Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e caracterizar a estrutura, potência olfativa e resposta comportamental de compostos putativos feromônio de lampreias do mar.
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Artigo de método
A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento
Neste artigo
Resumo
Resumo
Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem iterativa que usa os resultados de bioensaios fisiológicos e comportamentais para guiar o isolamento e a identificação de um composto ativo do pheromone. Esse método resultou na caracterização bem sucedida dos sinais químicos que funcionam como pheromones em uma grande variedade de espécies animais. Lampreias do mar dependem de olfato para detectar feromônios que medeiam respostas comportamentais ou fisiológicas. Nós usamos este conhecimento da biologia de peixes para postular funções de feromônios putativos e guiar o isolamento e a identificação dos componentes do feromônio ativo. Cromatografia é usada para extrair, concentrar e separar compostos da água condicionada. Electro-olfactogram (EOG) gravações são conduzidas para determinar quais frações eliciam respostas olfativas. Ensaios comportamentais labirinto 2-escolha são usados para determinar se qualquer uma das frações odoríferas também são comportamentalmente ativo e induzir uma preferência. Métodos de espectroscopia e espectrometria fornecem a informações estruturais para ajudar com a elucidação da estrutura e peso molecular. A bioatividade dos compostos puros é confirmada com EOG e ensaios comportamentais. As respostas comportamentais observadas no labirinto, em última análise devem ser validadas em um cenário de campo para confirmar sua função em um cenário de fluxo natural. Estes bioensaios desempenham um papel duplo para 1) orientar o processo de fracionamento e 2) confirmar e definir mais a bioatividade dos componentes isolados. Aqui, nós relatamos os resultados representativos de uma identificação de feromônio de lampreia do mar que exemplificam a utilidade da abordagem orientada por bioensaio de fracionamento. A identificação das feromonas de lampreia do mar é particularmente importante porque uma modulação do seu sistema de comunicação de feromônio está entre as opções consideradas para controlar a lampreia invasiva em grandes lagos Laurentian. Esse método pode ser facilmente adaptado para caracterizar a comunicação química em uma ampla gama de táxons e lançar luz sobre ecologia química transmitidas pela água.
Introdução
Os Pheromones são sinais químicos específicos lançados por indivíduos que ajudam-los em localizar fontes de alimentos, detecção de predadores e mediando as interações sociais de coespecíficos1. Comunicação de feromônio de insetos tem sido bem estudados2; no entanto, a identificação química e função biológica de feromônios de vertebrados aquáticos não foram estudados como extensivamente. Conhecimento da identidade e função dos feromônios liberados podem ser aplicadas para facilitar a recuperação de espécies ameaçadas,3,4 ou controle de pragas espécie
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 e 02/17-031-00).
1. coleta e extração de lampreia condicionado água
- Lugar sexualmente maduras masculinas lampreias do mar (15-30 animais) em um tanque fornecido com 250 L de água de Lago Huron aerada 16-18 ° c, mantida
- Colete a água macho-condicionado ao longo de cada noite de junho a julho.
Nota: lampreias do mar morrer naturalmente após a desova. Se um peixe está chegando neste momento da sua vida, substituí-lo com um macho maduro fresco. - Extrai a água condicion....
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Resultados
Um diagrama Resumindo as etapas descritas no protocolo do fracionamento de bioensaio guiadas é mostrado na Figura 1. O protocolo envolve etapas para isolar e caracterizar a estrutura, a potência olfativa e a atividade comportamental de 5 putativo lampreia feromônios (Figura 2). Utilizando a espectrometria de massa e dados NMR (Figura 3 e Figura 4), as estruturas do petro.......
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Discussão
Peixes vivos num mundo químico cheio de compostos ainda não identificados. Fracionamento de bioensaio guiadas provou essencial para identificar e caracterizar moléculas bioativas que medeiam muitas interações químicas, tais como aqueles observados em masu salmão31elefantes asiáticos32e lampreias do mar33, 34,35. Fracionamento de bioensaio guiada é uma abordagem eficaz para rastrea.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a US Geological Survey Hammond Bay estação biológica para a utilização das suas instalações de pesquisa e o pessoal dos EUA peixe e serviço de vida selvagem e pesca e oceanos Canadá para fornecer lampreias do mar. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Comissão da pesca dos grandes lagos para Weiming Li e Ke Li.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Capilares de borossilicato de parede padrão premium com filamento | Warner Instruments | G150F-4 | eletrodo de gravação e referência (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm) |
| Instrumento extrator de pipetas | Narishige | PC-10 | puxa eletrodos para EOGs |
| Cortador de vidro com ponta de diamante | Ponta de corte genérica | de eletrodos para EOG | |
| Capilares de vidro borossilicato | Tubo de entrega de odorante | World Precision Instruments | 1B150-4 |
| Suporte de eletrodo de gravação Série E corpo reto com pellet Ag/AgCl para capilar de vidro OD 1.5 mm | de eletrodo de gravação | ESP-M15N | da Warner Instruments |
| Suporte de eletrodo de referência Série E com alça com Pellet Ag/AgCl para capilar de vidro OD 1,5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | suporte de eletrodo de referência |
| de 1 mm | Warner Instruments | WC1-10 | para ponte de referência e gravação de suportes de eletrodo |
| 2 mm | Warner Instruments | WC2-5 | para ponte de referência e gravação de eletrodos |
| Ágar | Sigma | A1296 | ágar fundido para encher eletrodos |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl para encher eléctrodos e porta-eléctrodos |
| Micropipeta microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | para encher eléctrodos e porta-eléctrodos |
| L-Arginina | Sigma | A5006 | odorizante de controlo positivo para EOG |
| Metanol | Sigma | 34860 | |
| Banho-maria | feito à medida | /A | contém odores para EOG |
| éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anestésico |
| Trietiodeto de gallamina | Sigma | G8134-5G | EOG seringa paralítica |
| de 1 mL | BD Biosciences | 301025 | para administrar paralítico |
| Agulha subcutânea 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | para administrar paralítico |
| Grampo de rolo | World Precision Instrumentos | 14043-20 | ajustam a taxa de fluxo de anestésico na boca da lampreia |
| Cloreto de sódio (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | de V com solução salina a 0,9% |
| como estágio de amostra | N / A | feito sob medida | segura lampreia durante |
| a calha de plástico | N / A | feito sob medida | segura suporte de plástico em forma de V durante EOG |
| Lâminas de bisturi - # 11 | Ferramentas de Ciência Fina | 10011-00 | para dissecção EOG |
| Cabo de bisturi - #3 | Ferramentas de Ciência Fina | 10003-12 | para dissecção EOG |
| Pinça ultrafina reta | Ciência Fina | 11252-00 | para dissecção EOG, Pinça de #5SF Dumont |
| Pinça ultrafina curva | Ciência Fina | 11370-42 | para dissecção EOG, Tesoura |
| de Pesca Reta Moria MC40BFerramentas de Ciência Fina | 15003-08 | para dissecção EOG | |
| Estereomicroscópio | Zeiss | Discovery V8 | para dissecção EOG |
| Luz iluminadora | Zeiss | CL 1500 ECO | para dissecção EOG |
| Tubulação plástica | Genérico | para conectar a configuração EOG de recirculação e banhos-maria | |
| Tubulação de entrega de odorante | Personalizado | N/A | |
| In linha filtro e conjunto de juntas | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipuladores | Narishige | MM-3 | para posicionar eletrodos e tubo capilar de entrega de odor |
| Dispositivos de retenção magnética | Kanetec | MB-K | |
| Driver de válvula | Arduino | feito sob medida | para controlar a abertura da válvula para estimulação de odor |
| Válvula eletromagnética | Lee Empresa | LFAA1201618H | válvula para estimulação de odores |
| NeuroLog Amplificador AC/DC | Digitimer Ltd. | NL106 | para aumentar a amplitude do pré-amplificador NeuroLog DC de sinal elictrical |
| com headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | para aumentar a amplitude do sinal elictrical |
| Filtro passa-baixa de 60 Hz | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Computador Dell (OptiPlex 745) executando o software de aquisição de dados Axoscope | Molecular Devices LLC | AxoScope versão 10.4 | |
| Gaiola de Faraday | personalizada N | /A | Blindagem contra ruído eletromagnético |
| Labirinto de duas opções | Personalizado | /A | madeira compensada de grau marinho impermeabilizada coberta com forro de plástico |
| Bomba de lixo | Honda | WT30XK4A | enche labirinto com água do rio próximo |
| Bomba peristáltica com tubulação | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | para administrar odores no labirinto |
| Gerador inversor | Honda | EU1000i | alimenta bomba perstálgica |
| Gaiola de liberação | / A | feito sob medidausado para aclimatar lampreia no labirinto | |
| Malha | Genérico | usado para conter as dimensões do labirinto e minimizar a turbulência da água com rolos de malha | |
| Baldes (5 galões) | Genérico | para misturar odores | |
| Medidor de vazão | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | para medir a descarga |
| Resina XAD 7 HP Dow | chemical | 37380-43-1 | para extração de água condicionada |
| Metanol | Sigma | 34860 | para extração de água condicionada |
| Banho-maria | Yamato | BM 200 | para extração de água condicionada |
| Liofilizador | Labconco | CentriVap Concentrador | para extração de clorofórmio de água condicionada |
| Sigma | CX1050 | para isolamento de piscinas de frações | |
| Sílica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | para isolamento de piscinas de frações |
| Sílica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | para isolamento de piscinas de frações |
| Sílica pré-revestida placas de gel TLC | Sigma | 99571 | para isolamento de piscinas de frações |
| anisaldeído | Sigma | A88107 | para isolamento de piscinas de frações |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | para isolamento de piscinas de frações |
| Amberlite XAD 7 HP resina | Sigma | XAD7HP | para extração de água condicionada |
| 4, colunas de vidro da capacidade 2.5L | Ace Glass Inc. | 5820 | para extração de água condicionada |
| Acetona | Sigma | 650501 | para extração de água condicionada |
| Espectrômetro de massa TQ-S TOF LC (ou equivalente) | Waters Co. | N/A | para elucidação da estrutura |
| Bomba de HPLC binária | Waters Co. | 1525 | para isolamento de reservas/compostos de frações |
| Espectrômetro de RMN Agilent, 900MHz (ou equivalente) | Agilent | N/A | para elucidação da estrutura |
| Sistema de secagem Rotovap | Buchi | RII | para extração de água condicionada |
| Lâmpada UV (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | para cromatografia em camada fina |
Referências
- Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
- El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
- Zhu, J., et al.
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Reimpressões e permissões
