים כנימות עלה וצמח תרבות וטכניקות מולקולרית/גנומית, עם ההנחה בעבודתה העתידית על מין זה ככל הנראה יהיה כרוך מחקרים לנצל גישות אקולוגיה גנומית ופונקציונליים. שאלות פתוחות רבות נשארות על מנגנונים ועל המשמעות של cardenolide רעלים ושחרור פחמיות ב- nerii א. טכניקות כגון RNAi ביטוי נוקאאוט או ג'ין עריכה גישות יוכיח בעל ערך בהקשר זה.

אחד מאתגרי culturing כנימות הוא בתפקידים עצום שלהם כדי להפוך את רבייה פיזור. התכונות הללו, אשר מתייחסות ישירות ל למה הם יבול רציני מזיקים, כלומר תרבויות כנימות עלה דורשים תשומת לב כמעט מדי יום, כמו טוב טיפול קיצונית אם קווים isogenic נדרשים עבור ניסויים. השיטות שתוארו לעיל, כולל אלה ליצירת נתונים לניתוח של ביטוי גנים, בעוד בדומה פרוטוקולים כללי לגידול כנימות עלה וניתוח מולקולרית, לספק מדריך צעד אחר צעד מסוים כדי לייצר מספיק ביולוגית חומר nerii א עבור קבוצה מגוונת של יישומים מולקולרי ואקולוגי.

למטרה זו, אם תפקודית או אקולוגיה גנומית מחקרים על האופק עבור nerii א, אלה יהיה עליך להיות בשילוב עם תרבויות חיים לנצל באופן מלא את ההזדמנויות ניסיוני שהם מציעים. אוכלי חרקים חיים ביישובים מורכבים על צמחים פונדקאים שלהם, ועל הן אינטראקציות intraspecific38,39 , כמו גם אינטראקציות interspecific40 צורת התגובה האולטימטיבית של nerii א שלהם צמחים פונדקאים . הצמחים המארח, nerii א מתמחים, מייצגים קבוצה מגוונת של צמחים המבטאים מתפצלת על החיים אסטרטגיות15,21, דבר המלמד את החשיבות של צימוד גישות גנומית גרידא או פיזיולוגי עם מניפולציות נסיוני להסביר טבעי וריאציה בקהילות nerii א . השיטות המתוארות כאן מתחילות נקודות מבט גנומית פונקציונלי ואקולוגי nerii א ואת האינטראקציות שלה עם צמחים פונדקאים רעילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות מישל הירח (אוניברסיטת ואנדרבילט) לקבלת סיוע עם הצילום. אוניברסיטת ואנדרבילט סיפק תמיכה ברשות הפלסטינית, SSLB נתמך על ידי DGE-1445197.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sun Gro Fafard Germination Mix Hummert International 10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix Hummert International 10-0951-2
2" x 4" Round Standard Pot Anderson Pots 1503
DreamTaq DNA Polymerase ThermoFisher Scientific EP0701
Trizol ThermoFisher Scientific 15596026
SuperScript® III First-Strand Synthesis kit ThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific 4367659

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313 (2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180 (2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524 (2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31 (2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417 (2010).

Tags

גנטיקה גיליון 138 כנימות עלה חממה לבנבן microsatellite RNAseq qPCR צמח-חרק אינטראקציה
שמירה על תרבויות ביולוגי מדידה ביטוי גנים ב <em>Aphis nerii</em>: מערכת Non-מודל עבור אינטראקציות צמח-חרק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C.,… More

Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Abbot, P. Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions. J. Vis. Exp. (138), e58044, doi:10.3791/58044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter