Artigo de método

Imagem de tomografia computadorizada multimodal bioluminescentes e emissão positrônica Tomography/computacional de mieloma múltiplo Xenografts de medula óssea em camundongos NOG

DOI:

10.3791/58056

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7 de janeiro de 2019

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1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

Neste artigo

Resumo

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Aqui usamos bioluminescentes, raio-x e positron-emissão calculado a tomografia computadorizada/tomografia computadorizada de imagem para estudar a atividade como a inibição de mTOR impactos tumores de medula óssea-incorporada do mieloma múltiplo em um modelo de transplante. Isto permite análises fisiologicamente relevantes, não-invasivo e multimodais do efeito antimieloma de terapias direcionamento incorporada a medula óssea mieloma tumores na vivo.

Resumo

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Mieloma múltiplo (MM) tumores engraft na medula óssea (BM) e sua sobrevivência e progressão dependem de complexas interações moleculares e celulares que existem dentro este microambiente. Ainda o microambiente BM não pode ser facilmente replicado em vitro, que potencialmente limita a relevância fisiológica de muitos modelos experimentais in vitro e ex vivo . Esses problemas podem ser superados utilizando um modelo de enxerto heterólogo em qual luciferase (LUC)-células transfectadas de 8226 MM serão especificamente engraft do esqueleto de rato. Quando esses ratos são dadas o substrato apropriado, D-luciferina, os efeitos da terapia no crescimento do tumor e sobrevivência podem ser analisados medindo as alterações nas imagens bioluminescentes (BLI) produzido pela tumores em vivo. Este dados BLI combinado com análise de tomografia computadorizada (PET/CT) tomografia de emissão positrônica/computacional usando o marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glicose (18F-FDG) é usado para monitorar as alterações no metabolismo do tumor ao longo do tempo. Essas plataformas de imagem permitem várias medições não-invasivas dentro o microambiente do tumor/BM.

Introdução

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MM é uma doença incurável, composta de plasma maligno B-células que se infiltrar o BM e causar a destruição óssea, anemia, disfunção renal e infecção. MM faz acima de 10% - 15% de todas as malignidades hematológicas1 e é o câncer mais frequente que envolvem o esqueleto2. O desenvolvimento de MM decorre a transformação oncogênica de plasmócitos long-lived estabelecidas nos centros germinativos dos tecidos linfoides antes eventualmente de orientação para o BM3. O BM é caracterizado por nichos altamente heterogêneos; incluindo diversos e críticos componentes celulares, regiões de baixa pO2 (hipóxia), extensa vascularização, matrizes extracelulares complexas e redes de citocinas e fator de crescimento, os quais contribuem para MM tumorgenesis4. Assim, o desenvolvimento de um modelo de enxerto heterólogo MM disseminado caracterizado por tumores que são estritamente incorporados no BM seria uma ferramenta muito poderosa e clinicamente relevante para estudar MM patologia na vivo5,6. No entanto, numerosos obstáculos técnicos podem limitar a eficácia da maioria dos modelos de enxerto heterólogo, tornando-os caros e difíceis de aplicar. Isso inclui problemas associados com a enxertia de tumor consistentes e reprodutíveis dentro do nicho de BM, um tempo prolongado para o desenvolvimento do tumor e limitações na capacidade diretamente observar e medir as alterações de crescimento/sobrevivência de tumor sem a necessidade de sacrifica os ratos durante o curso do experimento7,8.

Este protocolo usa um modelo de xenoenxertos modificado que foi inicialmente desenvolvido por Miyakawa et al 9, em que um desafio (IV) por via venosa com pilhas do myeloma resulta em "disseminada" tumores que consistentemente e reproducibly engraft no BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratos10. A visualização em situ destes tumores é conseguida pelo transfection estável de 8226 humana MM linhagem celular com um alelo LUC e serialmente, medir as mudanças no BLI produzido por estas células de tumor engrafted6. Importante, este modelo pode ser expandido para utilizar vários outras LUC-expressando humano MM linhas celulares (por exemplo, U266 e OPM2) com uma propensão similar ao engraft especificamente no esqueleto de ratos NOG. A identificação dos tumores por bioluminescente imagem dos ratos é seguida por medir a absorção de sondas radiofarmacêuticos (como 18F-FDG) por PET/CT. juntos, isto permite a caracterização adicional de crítica bioquímico vias (ou seja, alterações no metabolismo, alterações em hipóxia e a indução de apoptose) dentro o microambiente do tumor/BM. Principais pontos positivos deste modelo podem ser realçados pela disponibilidade de uma vasta gama de sondas radiolabeled, bioluminescentes e fluorescentes e marcadores que podem ser usados para estudar a progressão de MM e patologia em vivo.

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Protocolo

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Todos os animais procedimentos descritos a seguir foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do sistema de saúde de VA maior Los Angeles e foram realizados sob condições estéreis e isentos de agentes patogénicos.

1. preparação de Luciferase-expressando 8226 células (8226-LUC)

  1. Manter a linha de celular humana MM, 8226, em RPMI-1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 95% ar e 5% de dióxido de carbono (CO2).
  2. Gerar células de repórter 8226 LUC-expressando estáveis por transfecting 1 x 106 8226 células com um vetor de repórter do luciferase seguido por uma seleção com hptII (100-350 mg/mL), como anteriormente descrito6.
  3. Manter as células em padrão cultivo condições estéreis para 2-3 semanas, alterando o meio todos os dias, até o estabelecimento de uma linhagem de células de 8226 estàvel transfectadas foi gerado.
  4. Confirmar a atividade no vitro luciferase em 1 x 106 transfectadas células/100 µ l de soro de tampão fosfato (PBS), adicionando o substrato de luciferase, D-luciferina (150 µ g/mL solução de trabalho em meio de cultura escaldada) e medindo a bioluminescência das células em um tubo de ensaio ou placa de 96 poços, usando um luminómetro6.

2. modelo de transplante ortotópico

  1. Manter os ratos NOG (4-6 semanas velhos, machos ou fêmeas) sob condições estéreis/isentos de agentes patogénicos em instalações de cuidados de animais adequados.
  2. Prepare as 8226 células transfectadas-LUC para injeção IV em camundongos o NOG (~ 5 x 106 células/rato) no dia do experimento. Lavar as células 3 x em PBS gelado, contá-los e eles Resuspenda em PBS gelado (menos antibióticos e FBS) em uma concentração final de 5 x 106 células/200 µ l de PBS) em um tubo de ensaio estéril. Manter as células no gelo e desafiar os ratos logo que possível (dentro de 30 a 120 min).
  3. Anestesiar o mouse (com isoflurano, 1-3% no ar em 0,5 - 1 L/min) e colocar o animal na posição supina sobre uma almofada de aquecimento com a cabeça virada para fora. Verificar o nível de anesthetization por beliscar o dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica nos olhos.
  4. Injete as células 8226-LUC em ratos através da veia da cauda (200 µ l/injeção) usando uma seringa de insulina 1 mL e uma agulha de 26-G.
    Nota: Uma lâmpada de calor pode ser usada para aquecer a cauda, assim, dilatando a veia e aumentar a eficácia das injeções.
  5. Retorno do animal para sua gaiola em casa e monitorar os animais até que eles se recuperaram totalmente.
  6. Confirme a enxertia das células 8226-LUC do esqueleto de rato medindo o BLI em ratos anestesiados (descrito a seguir e mostrado na figura 1A).
    Nota: Exsudados BM também podem ser manchados para expressão de CD45 humana usando citometria de fluxo (figura 1B) ou pela imuno-histoquímica do osso colhido (Figura 1).

3. medição do BLI na Vivo

Nota: Normalmente, BLI mensurável de engrafted tumores em ratos pode ser observado primeiro entre 10-20 dias postchallenge, mas isto pode precisar de ser determinado experimentalmente.

  1. Anestesiar o mouse (com isoflurano, 1-3% no ar em 0,5 - 1 L/min) e verificar o nível de anesthetization por beliscar o dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica de seus olhos.
  2. Dar ao animal uma injeção de IP (200 µ l/injeção) de "na vivo-grau" substrato luciferina-D (30 mg/mL diluída em solução salina estéril).
  3. Medir a BLI dentro de 5-10 min, após a injeção do substrato luciferina (embora a atividade BLI pode ser observável nos ratos para até 45-60 min.), colocando o animal anestesiado em posição supina em um sistema de imagem pequeno-animal (Figura 2 ). Selecione luminescentes e análise de raios-x e adquirir imagens (Figura 3).
    1. Medir o brilho médio (/steradian de fótons/s/cm2) em regiões selecionadas de interesse (ROIs) usando o software de imagem (Figura 4).
    2. Retorno do animal para sua gaiola em casa e monitorá-lo até que tenha totalmente recuperada (aproximadamente 15-20 min).

4. tratamento dos ratos com terapia-alvo

  1. Medir a linha de base BLI e randomizar os animais em grupos de tratamento (4-8 ratos/grupo).
  2. Trate os ratos com uma injeção de IP (200 µ l/injeção) de Torisel (0.2 - 40 mg/kg do mouse), utilizando um regime de cinco injeções diárias de IP seguido por 2 dias de descanso e um adicional cinco de injeções diárias11.
  3. Medir a atividade do luciferase (/steradian de fótons/s/cm2) 2x por semana, conforme descrito na seção 3 e enredo a mudança do BLI ao longo do tempo. Mudanças no tumor BLI pode ser apresentado como seriais imagens dos ratos (Figura 5B).
    Nota: É recomendável que o acompanhamento diário dos animais ser executada até que eles apresentam os seguintes sintomas (normalmente dentro de 45-60 dias do desafio inicial): peso (perda de mais de 10% em relação ao peso antes da implantação) e/ou posteriores paralisia dos membros, momento em que eles deveriam ser sacrificados, utilizando uma câmara de2 CO seguida por deslocamento cervical.

5. PET/CT análise usando 18F-FDG para medida alterações no metabolismo do Tumor

  1. Rapidamente os animais em sua gaiola casa removendo seus alimentos durante 24 h antes do experimento para evitar excesso absorção inespecífica de 18F-FDG.
  2. Prepare-se 18sondas F-radiolabeled FDG PET (50-100 µCi/injeção de solução salina estéril) no dia do experimento. Registra o tempo e atividade da sonda 18F-FDG com um calibrador de dose.
    Nota: Porque 18F tem uma meia-vida relativamente curta (~ 2 h), uma cuidadosa preparação e planejamento para o uso de tais sondas devem ser estabelecidos.
  3. Anestesiar o animal (com isoflurano, 1-3% no ar em 0,5 - 1 L/min) e colocá-lo na posição supina sobre uma almofada de aquecimento com a cabeça virada para fora. Verificar o nível de anesthetization por beliscar o dedo do pé. Aplica a pomada oftálmica de seus olhos.
  4. Injete a sonda através da veia de cauda (100 µ l/injeção) usando uma seringa de insulina de 1ml blindado e uma agulha de 26-G.
    Nota: Uma lâmpada de calor pode ser usada para aquecer a cauda, assim, dilatando a veia e aumentar a eficácia das injeções.
  5. Medir a radioatividade residual na agulha/seringa em um calibrador de dose e observe a atividade e o tempo.
    Nota: A padronização de incubação de rato, dosagem e tempo é essencial para assegurar a comparabilidade e reprodutibilidade de dados.
  6. Manter os ratos sob anestesia e a 37 ° C, usando uma almofada de aquecimento durante todo o período de captação de ponta de prova (~ 45-90 min).
    Nota: É importante que os ratos permanecem quiescente e a 37 ° C para evitar a absorção específico da sonda.
  7. Escalone as injeções da sonda 18F-FDG para ocorrer em intervalos de aproximadamente 20 - 30 min para garantir tempos de rotulagem similares nos ratos.
    Nota: Fluxo de trabalho adequado e sincronismo das injeções sonda irá resultar em condições de imagem ideais e reprodutíveis.
  8. Medir a atividade de 18F-FDG em um PET/CT animal pequeno sistema de imageamento em regiões selecionadas de interesse que correspondem os tumores engrafted (Figura 6).
    Nota: Inicialmente, recomenda-se uma exposição de PET estática de 10 min e uma exposição de CT 2-min, mas os tempos de exposição exata podem necessita de ser determinado experimentalmente.
  9. Devolver os animais de suas gaiolas para casa e monitorá-los até que se recuperou totalmente. Os ratos em uma sala de retorno dedicado para 24h enquanto os decaimentos de sonda para níveis de plano de fundo da casa.
    Nota: Devido a curta meia-vida de 18F, várias medições usando uma sonda fresca podem ser feitas tão frequentemente quanto 2x por semana.

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Resultados

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Em estudos-piloto iniciais, injeções IV de células 8226-LUC em camundongos NOD/SCID não desenvolveu tumores BM-engrafted MM, embora escamosas MM tumores foram facilmente formaram (100% de sucesso). Em contraste, os desafios IV com 8226 células em camundongos NOG gerado (dentro de 15-25 dias) tumores no esqueleto (e só raramente formados tumores no tecido não-esquelético, tais como o fígado ou baço). Já tumores do esqueleto não podem ser confirmados visualmente examinando fisicamente os an...

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Discussão

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Apesar de uma variedade de modelos pré-clínicos xenoenxertos de MM6,9,11,12,13, a capacidade de estudar as interações de tumor/BM dentro do microambiente BM continua a ser difícil 14. as técnicas descritas aqui permitem a rápida e reprodutível enxertia das células de tumores 8226-LUC no esqueleto de ratos NOG.

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Divulgações

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O autor Kevin Francis é um empregado da Perkin-Elmer.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por um mérito VA grant1I01BX001532 dos Estados Unidos Departamento de veteranos dos assuntos laboratório pesquisa biomédica e serviço de desenvolvimento (aves) de P.F. e E.C. reconhece apoio do (VA clínica ciência R & D serviço I01CX001388 prêmio de mérito) e reabilitação VA R & D serviço (Merit Award I01RX002604). Maior apoio veio de um subsídio de sementes da faculdade UCLA para J.K. Estes conteúdos não representam necessariamente as opiniões nos departamento de assuntos de veteranos ou o governo dos EUA.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
8226 linha celular de mieloma humanoATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Camundongos (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Substrato de luciferinaPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPLHP1-100
PE-CD45 (clone H130)BD Biosciences555483Usado para citometria de fluxo para identificar células tumorais CD45+ humanas em BM exsudato
coelho anti-CD45 humano (clone D3F8Q)Sinalização celular Tecnologia70527Anticorpo primário usado para imuno-histoquímica de osso excisado
Cabra Anti-coelho IgG (HRP conjugado)ABCAMab205718Anticorpo Seconday usado para imuno-histoquímica de osso excisado Sistema de
ensaio de repórter de LuciferaseDupla PromegaE1910
pGL4.5 Luciferase Reporter VectorPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS em Sistema de imagem VivoPerkin Elmer
Sofie G8 Sistema de imagem PET/CTPerkin Elmer

Referências

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