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Artigo de método

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

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DOI:

10.3791/58051

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25 de setembro de 2018

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1Circulating Tumor Biomarkers Laboratory, SiRIC, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 2CNRS UMR144, Institut Curie, PSL Research University, 3Department of Medical Oncology, Institut Curie, PSL Research University, 4University Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 5University Paris Descartes, 6Inserm U830, Institut Curie, PSL Research University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Resumo

Reação em cadeia da polimerase digital da gota (ddPCR) é um método de reação em cadeia (PCR) polimerase quantitativos altamente sensível baseado no fracionamento de amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo. Recentemente, ddPCR tornou-se uma das ferramentas mais precisas e sensíveis para a deteção de DNA (ctDNA) tumor de circulação. Uma das principais limitações da técnica padrão ddPCR é o número restrito de mutações que podem ser rastreados por reação, como sondas de hidrólise específica reconhecendo cada possível versão alélico são necessárias. Um método alternativo, o ddPCR de entrega, aumenta a taxa de transferência, pois requer apenas um único par de sondas para detectar e quantificar potencialmente todas as alterações genéticas na região alvo. Entrega ddPCR exibe sensibilidade comparável para ensaios de ddPCR convencional com a vantagem de detectar um maior número de mutações em uma única reação. É cost-effective, conserva o material precioso de amostra e também pode ser usado como uma ferramenta de descoberta quando mutações não são conhecidas a priori.

Introdução

Milhares de mutações somáticas relacionadas ao desenvolvimento de câncer foram relatados1. Entre estes, alguns são marcadores preditivos da eficácia da terapia-alvo 2,3 e genética triagem destas mutações é agora rotina clínica. Tecnologia digital de PCR (ddPCR) da gota pode ser usada para monitorar a presença ou ausência de mutações com exatidão elevada da deteção e é altamente compatível com não-invasivos biópsias líquido4,5. No entanto, ensaios de ddPCR atual principalmente são projetados para detectar mutações conhecidas a priori. Isto limita severamente o uso de ddPCR como uma ferramenta de descoberta quando a mutação é desconhecida. Com efeito, na concepção convencional ddPCR, uma sonda de hidrólise, reconhecendo o alelo selvagem-tipo (sonda de WT) concorre com uma sonda específica, reconhecendo o alelo mutante (MUT sonda) (figura 1A). A sonda com maior afinidade se para o modelo e libera seu fluoróforo, indicando a natureza do alelo correspondente. Os dados de fluorescência obtidos para cada gota podem ser visualizados em um gráfico de dispersão representando a fluorescência emitida por sondas WT e MUT em dimensões diferentes. Uma representação esquemática de um resultado típico para um ensaio de ddPCR convencional é apresentada na figura 1A. Neste exemplo, a nuvem azul corresponde as gotículas contendo alelos WT identificados pela sonda WT, Considerando que a nuvem vermelha corresponde a gotículas no qual o alelo MUT foi amplificado e identificado pela sonda MUT. Dependendo da quantidade de DNA carregado na reação, duplas positivas gotículas contendo tanto WT e MUT amplicons podem aparecer (nuvem verde). A nuvem de cinza luz corresponde ao vazias gotículas.

Desde que a maioria das plataformas de permitir a detecção de um número limitado de fluorophores (normalmente 2, mas até 5), a taxa de transferência de ddPCR convencional é limitada. Portanto, segmentando regiões com várias mutações adjacentes requer projeto de tecnicamente desafiador multiplex ddPCR ensaios ou o uso de múltiplas reações alvejando cada mutação em paralelo. A estratégia de ddPCR de entrega, supera essa limitação como potencialmente pode detectar qualquer alteração genética dentro de uma região de destino usando um único par de sondas de hidrólise do WT. As tampas de sonda (Probe 1) primeiras que uma sequência não-variável, adjacente à região de destino e a segunda sonda (sonda 2) é complementar à sequência de WT da região de destino, onde as mutações são esperados (figura 1B). Enquanto a primeira sonda quantifica a quantidade total de moléculas ampliáveis na reação, a segunda sonda discrimina WT e MUT alelos por hibridação sub-ótimo para sequências de mutantes. Sonda 2 pode identificar vários tipos de mutações na região (substituições de nucleotídeo único ou múltiplo, exclusão, etc.) alvo6. Como em ddPCR convencional, a nuvem de cinza luz corresponde a gotículas não contendo nenhuma molécula de DNA. É importante recordar que, neste tipo de ensaio, separação ideal de nuvens WT e MUT é dependente da quantidade de DNA carregado na reação, desde que gotículas contendo tanto WT e MUT alelos de destino não podem ser distinguidas gotículas contendo apenas o WT formulário. Portanto, este ensaio requer que a maioria das gotículas contenham não mais de uma cópia do gene alvo.

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Protocolo

O protocolo aqui apresentado segue as diretrizes de ética do Institut Curie. Todas as amostras humanas foram obtidas de pacientes matriculados, após consentimento informado, em estudos aprovados pelo Conselho de revisão institucional no Institut Curie.

1. recolha, armazenamento de Plasma e extração de DNA sem célula de sangue

Nota: O DNA extraído de qualquer tipo de "tecido" pode ser usado (por exemplo, fresco ou formaldeído-fixo parafina incorporado tecidos (FFPE), células em cultura ou sangue amostras). Aqui, nós fornecemos instruções detalhadas para a coleta de sangue, plasma isolamento e armazenamento e extração de DNA (cfDNA) sem célula.

  1. Armazenamento de coleção e o plasma de sangue (Figura 2B)
    1. Colete amostras de sangue em tubos de EDTA de 7 mL. Dois tubos são recomendados para coletar cerca de 4 mL de plasma.
    2. Centrifuga os tubos por 10 min a 820 x g , dentro de 3 h da para separar os glóbulos vermelhos (RBC), glóbulos brancos (WBC) e plasma de sangue. O tempo entre a amostragem e a centrifugação é fundamental para obter cfDNA de alta qualidade (i.e., cfDNA não contaminado com DNA liberado de WBC).
    3. Cuidadosamente, pipetar o sobrenadante (plasma) utilizando uma pipeta de 1ml sem tocar a camada de WBC; cerca de 2 mL de plasma geralmente são recuperados por tubo EDTA.
    4. Transferir o plasma para tubos de 2 mL e centrifugar as alíquotas a 16.000 x g durante 10 minutos a 15 ° C, para remover restos de célula.
    5. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante (plasma), sem perturbar o sedimento. Distribuir o plasma em tubos criogênicos de 2ml e armazenar a-80 ° C até ser necessário.
  2. cfDNA extração (Figura 2B)
    Nota: Aqui, apresentamos o procedimento usando o kit de extração manual. Uma versão automatizada, seguindo as instruções do fabricante também pode ser realizada para isolamento de cfDNA.
    1. Colocar 400 µ l de Proteinase K em um tubo de 50 mL. Adicione 4 mL de plasma (volume rotineiramente usados) e 3,2 mL de tampão de Lise ACL (contendo 1,0 µ g de RNA do portador) do kit. Fechar o tubo e misture vortexing por 30 s para obter uma solução homogénea. Incube a 60 ° C por 30 min.
    2. Adicione 7,2 mL de tampão ACB (do kit) para o lisado para otimizar a ligação dos ácidos nucleicos circulantes para a membrana de silicone e misture por num Vortex para 15 a 30 s.. Incubar o tubo por 5 min no gelo.
    3. Coloque a coluna e o extensor de 20 mL para a bomba de vácuo. Feche as posições não utilizadas para permitir a aspiração de vácuo.
    4. Com cuidado, aplique a mistura ACB lisado-tampão para o prolongamento do tubo (brevemente centrifugar o tubo para coletar o máximo de mistura ACB lisado-tampão), ligar a bomba de vácuo e permitir que o lisado a ser desenhado pelas colunas completamente. Remova e descarte o prolongamento do tubo.
    5. Aplica 600 µ l de tampão ACW1 para a coluna. Quando o buffer de ACW1 tem atraído através da coluna, adicione 750 µ l tampão ACW2 e finalmente adicionar 750 µ l de etanol (96-100%). Em seguida, coloque a coluna em um tubo de coleta de 2ml limpo e centrifugar a toda velocidade (20.000 x g) por 3 min eliminar o etanol.
    6. Coloca a coluna em um novo tubo de coleta de 2 mL. Abra a tampa e incubar a 56 ° C durante 10 minutos para secar a membrana.
    7. Coloque a coluna em um tubo de ligação baixa de DNA limpa 1,5 mL. Aplique cuidadosamente 36 µ l de água livre de RNase com 0,04% de azida sódica (tampão de AVE). Feche a tampa e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
    8. Centrifugar a velocidade máxima (20.000 x g) durante 1 min eluir os ácidos nucleicos e armazenar a-20 ° C até ser necessário.
  3. quantificação de cfDNA
    Nota: cfDNA quantificação é realizada com um dados usando o protocolo do fabricante imediatamente após a extração ou descongelar as amostras à temperatura ambiente (RT), antes da utilização. Evite múltiplos ciclos de congelamento/descongelamento.
    1. Use o ensaio de alta sensibilidade de acordo com a quantidade de cfDNA esperado, que é geralmente inferior a 100 ng/mL plasma. cfDNA concentrações variam de 2 a 10 ng/mL para doadores saudáveis mas podem ser tão altas quanto 100 ng/mL em pacientes com doença metastática.
    2. Certifique-se de todos os reagentes estão em RT e misturam 199 µ l de tampão de diluição de dados com 1 µ l de corante (200x) por reação (N número de amostras + 2 padrões para calibrar os dados) para obter uma solução de trabalho.
    3. A solução de cfDNA cuidadosamente para garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior do tubo de vórtice.
    4. Mistura de 5 µ l de cada amostra de cfDNA com 195 µ l da solução de trabalho.
    5. Mix 10 µ l de cada norma com 190 µ l da solução de trabalho.
    6. Vórtice minuciosamente todos os tubos para 2-3 s garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior dos tubos.
    7. Incube a RT por 2 min no escuro.
    8. Leia os tubos em dados, usando o modo de saída 'ng / µ l'
    9. Calcular a concentração final em ng/mL de plasma como segue: ng / µ l x 36 (volume de eluato cfDNA) / 4 (volume de plasma extraído).

2. ddPCR sonda e Primer Design (Figura 2A)

Nota: A amplificação das moléculas alvo no ensaio de ddPCR de entrega segue princípios semelhantes de qPCR. Cada primer e sonda é projetado com o software dedicado convencional Primer37 (http://primer3.ut.ee/).

  1. Projeto da primeira demão
    1. Na janela de configurações gerais, altere 'concentração de cátions divalentes' para 3,8, 'concentração de dNTPs' para 0,8 e ' mispriming/repetição biblioteca ' para o organismo correto.
    2. Na janela de configurações de avanço, altere a 'Tabela de parâmetros termodinâmicos' e a 'fórmula de concentração de sal' a Santa Lucia 1998.
    3. Escolha um Tm entre 55 e 70 ° C (com 50 mM para a concentração de sal e 300 nM para a concentração do oligonucleotide).
    4. Verifica a especificidade das primeiras demão usando ferramentas como o PrimerBlast.
    5. Evite as regiões que têm estruturas secundárias.
    6. Escolha uma sequência que tem um conteúdo GC de 50 – 60%.
    7. Evite repetições de Gs e mais de 3 bases de Cs.
    8. Escolha as primeiras demão com Gs e Cs na sua extremidade 3' quando possível.
    9. Certifique-se de que 3' extremidades de iniciadores emparelhados não têm significativa complementaridade para evitar a primeira demão-dímeros. Amplicons deve ser menor do que 150 bp para amplificar eficientemente cfDNA (quer dizer tamanho é 170 bp8) e DNA extraído da FFPE, que muitas vezes é fragmentado.
  2. Projeto sonda
    Nota: Sondas de hidrólise são rotuladas com um repórter fluorescente na extremidade 5' e um quencher na extremidade 3'. Eles fornecem alta especificidade, alta relação sinal-ruído e permitem multiplexação se necessário. Leitores de gotículas de dois canais são compatíveis com corantes FAM e HEX ou vítima, bem como análise de FAM/HEX ou FAM/VIC acoplado sondas.
    1. Desenha a hidrólise sondas complementares à sequência de WT da região alvo e região adjacente não variável.
    2. Escolha sondas que ambos localizados dentro o amplicon definido pelo par de primer previamente concebido. Sequências da primeira demão não podem sobrepor-se com as sequências de sonda, embora eles podem sentar-se ao lado do outro.
    3. Escolha o fio que tem Cs mais do que a Gs. sondas devem ter um conteúdo GC de 30-80%.
    4. Selecione sondas que estão entre 13 e 30 nucleotídeos de comprimento. Mais sondas tendem a exibir maior fluorescência de fundo porque a distância entre o fluoróforo e o quencher afeta a têmpera do repórter fluoróforo.
    5. Selecione Tm das sondas para 3 a 10 ° c superior a Tm dos primers para assegurar a sonda hidrólise durante o recozimento da primeira demão e extensão. Potenciadores dem T são recomendados para alcançar a necessária Tm , mantendo a sonda curta, como sondas mais curtas discriminam variantes de nucleotídeo único mais eficientemente. Sondas não devem ter um G na extremidade 5' porque isto mata o sinal de fluorescência mesmo após hidrólise.
    6. Concepção de sondas de entrega como segue: 5'-(VIC) -sequência WT complementar da região mutante-(MGB NFQ)-3' e referência sonda como: 5'-(6-FAM) -sequência complementar de uma região não-variável-(MGB NFQ)-3'. Outras combinações de repórter/quencher também são possíveis.

3. otimização da ddPCR reação (Figura 2A)

Nota: Controles de DNA de tipo selvagem e mutante utilizado nesta etapa podem ser obtido linhas celulares, amostras de tumor ou padrões de referência de DNA comercialmente disponíveis, por exemplo.

  1. Realize uma PCR convencional em um termociclador usando o recurso de gradiente térmico para validar a especificidade do produto do PCR amplificado por primers desenhados.
    1. Prepare uma mistura única de reação de PCR conforme descrito abaixo no passo 4.1 (sem sondas) em um modelo de controle de DNA do selvagem-tipo para um mínimo de 8 reações para ter pelo menos uma reação para cada temperatura.
    2. Execute a amplificação usando o programa descrito no passo 4.3.2 e uma gama de temperaturas de recozimento em torno da temperatura de recozimento teórica dos primers.
    3. Carrega produtos PCR em um gel de agarose a 3% para selecionar para recozimento temperaturas fornecendo produtos específicos.
  2. Realize uma série de drop-off ddPCRs usando os parâmetros descritos acima, mas desta vez incluindo ambas as sondas.
    1. Use 100% WT DNA, DNA de MUT 100% e uma mistura de WT e MUT DNA (por exemplo, 50% MUT/50% WT) para determinar as melhores condições para a separação clara de WT e MUT nuvens da gota.
    2. Escolha um intervalo de temperaturas de recozimento acima da temperatura escolhida na etapa 4.1.
    3. Selecione a temperatura do recozimento que permite detecção específica de WT ou MUT sinais quando usando 100% WT DNA ou 100% DNA MUT e melhor separação de WT e MUT nuvens da gota.
    4. Recozimento de concentrações de tempo e primer/sonda também pode ser ajustado para melhorar a separação das nuvens e diminuir o número de gotas com fluorescência intermediária (efeito de chuva).
  3. Avaliar o plano de fundo ou o limite de espaço em branco (LOB) do ensaio.
    1. Realize um mínimo de 48 reações de ddPCR de entrega individuais com um controle WT DNA usando os parâmetros de recozimento e concentrações de primers/sondas escolhidas no ponto 3.2.
    2. Para cada reação, calcular a frequência do alelo mutante (MAF) da seguinte forma: (número de mutante gotículas/número de gotículas enchidos) x 100.
      Nota: O LOB é definido como a média MAF de falso-positivos e associado SD a partir do qual o intervalo de confiança de 95% (95% CI) é calculado. LOB = (média de falso-positivos MAF) + 95% CI.
  4. Avalie o limite de detecção (LOD) do ensaio.
    1. Realizar reações de ddPCR de entrega utilizando diluições em série do MUT DNA no DNA da WT, com esta variando de 5% a 0,01% (≥ 8 repetições por condição). Use concentrações de parâmetros e primeiras demão/sondas recozimento escolhidas no ponto 3.2.
      Nota: O LOD é definido como os menores valores MAF para o qual replica valores médios presentes e SD acima o LOB (ver Decraene et al 6 para mais detalhes).

4. ddPCR protocolo (Figura 2B)

Nota: DdPCR semelhante ao convencional, o protocolo de ddPCR de entrega consiste em 4 etapas: (i) PCR mix preparação, geração (ii) da gota, amplificação por PCR (iii) e aquisição de dados (iv).

  1. Preparação de mistura PCR
    1. Siga as precauções padrão, tais como luvas, usando um capuz PCR limpo, limpas pipetas e RNase, livre de DNase água destilada, para evitar contaminação.
    2. Descongelar e equilibrar os componentes de reação no RT
    3. Prepare 20 x primeiras demão/sondas mistura em água destilada, com primers em 18 µM cada e sondas em 5 µM cada.
    4. Para todas as reações de PCR individuais, prepare uma mistura de amostra, combinando 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 µ l de 20 x mistura de primers/sondas e até 10 ng DNA amostra qsp 20 µ l de água destilada.
    5. Vórtice a reação misture bem para garantir a homogeneidade e brevemente centrifugar para coletar conteúdo na parte inferior do tubo antes do fornecimento. Não hesite em repetir essa etapa para cada mistura de reação antes da utilização.
  2. Geração de gotículas
    1. Insira o cartucho de ddPCR no suporte e carregar 20 μL da mistura de reação contendo amostras nos poços médios do cartucho para a geração de gotículas (posições verdes na Figura 2B) utilizando uma pipeta de 8 canais.
    2. Adicione 70 μL de óleo do gerador da gota para os poços de fundo (posições amarelos).
    3. Insira o cartucho, com uma junta, no gerador da gota; as gotas serão produzidas em poços de topo do cartucho (posições azuis).
    4. Aspirar e dispensar lentamente e delicadamente (para evitar distorção) 40 μL das gotas dos cartuchos em uma placa PCR de 96 poços. Use uma pipeta multicanal para otimizar a transferência das gotas.
  3. Amplificação por PCR
    1. Sele a placa final do PCR com uma folha de alumínio usando um aferidor de placa imediatamente após a transferência de gotículas para evitar a evaporação. Brevemente, centrifugar a placa para coletar conteúdo no fundo dos poços.
    2. Executar uma amplificação por PCR convencional em um termociclador usando o seguinte programa: 95 ° C 10 min, 40 ciclos de [94 ° C 30 s, validado recozimento T ° por 60 s], 98 ° C 10 min (rampa 2,5 ° C/s). Incluem controles sem entrada de DNA e o DNA de tipo selvagem (≥3 Replica) em cada execução.
    3. Quando a execução é concluída, centrifugue brevemente a placa para coletar conteúdo no fundo dos poços.
  4. Aquisição de dados
    1. Após a amplificação por PCR, use o leitor de gotículas contagem de PCR positivo e negativo PCR gotículas, seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: O leitor da gota geralmente oferece um sistema de detecção óptica de duas cores compatível com fluorophores FAM, VIC ou HEX.

5. análise de dados (Figura 2 e Figura 3)

Nota: PCR positiva e PCR gotículas são contados fornecer uma quantificação absoluta do MUT e os alelos WT na região do alvo. As gotas atribuídas são usadas para calcular o MAF em cada poço. Gotícula quantificação e análise de ensaios podem ser executados usando o pacote de ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) desenvolvido pela Attali e colegas9,10drop-off. Este pacote R classifica automaticamente as gotas como vazio, parte da "chuva" (devido a amplificação ineficiente), ou como preenchida com um sinal muito positivo (Figura 3). A seção a seguir apresenta as diferentes etapas da análise é uma breve versão da vinheta descritiva do algoritmo escrito pelos seus autores (ver algoritmo https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD para mais detalhes). Dados são exportados para arquivos de valores separados por vírgula (FileName_Amplitude.csv) e carregados no pacote ddPCR para ser analisado diretamente em R ou através da interface web dedicado.

  1. Ajustes de parâmetro
    Nota: Cada projeto de ensaio de queda resulta em distribuições específicas da gota final e variações na forma de nuvem, separações ou posições é de se esperar. Para garantir a eficiente análise automatizada, um conjunto de parâmetros deve ser reajustada. Se um bem tem um perfil inesperado, pode fazer a análise da placa inteira para falhar, resultando em uma mensagem de erro. A problemática bem terá que ser identificado e removido a análise automatizada.
    1. Identifica a falhados poços usando (REMOVE_FAILURES). Use o TOTAL_DROPS_T (o valor padrão é 5.000) para ajustar o número mínimo de gotas em cada poço. Use o EMPTY_LAMBDA_LOW_T (o valor padrão é 0.3) e EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (o valor padrão é 0,99) para ajustar as métricas que avaliem as nuvens de gotículas esperada (vazio, MUT, WT) e sua qualidade.
      Nota: Ter muitas gotículas vazias é um sinal de que não havia suficiente ampliáveis modelo na reação.
    2. Identifica as gotas outlier usando (REMOVE_OUTLIERS). Use TOP_PERCENT (padrão é p = 1%) para ajustar os % p de gotículas, tendo o valor mais alto de sinal em cada dimensão de sinal (FAM, VIC/HEX) fora de gotículas no prato inteiro. Use o CUTOFF_IQR (o padrão é 5) para ajustar o limite de outlier dos top % p de sinal mais alto.
    3. Identifica as gotas vazias usando (REMOVE_EMPTY). Use o CUTOFF_SD (o padrão é 7) para ajustar o desvio padrão da distribuição gaussiana (gotículas vazio) inferior dos valores de sonda 1.
    4. Gotículas de portão usando (classificar). Use o CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (o padrão é 3) para ajustar o desvio padrão da distribuição gaussiana (enchido gotículas) maior dos valores 1 sonda. Use o ADJUST_BW_MIN (o padrão é 4) e ADJUST_BW_MAX (o padrão é 20) para ajustar os parâmetros k_min e k_max para estimar a densidade do kernel da sonda 2 valores e discriminar o MUT e a nuvem WT de gotículas.
      1. Use SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (padrão é p = 1%) e SIGNIFICANT_P_VALUE (o padrão é o nível de significância s=0.01%) para classificar os poços como mutante ou sua.
        Nota: Este algoritmo, um mutante bem é definido como tendo um MAF estatisticamente significativamente maior do que p %.
  2. Análise automatizada
    Nota: Para cada parâmetro apresentado nesta seção, os autores do pacote ddPCR R têm valores padrão proposto com base em seus conhecimentos e seus dados. No entanto, todos os parâmetros podem ser modificados para aumentar a qualidade da análise (Figura 3).
    1. Identifica a falha de poços.
      1. Use quatro métricas de controle de qualidade (configurações: REMOVE_FAILURES) para identificar a falha de poços; o primeiro é o número mínimo de gotículas que deve conter um poço. Os outros três centrar-se na identificação de populações de candidato válido para vazio, possivelmente FAM + e HEX + / VIC + gotículas. Remova os poços que não cumprem esses critérios de análise a jusante.
    2. Identifica as gotas de outlier.
      1. Para evitar a inclinação para retenção de gotículas, remover valores atípicos (i.e., as gotas com um valor HEX/VIC ou FAM anormalmente elevada) de posterior análise definindo um limite de limite superior (configurações: REMOVE_OUTLIERS).
    3. Identifica as gotas vazias.
      1. Identificar as gotas vazias para reduzir a dimensão dos dados (em um poço típico, eles serão responsáveis pela maior parte as gotas) e eliminar o viés estatístico, devido à presença de uma grande parcela de informações inúteis como gotículas contendo apenas modelo permanecem ( configurações: REMOVE_EMPTY).
    4. Realize a retenção de gotículas.
      1. Classificar as gotas restantes como mutante, sua ou chuva (configurações: classificar).
    5. Identifica as gotas de chuva.
      1. Como as gotas de chuva resultam de amplificação ineficiente, excluir do FAM + ou HEX + / VIC + nuvens. Determinar as fronteiras de seus clusters usando seus valores de sonda 1 (definição: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
    6. Identifica mutante contra gotículas de tipo selvagem.
      1. Como o destaque da análise é a discriminação entre modelos mutante e sua, identifica todas as gotas restantes nesta fase como um ou o outro. Desde que têm valores semelhantes de sonda 1, usar sonda 2 valores para melhor prever sua respectiva natureza (configurações: ADJUST_BW_MIN e ADJUST_BW_MAX).
    7. Classifica poços como mutante versus o tipo selvagem.
      1. Depois de determinar quais as gotas são MUT e WT, calcule a MAF. Usando a frequência de mutação e o p-valor associado de cada poço, é possível classificá-las (configurações: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) como WT (contendo principalmente as gotas WT) ou poços MUT (contendo um número estatisticamente significativo de MUT gotas).
  3. Explorar e exportar os dados
    1. Explorar e exportar os dados como número de gotículas, outliers, gotículas vazias, concentrações ou gráficos que podem ser ainda mais personalizados para representação ideal.

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Resultados

Em um estudo de prova de conceito, KRAS exon 2 mutações (códons 12 e 13) e EGFR exon 19 exclusões foram investigadas em FFPE tecidos e amostras de plasma de pacientes com câncer usando o declive ddPCR estratégia6.

A sonda de entrega KRAS interrogado uma região bp 16, englobando várias mutações no exon 2 do gene KRAS , que abrigam mais de 95% das mutações conhecidas ...

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Discussão

Para projetar um ensaio de ddPCR de entrega eficiente, otimização é crucial, e o protocolo deve ser seguido cuidadosamente. Cada combinação de primers e sondas tem uma eficiência de reação de PCR exclusiva. Assim, um ensaio individual tem de ser cuidadosamente validado em amostras de controle antes de serem utilizados em amostras de teste valioso. Otimização e validação são importantes para a detecção do sinal de pico de certificar e avaliar a sensibilidade e especificidade. Conforme descrito no protocolo, todas as mutaç...

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Divulgações

Vários autores são nomeados os inventores de duas patentes (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados à detecção de ctDNA.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Os autores também desejam agradecer Caroline Hego por sua contribuição ao vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo K2EDTA (código de cores: lavanda)Os tubos BD367863EDTA são usados para obter uma amostra de sangue total ou plasma EDTA
Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual)Qiagen55114Para isolamento de DNA circulante de plasma humano
Kit de DNA circulante QIAsymphony DSP (protocolo automatizado)Qiagen937556Para isolamento de DNA circulante de plasma humano
Sistema QIAsymphony SPQiagen9001297sistema totalmente integrado e automatizado para purificação de cfDNA, DNA ou RNA
QIAvac 24 PlusQiagen19413Para purificação de até 24 cfDNAs simultaneamente
Fluorômetro QubitInvitrogenQ33226O fluorômetro Qubit é um fluorômetro de bancada para a quantificação do leitor de DNA
QX100 ou QX200Bio-Rad186-3003 ou 186-4003, respectivamenteO leitor mede a intensidade de fluorescência de cada gota e detecta o tamanho e a forma à medida que as gotículas passam pelo detector
Gerador de gotículas QX100 ou QX200Bio-Rad186-3002 ou 186-4002, respectivamenteInstrumento usado para geração de gotículas
C1000 termocicladorBio-Rad1851196Plataforma modular de termociclador, inclui chassi de termociclador C1000 Touch, módulo de reação rápida de 96 poços
Seladora de placasBio-Rad181-4000PX1™ Seladora de placas PCR
Porta-cartuchos DG8Bio-Rad186-3051Posiciona e segura o cartucho DG8 no instrumento para geração de gotículas
Cartuchos e juntas geradoras de gotículasBio-Rad186-4007Cartucho microfluídico DG8 usado para misturar amostra e óleo para gerar gotículas; As juntas DG8 vedam o cartucho para evitar a evaporação e aplicam a pressão necessária para a formação de gotículas
Supermix de PCRBio-Rad186-3010supermix de PCR ddPCR para sondas (sem dUTP)
Placas de PCR de 96 poçosEppendorf951020362Placas semi-contornadas de 96 poços
Vedação de folhaBio-Rad181-4040Selagem térmica de folha perfurável
ddPCR Óleo de leitor de gotículasBio-RadÓleo 186-3004usado na leitura
Óleo de geração de gotículas para sondasBio-Rad186-3005óleo para geração de gotículas
DNA loBind Tube 1,5 mLEppendorf0030 108.051Os tubos Eppendorf LoBind maximizam a recuperação da amostra, reduzindo significativamente a ligação da amostra à superfície
Conjunto padrão de referência Multiplex I cfDNA HORIZONHD780Os Padrões de Referência Multiplex I cfDNA são materiais de referência biologicamente relevantes e altamente caracterizados usados para avaliar o desempenho de ensaios de cfDNA que detectam mutações somáticas
KIT DE ENSAIO QUBIT DSDNA HS, 500Life TechnologiesQ32854O ensaio HS é altamente seletivo para DNA de fita dupla (dsDNA) sobre RNA e é projetado para ser preciso para concentrações iniciais de amostra de 10 pg/µ L a 100 ng/µ L
Tubos de Ensaio QubitLife TechnologiesQ32856Os tubos de ensaio Qubit são 500 µ L tubos de polipropileno de paredes finas para uso com o fluorômetro Qubit

Referências

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